1.本发明属于土壤功能微生物筛选分离技术领域，特别涉及一种基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法。
背景技术：2.石油烃对环境产生的污染是行业关注的焦点问题，生物法因节约能源、运行费用低、作用持久等特点，具有广阔的应用前景。生物法中，一般是利用石油烃降解功能菌降解处理石油烃污染物。
3.现有技术中，石油烃降解功能菌均采用传统压力法筛选，由于对目的微生物所栖息的自然环境缺乏深入理解，对微生物生长代谢过程中起关键作用的营养因子、不同生理阶段对基质浓度的需求、生长所需环境条件的变化规律等认识不足，导致在实验室条件下无法提供目的微生物生长所需的真实营养需求及培养条件。多数环境微生物在实验室培养条件下，因无法适应而进入一种“活的非可培养状态”即未培养微生物，90％以上的石油烃降解功能微生物无法通过传统筛选方法分离出来。而对于未培养微生物，无论是其物种类群，还是其新陈代谢途径、生理生化反应、代谢产物等方面，都存在着不同程度的新颖性和丰富的多样性，因而势必具有极大的增强生物法降解含油污泥石油烃效率的潜力。
4.例如，专利cn106701580a公开了一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法，将活性污泥混合液均分为两份，分别作为实验组和对照组原位培养；提取培养后活性污泥微生物的基因组dna；将dna样品与氯化铯溶液混合并进行超高速密度梯度离心；采用重力法在离心管的顶部匀速注水，在离心管底部接收流出的离心液，分离得到不同密度层级的dna溶液；用peg6000和乙醇溶液纯化各层级的dna样品；利用普通pcr技术、实时定量pcr技术和高通量测序技术测定分离后实验组中5-9层级dna样品，分析自养或异养微生物的群落特征，并与对照组进行比较。该方法仅进行了一次培养，未考虑到实际情况下微生物的生长规律。
5.因此，如何确保实验环境不改变目标土壤微生物的行为和能力，开发和利用未培养功能微生物，是推动含油污泥生物降解发展中亟待解决的问题。而传统压力筛选具有以下问题：
①
生长因子缺乏；
②
破坏了微生物之间的联系；
③
忽视了微生物之间的互作关系。
技术实现要素：6.为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，以通过原位培养筛选，尽可能多地分离出传统筛选方法难以培养的功能微生物。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
8.一种基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，包括：
9.步骤(1)，扩散室系统构建
10.扩散室由一个带中央通孔的金属环和紧贴在环两侧的pc顶膜和pc底膜构成；取无菌琼脂、土著菌悬液及石油混合后制成固体培养物，将pc底膜密封后向扩散室注入固体培养物，上部留2
±
0.5mm空隙，然后将pc顶膜封闭；取含油污泥，滴入灭菌纯水，制备土壤基质；将扩散室置于土壤基质中，底部嵌入，顶部露出，封闭完成后得到扩散室系统，所述扩散室系统构建多个，分别于20
±
3℃恒温培养观察；
11.步骤(2)，富集
12.培养21d后取出各扩散室，揭下pc底膜，于生理盐水中震荡形成菌悬液，然后与无菌琼脂及石油混合后制成新的固体培养物，按步骤(1)方法注入新的扩散室并置于土壤基质中，继续20
±
3℃恒温培养21d；如此循环数次；
13.步骤(3)，菌株分离
14.富集培养后对最后一次洗脱出的菌悬液进行梯度稀释，将连续稀释的上清液涂布到含有石油的lb琼脂平板上，能够以石油烃为碳源生长的微生物聚集生长出肉眼可见菌斑，采用无菌棒挑取分离出石油烃降解菌。
15.在一个实施例中，所述步骤(1)土著菌悬液的制备方法如下：称取含油污泥5
±
0.5g，加入装有100
±
5ml无菌水的锥形瓶中，于35
±
3℃、120
±
10rpm的摇床中震荡培养24
±
1h，将得到的培养液静置1
±
0.1h后即为土著菌悬液。
16.在一个实施例中，所述固体培养物中，土著菌悬液的接种量为1
±
0.5ml/100mg，含油量为1
±
0.5％。
17.在一个实施例中，所述步骤(1)制备土壤基质时，含油污泥用量100
±
10g，过2-3mm筛网后，滴入50
±
5ml灭菌纯水。
18.在一个实施例中，所述步骤(2)，菌悬液的接种量与步骤(1)土著菌悬液的接种量一致，新的固体培养物中，含油量与步骤(1)的固体培养物4的含油量一致。
19.在一个实施例中，所述步骤(2)，循环4次。
20.在一个实施例中，所述步骤(3)，lb琼脂平板由如下步骤配置而成：取蛋白胨10
±
1g，nacl5
±
0.5g，0.1
±
0.05％石油储备液，另加1.5
±
0.5％琼脂，溶于1
±
0.05l去离子水后制成平板。
21.在一个实施例中，所述连续稀释，稀释至含菌量10-4-10-7
。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明利用扩散室系统原位培养筛选石油烃降解功能微生物，保留了传统压力筛选限定碳源的思路，土壤基质最大程度地模拟了功能微生物的原生环境，引入pc半透膜，避免了培养时的微生物竞争与污染。可筛选出传统压力筛选法未曾发现的、更能适应目的污染体系生长环境的、降解效率更高的功能微生物。对于原位培养筛选其他污染土壤降解功能微生物也有极大的参考价值。
附图说明
24.图1为培养方法流程图。
25.图2为扩散室系统示意图。
26.图3为本发明与传统方法筛选菌株降解速率对比。
27.图4为本发明与传统方法筛选菌株降解效果对比。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
29.本发明为一种含油污泥功能微生物的原位培养筛选方法，所谓原位培养筛选，是指在人工培养条件下，将微生物分散附着或包埋在特殊载体上，使微生物细胞的扩散受到限制，但代谢产物及信号分子可自由扩散而相互利用，然后尽量模拟原有的自然生态环境状态，保持微生物的群落特性，细胞之间的相互联系及与自然状态下相仿的生态位，以便尽可能多的分离出传统筛选方法难以培养的功能微生物。
30.本发明基于扩散室系统实现含油污泥功能微生物的原位培养筛选，包括扩散室系统构建、富集和菌株分离。将土著微生物分散附着在扩散室中，而后包埋于土壤基质中进行原位培养筛选，最大程度上保持微生物的群落特性、微生物之间的相互联系及与自然环境下相仿的生态位。使得筛选出的功能微生物能够更适应土壤环境，对提高含油污泥微生物降解效率有重要意义。
31.参考图1，本发明的步骤具体如下：
32.(1)扩散室系统构建
33.本发明的扩散室系统参考图2，包括金属环1、pc顶膜2、pc底膜3、固体培养物4以及土壤基质5。其中，金属环1带有中央通孔，pc顶膜2和pc底膜3分别紧贴在金属环1的顶底两侧，用于封闭该中央通孔，金属环1、pc顶膜2和pc底膜3构成了扩散室。固体培养物4置于该中央通孔内，整个扩散室则置于土壤基质5中，底部嵌入，顶部露出，封闭完成后即得扩散室系统。
34.在本发明中，扩散室系统构建多个，并分别于20
±
3℃恒温培养观察。
35.其中，固体培养物4由无菌琼脂、土著菌悬液及石油混合后制成，在pc底膜3密封后注入扩散室，上部留2
±
0.5mm空隙，然后将pc顶膜2封闭。
36.示例地，在固体培养物4中，土著菌悬液的接种量为1
±
0.5ml/100mg，含油量为1
±
0.5％。
37.进一步地，土著菌悬液的制备方法如下：称取含油污泥5
±
0.5g，加入装有100
±
10ml无菌水的锥形瓶中，于35
±
3℃、120
±
10rpm的摇床中震荡培养24
±
1h，将得到的培养液静置1
±
0.1h后即为土著菌悬液，在该土著菌悬液中，菌种来源来自于待修复体系。
38.示例地，在本发明的实施例中，土壤基质5通过如下方法配制：含油污泥用量100
±
10g，过2-3mm直径筛网后，滴入50
±
5ml灭菌纯水。得到的土壤基质5与待修复的污染土壤性质基本一致。
39.在本发明中，扩散室中仅有作为碳源的石油与含油污泥土著菌接种物，扩散室底部则与土壤基质5接触良好，其他生长因子、代谢产物及信号分子不受pc膜的限制自由扩散，最大程度模拟了目标微生物的原生环境。但细胞扩散却受到pc膜限制，形成屏障避免了扩散室内微生物不受基质中微生物影响。基于此，扩散室内形成了以石油为唯一碳源的石油烃降解功能微生物原位培养筛选系统。
40.(2)富集
41.培养21d后取出各扩散室，揭下pc底膜3，于生理盐水中震荡(一般2min左右即可)，形成菌悬液，取菌悬液替代步骤(1)的土著菌悬液，与无菌琼脂及石油混合后制成新的固体培养物，按步骤1方法注入新的扩散室并置于新的土壤基质5中，继续20
±
3℃恒温培养21d；
如此循环数次。
42.其中菌悬液的接种量与步骤(1)土著菌悬液的接种量一致，新的固体培养物中，含油量与步骤(1)的固体培养物4的含油量一致。
43.示例地，上述的循环数次，实际操作中可选择循环4次。
44.多个多次循环培养的扩散室系统保证了原位培养筛选出尽可能多的石油烃降解功能微生物。在已经原位筛选出石油烃降解功能微生物的基础上于降油培养基迅速富集。
45.(3)菌株分离
46.富集培养后对最后一次洗脱出的菌悬液进行梯度稀释。将连续稀释(10-4-10-7
)的上清液涂布到含有石油的lb琼脂平板上，能够以石油烃为碳源生长的微生物聚集生长出肉眼可见菌斑，采用无菌棒挑取分离出石油烃降解菌。
47.本发明中，lb琼脂平板由如下步骤配置而成：取蛋白胨10
±
1g，nacl5
±
0.5g，0.1
±
0.05％石油储备液，另加1.5
±
0.5％琼脂，溶于1
±
0.05l去离子水后制成平板。其中，石油储备液为石油类标准储备液，其比例是以琼脂平板体系体积为基数的体积百分比。
48.在本发明的一个具体实施例中，以姬塬油田含油污泥为例，配制土壤基质5时，含油污泥取100g，筛网直径为2mm，灭菌纯水用量50ml。配制固体培养物时，土著菌悬液接种量1ml/100mg，含油量1％，扩散室顶部留2mm空隙。扩散室嵌入土壤基质5中，共制备15套扩散室系统，分别20℃恒温培养观察21d。
49.在富集步骤中，于50m l生理盐水中震荡2min，循环4次。富集培养10～12d后(也即富集步骤所需的培养时间)，无菌条件下挑取肉眼可见菌落接种于含油lb琼脂平板进行平板划线分离，得到单一菌株。
50.在菌株分离步骤中，将筛选出的菌株及传统筛选方法筛选出的具有代表性的石油烃降解功能菌铜绿假单胞菌分别接种至目标含油污泥样品，接种量均为2.25
×
108cfu/g，在相同环境条件下降解20d。参考图3和图4，可以明显看出，本发明方法筛选出的功能微生物在降解速率及降解效果方面都有明显优势。
技术特征：1.一种基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，包括：步骤(1)，扩散室系统构建扩散室由一个带中央通孔的金属环(1)和紧贴在环两侧的pc顶膜(2)和pc底膜(3)构成；取无菌琼脂、土著菌悬液及石油混合后制成固体培养物(4)，将pc底膜(3)密封后向扩散室注入固体培养物(4)，上部留2
±
0.5mm空隙，然后将pc顶膜(2)封闭；取含油污泥，滴入灭菌纯水，制备土壤基质(5)；将扩散室置于土壤基质(5)中，底部嵌入，顶部露出，封闭完成后得到扩散室系统，所述扩散室系统构建多个，分别于20
±
3℃恒温培养观察；步骤(2)，富集培养21d后取出各扩散室，揭下pc底膜(3)，于生理盐水中震荡形成菌悬液，然后与无菌琼脂及石油混合后制成新的固体培养物，按步骤(1)方法注入新的扩散室并置于土壤基质(5)中，继续20
±
3℃恒温培养21d；如此循环数次；步骤(3)，菌株分离富集培养后对最后一次洗脱出的菌悬液进行梯度稀释，将连续稀释的上清液涂布到含有石油的lb琼脂平板上，能够以石油烃为碳源生长的微生物聚集生长出肉眼可见菌斑，采用无菌棒挑取分离出石油烃降解菌。2.根据权利要求1所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)土著菌悬液的制备方法如下：称取含油污泥5
±
0.5g，加入装有100
±
5ml无菌水的锥形瓶中，于35
±
3℃、120
±
10rpm的摇床中震荡培养24
±
1h，将得到的培养液静置1
±
0.1h后即为土著菌悬液。3.根据权利要求1或2所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述固体培养物(4)中，土著菌悬液的接种量为1
±
0.5ml/100mg，含油量为1
±
0.5％。4.根据权利要求1所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)制备土壤基质(5)时，含油污泥用量100
±
10g，过2-3mm筛网后，滴入50
±
5ml灭菌纯水。5.根据权利要求1所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)，菌悬液的接种量与步骤(1)土著菌悬液的接种量一致，新的固体培养物中，含油量与步骤(1)的固体培养物4的含油量一致。6.根据权利要求1所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)，循环4次。7.根据权利要求1所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)，lb琼脂平板由如下步骤配置而成：取蛋白胨10
±
1g，nacl5
±
0.5g，0.1
±
0.05％石油储备液，另加1.5
±
0.5％琼脂，溶于1
±
0.05l去离子水后制成平板。8.根据权利要求1所述基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，其特征在于，所述连续稀释，稀释至含菌量10-4-10-7
。
技术总结一种基于扩散室系统的含油污泥功能微生物原位培养筛选方法，包括扩散室系统构建、富集和菌株分离；扩散室由带中央通孔的金属环和紧贴在环两侧的PC顶膜和PC底膜构成；无菌琼脂、土著菌悬液及石油混合制成固体培养物，底膜密封后将其注入，上部留空隙，顶膜封闭；取含油污泥制备土壤基质；将扩散室置于土壤基质中，底部嵌入，顶部露出，封闭完成后得到扩散室系统，扩散室系统构建多个，分别恒温培养观察；培养后取出，于生理盐水中震荡形成菌悬液，然后与无菌琼脂及石油混合后制成新的固体培养物，注入新的扩散室并置于土壤基质中，继续恒温培养，循环数次，从最后一次洗脱出菌悬液中分离菌株，本发明可分离出传统方法难以培养的功能微生物。功能微生物。功能微生物。
技术研发人员：金鹏康 石烜 白雪 许路 金鑫
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：2022.10.12
技术公布日：2022/12/1
