本发明涉及一种微型化三维宽视场层析成像装置，属于光学显微成像技术领域。
背景技术：
当前，光学显微成像已成为生物医学研究、临床疾病诊断、药物筛选等领域不可或缺的技术手段。然而，在诸多生物动态过程研究(如脑科学)中，为了免除麻醉、人为束缚等因素对生命动态过程观测的影响，通常需要在自由活动的模式动物(如小鼠、大鼠等)上进行光学显微成像。然而，现有的显微成像系统由于体积较大、质量较重而无法满足上述要求。
为此，人们发展了多种微型化显微成像系统，通过将微型化显微镜穿戴到模式动物身上，可实现自由活动下模式动物的在体原位观测。根据荧光信号的产生机理，可将现有技术分为基于单光子荧光的成像方法与基于双光子荧光的成像方法。但是，后者需要采用昂贵的飞秒激光器作为激发光源(一种自由移动小动物行为成像装置，专利授权号：zl201720296338.5)，且需要进行扫描成像，大大增加了系统成本，因此目前微型化显微成像系统大多采用基于单光子荧光成像的方案，这不仅可以大大降低系统成本，还可以避免将飞秒激光传导至微型化显微镜镜头的色散管理、脉冲畸变等问题。flusberg等利用传像光纤束传导激发光及荧光信号并在远端进行图像采集，观测了自由活动小鼠小脑的神经活动(doi：10.1038/nmeth.1256)，但是由于采用了传像光纤束进行图像传输，成像视场受限，横向分辨率也受光纤束像素化的限制。ghosh等通过将微型化相机内置到微型化显微系统，扩展了成像视场，在体观测了自由活动小鼠的脑组织血流流速等生物动态过程(doi:10.1088/1741-2552/aa6806)。遗憾的是，上述方案存在显著缺点：传统宽场单光子荧光成像的轴向非定域激发特性使得其不具有光学层析能力，进而无法对生物样本进行三维动态成像。
综上，如何实现微型化三维宽视场层析成像是显微成像领域亟需克服的技术难点。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种微型化三维宽视场层析成像装置，用于对自由活动小动物进行在体三维动态成像，具有体积小、重量轻、成本低等优点。
本发明提出的微型化三维宽视场层析成像装置，包括光源、数字微镜器件、中继系统(含凸透镜(i)、凸透镜(ii))、光纤束、微型收集透镜、微型反射镜、微型二向色镜、微型电调谐透镜、微型物镜、微型发射光滤波片、微型管透镜、微型相机和计算机。
所述的光源放置于数字微镜器件之前，用于照明数字微镜器件产生激发图案。数字微镜器件放置于中继系统中凸透镜(i)的前焦点处。中继系统中凸透镜(i)与凸透镜(ii)之间的距离设置为凸透镜(i)的焦距与凸透镜(ii)的焦距之和，用于对数字微型器件产生的激发光束进行中继及缩束。经过缩束后的光束被耦合到光纤束中；光纤束对耦合进入的激发光进行传导；从光纤束出射的激发光被微型收集透镜收集、准直后入射到微型反射镜上,并被微型反射镜反射进入激发光路中。激发光路中的微型二向色镜将激发光反射后，激发光依次进入微型电调谐透镜和微型物镜，其中微型电调谐透镜放置于微型物镜后瞳面的位置。最终，激发光束聚焦在模式动物成像窗口内部(依据数字微镜器件的调制图案，可在焦面处形成结构照明光及均匀照明光)；所激发得到荧光信号经微型化物镜反向收集，然后依次通过微型化电调谐透镜、微型化二向色镜、微型反射滤波片，并被微型化管透镜聚焦到微型化相机上；微型物镜与微型管透镜组成中继系统，即微型物镜与微型管透镜之间的距离设置为微型物镜焦距与微型管透镜焦距之和；所述的计算机对数字微镜器件进行调制，以产生结构照明光及均匀照明光；计算机通过信号线与微型化电调谐透镜相连，用于控制微型化电调谐透镜对模式动物进行轴向扫描；计算机通过信号线与微型化相机相连，对微型化相机的信号进行采集；所述的计算机对微型化相机采集的信号进行显示与分析，实现对自由活动下模式动物的宽视场三维动态成像。
本发明提出的微型化三维宽视场层析成像装置，其优点是：
1、本发明的微型化三维宽视场层析成像装置，可以实现模式动物(如小鼠、大鼠等)自由活动下的宽视场、三维动态成像。本成像装置与现有方法相比，具有层析能力，可对生物样本进行三维动态成像，因此具有广阔的生物医学应用前景。
2、本发明的微型化三维宽视场层析成像装置，可在模式动物(如小鼠、大鼠等)身上进行灵活装配及拆卸，相比于传统的宽视场荧光显微镜，体积和重量得到了极大地缩小。
3、本发明的微型化三维宽视场层析成像装置，与双光子微型荧光显微镜相比，不需要昂贵的飞秒激光器作为激发光源，也不需要横向扫描成像，极大地降低了设备成本。
4、本发明的微型化三维宽视场层析成像装置，与传统的宽视场微型荧光显微镜相比，通过结构光层析算法获得了轴向层析能力，通过微型电调谐透镜获得了轴向扫描能力，从而可以进行三维成像。
5、本发明的微型化三维宽视场层析成像装置，与使用光纤束传导荧光图像的装置相比，可直接用微型化相机对荧光图像进行采集，避免了光纤束像素化对横向分辨率的影响，提高了最后成像的分辨率。
附图说明
图1为本发明提出的微型化三维宽视场层析成像装置的结构示意图。
图1中，1是光源，2是数字微镜器件，3是凸透镜(i)，4是凸透镜(ii)，5是光纤束，6是微型收集透镜，7是微型反射镜，8是微型二向色镜，9是微型电调谐透镜，10是微型物镜，11是模式动物，12是微型发射光滤波片，13是微型管透镜，14是微型相机，15是计算机。
具体实施方式
本发明提出的微型化三维宽视场层析成像装置，其结构如图1所示，包括光源1、数字微镜器件2、凸透镜(i)3、凸透镜(ii)4、光纤束5、微型收集透镜6、微型反射镜7、微型二向色镜8、微型电调谐透镜9、微型物镜10、微型发射光滤波片12、微型管透镜13、微型相机14和计算机15；
所述的光源1放置于数字微镜器件2之前，用于照明数字微镜器件2产生激发图案。数字微镜器件2放置于中继系统中凸透镜(i)3的前焦点处。中继系统中凸透镜(i)3与凸透镜(i)4之间的距离设置为凸透镜(i)3的焦距与凸透镜(i)4的焦距之和，用于对数字微型器件2产生的激发光束进行中继及缩束。经过缩束后的光束被耦合到光纤束5中；光纤束5对耦合进入的激发光进行传导；从光纤束出射的激发光被微型收集透镜6收集、准直后入射到微型反射镜7上,并被微型反射镜7反射进入激发光路中。激发光路中的微型二向色镜8将激发光反射后，激发光依次进入微型电调谐透镜9和微型物镜10，其中微型电调谐透镜9放置于微型物镜10后瞳面的位置。最终，激发光束聚焦在模式动物11的成像窗口内部(依据数字微镜器件2的调制图案，可在焦面处形成结构照明光及均匀照明光)；所激发得到荧光信号经微型化物镜10反向收集，然后依次通过微型化电调谐透镜9、微型化二向色镜8、微型反射滤波片12，并被微型化管透镜13聚焦到微型化相机14上；微型物镜10与微型管透镜13组成中继系统，即微型物镜10与微型管透镜13之间的距离设置为微型物镜10焦距与微型管透镜13焦距之和；所述的计算机15对数字微镜器件2进行调制，以产生结构照明光及均匀照明光；计算机15通过信号线与微型化电调谐透镜9相连，用于控制微型化电调谐透镜9对模式动物进行轴向扫描；计算机15通过信号线与微型化相机14相连，对微型化相机14的信号进行采集；所述的计算机15对微型化相机14采集的信号进行显示与分析，实现对自由活动下模式动物11的宽视场三维动态成像。
本发明提出的微型化三维宽视场层析成像装置，可以用于对自由活动的小动物(例如小鼠)进行成像。由于活体生物样本的体积较小、重量较轻(如小鼠重量大约为25克)，本发明装置中所述的微型器件整体体积应当限定在1～5立方厘米内，整体重量应当限定在1～4克左右。所述的微型相机可使用赛德电子有限公司(3rdeyeelectronicsco.,limited)生产的mc900微型化cmos芯片完成，所述微型光学元件(包括微型收集透镜、微型反射镜、微型二向色镜、微型电调谐透镜、微型物镜、微型发射光滤波片、微型管透镜)可定制完成。所述的数字微镜器件可以采用德州仪器公司(texasinstruments)所生产的dlp9500完成。
以下结合附图，详细介绍本发明提出的微型化三维宽视场层析成像装置的工作原理和工作过程：
1、在数字微镜器件2上分别加载结构图案和平面图案，利用光源1照射加载图案后的数字微镜器件2，产生结构光和均匀光；
2、利用由凸透镜(i)3与凸透镜(ii)4构成的光束整形系统，对数字微镜器件产生的结构光和均匀光进行缩束，以便耦合进光纤束5中。
3、利用光纤束5将缩束后的结构光或均匀光传导进入微型化探头中。微型化探头中包括本发明装置中的微型化收集透镜、微型化反射镜、微型化二向色镜、微型化电调谐透镜、微型化物镜、微型化发射光滤波片、微型化管透镜、微型化相机。
4、通过微型化探头中的光学元件将数字微镜器件2产生的结构照明光及其均匀照明光中继到模式动物11成像窗口内，激发出荧光信号。
5、模式动物11成像窗口内被激发的荧光信号被微型物镜10反向收集，并直接被微型管透镜13聚焦到微型化相机14上，具体过程为：在数字微镜器件2上加载均匀光图案，收集在均匀光照明下的均匀光照明图像
6、利用结构光层析算法，将微型化相机收集到的宽视场结构光激发图像和宽视场均匀光激发图像进行计算得到宽视场光学层析图像，具体过程为：
(6-1)对宽视场均匀光照明的图像
(6-2)提取宽视场结构光照明图像
其中，σ表示求取图像方差；
(6-3)对结构光对比度调制后的均匀图像施加一个低通滤波器lp，获取焦平面内的低频信息：
(6-4)通过对获取的高频信息和低频信息进行组合，获取模式动物11成像窗口内的宽视场光学层析图像：
其中，η为保证低频信息与高频信息强度连续的因子，实际操作当中，可以依据激发及其探测psf的先验信息来对η进行估计。
(7)计算机14控制微型化电调谐透镜9对活体小动物进行轴向扫描，激发并获取活体小动物的不同轴向位置处的图像信息。
(8)根据上述步骤(6)和步骤(7)获取到的信息，进行三维重建，获得活体小动物在自由活动模式下的宽视场动态三维显微图像。
本发明微型化三维宽视场层析成像装置中照明光源1可选择相干光源(如激光)或非相干光源(如发光二极管)。选用相干光源时，物镜焦点处会产生一个三维的结构照明光，因此进行轴向扫描时只需要改变成像面的轴向位置，此时电调谐透镜可只放置于成像光路中，也可放置于物镜后瞳面。选用非相干光源时，在物镜焦点处产生的为二维结构照明光，此时轴向成像时需要同步二维结构光和成像面的轴向位置，因此电调透镜应放置在物镜的后瞳面。
本发明装置中，光束中继系统由两个焦距不同的凸透镜组成，其中两个透镜为4f关系，可实现光束中继及缩束。该光束中继系统的放大率为：
其中m为系统放大率，f2为凸透镜(ii)4的焦距，f1为凸透镜(i)3的焦距。
微型化三维宽视场成像装置包括一个激发光传导光纤束。光纤束应当足够长，且应较为柔软，以减少对模式动物自由活动的影响，方便长时间连续观测。
本发明成像装置中的微型化收集透镜、微型化反射镜、微型化二向色镜、微型化电调谐透镜、微型化物镜、微型化发射光滤波片、微型化管透镜和微型化相机集成为一个微型化探头。微型化探头可采用可拆卸结构，不观察时可从模式动物身上拆卸。微型化探头中，所述的微型化管透镜与微型化相机之间设置有距离调节装置，用于调节微型化管透镜与微型化相机之间的距离。微型化相机可采用抗干扰的稳定式双绞线作为数据传输线，或采用蓝牙、无线网模块进行无线传输。
1.一种微型化三维宽视场层析成像装置，其特征在于包括光源、数字微镜器件、凸透镜i、凸透镜ii、光纤束、微型收集透镜、微型反射镜、微型二向色镜、微型电调谐透镜、微型物镜、微型发射光滤波片、微型管透镜、微型相机和计算机；
所述的光源放置于数字微镜器件之前，用于照明数字微镜器件产生激发图案。数字微镜器件放置于中继系统中凸透镜i的前焦点处，中继系统中凸透镜i与凸透镜ii之间的距离设置为凸透镜i的焦距与凸透镜ii的焦距之和，用于对数字微型器件产生的激发光束进行中继及缩束；经过缩束后的光束被耦合到光纤束中；光纤束对耦合进入的激发光进行传导；从光纤束出射的激发光被微型收集透镜收集、准直后入射到微型反射镜上,并被微型反射镜反射进入激发光路中；激发光路中的微型二向色镜将激发光反射后，激发光依次进入微型电调谐透镜和微型物镜，其中微型电调谐透镜放置于微型物镜后瞳面的位置。最终，激发光束聚焦在模式动物成像窗口内部；所激发得到荧光信号经微型化物镜反向收集，然后依次通过微型化电调谐透镜、微型化二向色镜、微型反射滤波片，并被微型化管透镜聚焦到微型化相机上；微型物镜与微型管透镜组成中继系统，即微型物镜与微型管透镜之间的距离设置为微型物镜焦距与微型管透镜焦距之和；所述的计算机对数字微镜器件进行调制，以产生结构照明光及均匀照明光；计算机通过信号线与微型化电调谐透镜相连，用于控制微型化电调谐透镜对模式动物进行轴向扫描；计算机通过信号线与微型化相机相连，对微型化相机的信号进行采集；所述的计算机对微型化相机采集的信号进行显示与分析，实现对自由活动下模式动物的宽视场三维动态成像。
技术总结