本发明涉及水产品领域，尤其涉及一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂。
背景技术：
：鱼糜制品是我国淡水鱼加工的一个重要的方向，而凝胶劣化是当今影响鱼糜制品质量的主要因素之一。日本学者最早研究发现，鱼类肌肉组织中的肌原结合型丝氨酸蛋白酶(mbsp)是鱼糜制品在50-65℃下长时间加热而引起凝胶强度下降的主要原因。mbsp在一定的温度条件下可降解肌原纤维中的肌球蛋白重链，同时对α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白产生降解现象。由于mbsp广泛存在与鱼类肌肉组织中，鱼糜生产过程中经漂洗也无法去除，严重制约了鱼糜制品行业的发展。目前针对mbsp抑制的研究主要分两类：①针对mbsp所在丝氨酸蛋白酶家族的抑制：如卵清蛋白、动物血浆蛋白、马铃薯淀粉、豆类胰蛋白酶抑制剂等均能显著抑制丝氨酸蛋白酶活性，但由于其成本高、影响鱼糜制品颜色和风味，不利于人体消化吸收等缺陷限制了其在实际生产中的应用。②针对mbsp特异性抑制剂：此类抑制剂研究较少，主要是鱼体内的内源性葡萄糖-6-磷酸异构酶(gpi)对mbsp的抑制作用，这些gpi只对同类鱼的mbsp具有抑制作用，不具备广谱特异性。由于mbsp抑制剂的匮乏，现阶段鱼糜生产大都采用添加谷氨酰胺转氨(tg)酶的方式提高鱼糜制品的凝胶强度，但tg酶催化作用对加工条件要求较高，还需要添加非肌肉蛋白共同作用以提高效果，影响了鱼糜本身属性。因此研究开发安全、高效，可以在加工过程直接作用于mbsp的新型广谱特异性抑制剂，实现对鱼糜制品凝胶劣化的控制，对整个鱼糜制品产业的发展具有重要的推动作用。单域抗体(sdabs)是近年来通过基因工程技术，从骆驼科动物和软骨鱼类血清中克隆获得的仅保留重链可变区且具有抗原结合活性的新型抗体。这种抗体分子量仅有12-15kda，同时具备特异性高，亲和性强，稳定性高，穿透力强等特点。与传统igg相比，其cdr3区较长，形成的指状凸环能嵌入抗原分子沟槽或裂隙内，与抗原特异性结合后可直接抑制抗原活性。目前单域抗体在医学检测和药物研发中的应用已经有大量研究报道，单域抗体在食品加工领域还处于空白阶段，如果能针对食品中的内源酶制备出特异性单域抗体，就可以利用单域抗体对食品中的内源酶的特异性结合实现对酶活性的抑制，并且单域抗体的靶向性强，制备成本低，重复性好，在食品加工中作为一种酶抑制剂具有巨大的应用前景。技术实现要素：针对市场上的鲢鱼鱼肉凝胶劣化抑制剂在使用过程中存在的问题，本发明提供了一种安全、特异、高效的生物抑制剂，可有效抑制鲢鱼鱼糜凝胶劣化。本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一种对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体基因，核苷酸序列如seqidno：1所示：第二方面，本发明提供了一种对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体，包含有如seqidno：2所示的氨基酸序列：第三方面，本发明提供了一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂，包含有前文所述的鲨源单域抗体。前文所述鲨源单域抗体的制备方法包括以下步骤：1)鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶鲨源单域抗体基因文本库的建立。2)以引起鲢鱼鱼糜凝胶劣化的鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶为抗原对文本库中的单域抗体基因进行淘选与鉴定，获得对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有最高特异性的鲨源单域抗体基因。3)通过克隆表达纯化分离得到对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体。上述制备方法具体步骤包括：1)以鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶为抗原免疫铰口鲨，测定鲨鱼免疫应答情况；采集高免疫的鲨鱼外周血淋巴细胞，提取rna并合成cdna文库，利用基因重组技术构建噬菌粒载体，导入大肠杆菌构建鲨源单域抗体基因文本库并鉴定文本库容量；2)以辅助噬菌粒侵染单域抗体基因文本库，以鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶作为抗原，利用噬菌体展示技术通过多轮淘选，并通过elisa鉴定得到特异性最高的单域抗体基因ignarb7；3)为得到活性更高的单域抗体，经过多轮实验探究，确定了一种携带sumo融合标签的重组质粒pet28a-sumo作为表达载体，可使单域抗体可溶性表达，且产量更高。因此，本发明以pet28a-sumo为表达载体，以bamhi和sali为酶切位点，通过双酶切验证，构建pet28a-sumo-ignarb7重组表达质粒，并通过实验确定最佳诱导条件后进行大量表达，将表达所得融合蛋白进行镍琼脂糖亲和层析纯化，用sumo蛋白酶ulp1对表达融合蛋白进行酶解，通过进一步纯化得到鲨源单域抗体。与传统酶抑制剂抑制鱼糜凝胶劣化技术相比较，本发明的有益效果主要在于：(1)单域抗体通过与肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(mbsp)的专一结合发挥作用，特异性强，使用量低，效率更高。(2)单域抗体具有高热稳定性和高耐酸碱性，鱼糜加工过程的加工条件对抗体的活性影响较小。(3)特异性单域抗体的基因来源于铰口鲨鱼本身，借助生物工程大量生产，临床证明单域抗体安全、不存在潜在风险。附图说明图1为鲨鱼血清结合反应分析图；图2为融合蛋白酶解及目的蛋白纯化的sds-page验证图；图3为融合蛋白p2-b7图；图4为融合蛋白p2-b7亲和性验证图(ck：pbs；nc：空质粒表达产物；ac：sharkblood；1：p2-b7(0.557mg/m1)；2：p2-b7(0.1mg/m1)；3：融合蛋白b7-sumo(0.1mg/m1)；4：纯化后的sumo标签蛋白)；图5为不同浓度单域抗体p2-b7对鲢鱼mbsp的酶活抑制效果图(1：pbs 酶底物；2：mbsp 酶底物；3：0.5mg/ml单域抗体p2-b7；4：0.1mg/ml单域抗体p2-b7)；图6为不同鱼糜凝胶体系的温度扫描结果图(g’：储能模量；g”：损耗模量.)。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。总实施例一种对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体基因，核苷酸序列如seqidno：1所示：一种对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体，包含有如seqidno：2所示的氨基酸序列：一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂，包含有前文所述的鲨源单域抗体。该鲨源单域抗体的制备方法包括以下步骤：1)以鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶为抗原免疫铰口鲨，测定鲨鱼免疫应答情况；采集高免疫的鲨鱼外周血淋巴细胞，提取rna并合成cdna文库，利用基因重组技术构建噬菌粒载体，导入大肠杆菌构建鲨源单域抗体基因文本库并鉴定文本库容量。2)以辅助噬菌粒侵染单域抗体基因文本库，以鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶作为抗原，利用噬菌体展示技术通过多轮淘选，并通过elisa鉴定得到特异性最高的单域抗体基因ignarb7。3)以pet28a-sumo为表达载体，以bamhi和sali为酶切位点，通过双酶切验证，构建pet28a-sumo-ignarb7重组表达质粒并用iptg诱导剂诱导，将表达所得融合蛋白进行镍琼脂糖亲和层析纯化，用sumo蛋白酶ulp1对表达融合蛋白进行酶解，通过进一步纯化得到鲨源单域抗体。具体实施例：鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(mbsp)特异性鲨源单域抗体的制备及抑制鲢鱼鱼糜凝胶劣化效应1、鲢鱼鱼肉mbsp鲨源单域抗体文本库的建立将实验室制备的鲢鱼鱼肉mbsp与弗氏佐剂1∶1充分混合后于背鳍皮下注射免疫铰口鲨，每隔两周加强免疫一次，免疫四次后采集鲨鱼血清，利用间接elisa评价抗mbsp血清的应答效果；采集免疫后高效应答的鲨鱼外周血淋巴细胞，trizol法提取总rna，experion鉴定rna质量，经turbotmdnase处理后利用superscript系统合成cdna文库，设计单域抗体双向引物，通过pcr扩增dna产物，琼脂糖电泳后切胶纯化目标dna，经限制性内切酶ncoi和noti酶切后与phen2噬菌粒构建载体，电转化导入感受态大肠杆菌tg1细胞，构建单域抗体文本库，平板培养计数评估文本库容量。如图1所示，随着铰口鲨的三次免疫进行，鲨鱼血浆对mbsp的结合反应。证明铰口鲨经mbsp免疫后，产生了针对mbsp的特异性抗体。2、鲢鱼mbsp特异性鲨源单域抗体目的基因的淘选与鉴定在含有氨苄青霉素的2*yt培养基中37℃下培养扩增单域抗体文本库，添加m13k07辅助噬菌体侵染宿主菌(tg1)激活重组噬菌粒表达，30℃过夜培养，离心收集培养液上清，以聚乙二醇/氯化钠溶液(peg8000/nacl)沉淀噬菌体，mbsp包被免疫分析管进行单域抗体的淘选，以淘选得到的阳性噬菌粒再次侵染宿主菌(tg1)，循环四次淘选后利用多克隆噬菌体elisa测定噬菌粒的效价，测序分析阳性噬菌粒的核苷酸序列(如seqidno：1所示)和氨基酸序列(如seqidno：2所示)，确定最佳的鲢鱼mbsp特异性噬菌粒目的基因。3、鲢鱼mbsp特异性鲨源单域抗体的制备3.1pet28a-sumo-ignarb7重组表达质粒的构建及鉴定以ignarb7基因序列为模板，经过snapgeen基因序列分析软件对目的基因b7及pet28a-sumo质粒进行分析确定合适的酶切位点bamhi和sali，为方便后期融合蛋白的纯化，在目的基因3’端加上一个终止密码子。按照tianpreprapidminiplasmidkit试剂盒说明进行pet28a-sumo质粒的提取。以ignarb7目的基因和质粒pet28a-sumodna为模板，选择bamhi和sali限制性内切酶对其进行双酶切。具体酶切体系如表1，37℃酶切过夜，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并进行胶回收。表1双酶切体系反应组分体积(μl)pet28a sumo/vnar-b72μg10xfdbuffer5bamhi(10μ/μ1)1sali(10μ/μl)1ddh2oto50将双酶切纯化后的pet28a-sumo质粒与vnar-b7目的基因按照摩尔比1∶10的比例连接，具体反应体系如表2所示，50℃反应20min。反应结束后，立即将离心管放至冰上进行冷却2min，用于转化至感受态细胞dh5α中。表2连接反应体系反应组分体积(μl)pet28a sumo100ng目的基因40ng2×seamlesscloningmastermix1ddh2oto20挑取10个阳性克隆菌按照tianpreprapidminiplasmidkit试剂盒说明进行重组质粒的提取。以提取的10个重组质粒为模板，按照表3pcr反应体系和pcr反应条件进行基因扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，能够扩增出目的条带的质粒即为阳性转化菌株。用tiangen快速质粒小提试剂盒(dp-150)提取构建好的pet28a -vnar-b7载体，用bamhi和sali限制性内切酶进行双酶切验证，以证明目的基因连接在正确位置，酶切体系如表4。阳性重组质粒送至上海生工进行测序，对测序结果进行基因的插入位置、方向以及大小进行分析。表3pcr反应体系反应组分体积/μl10xpfubuffer5primer-12primer-22dna1dntp(25mmeach)1pfu(5μ/μl)0.4ddh2oto50pcr反应条件为：95℃-3min95℃-30s55℃-30s72℃-40s72℃-5min4℃-保存其中，在95℃-30s，55℃-30s，72℃-40s程度循环25次。表4限制性内切酶酶切体系反应试剂反应体积(μl)pet28a -vnar-b7载体200ng10xfdbuffer5ndei(10u/μl)1sali(10u/μl)1ddh2oto503.2鲢鱼mbsp特异性鲨鱼单域抗体的诱导表达为提高融合蛋白的表达效率，将重组质粒转化至表达菌株e.colibl21competentcells中，然后进行诱导表达。(1)将20ml过夜培养的菌液按1：100比例接种于4llb培养基中，添加终浓度50μg/ml卡那霉素，37℃，220rpm培养。(2)当od值达到0.6时，添加终浓度为0.3mm的iptg，220rpm，16℃诱导20h，未加iptg诱导剂的作为阴性对照。(3)4000rpm离心15min收集菌体，弃上清，菌体用60mltris-hcl(ph8.0)缓冲液悬浮，高压破碎3min，收集上清和沉淀，沉淀用10mltris-hcl(ph8.0)溶解，上清进行下一步纯化。(4)利用镍离子亲和层析技术对融合蛋白进行纯化后，分别收集各组分洗脱液，并进行sds-page检测，将纯化完全的洗脱液进行除盐透析到超纯水中16h，每8h换一次透析液，12000rpm离心20min。3.3融合蛋白b7-sumo的酶解与纯化将纯化后的融合蛋白b7-sumo用sumo蛋白酶(ulp)切除sumo蛋白标签，比例为：sumo蛋白酶∶需要酶切的目的蛋白＝1∶100，反应体系如表4所示，4℃过夜反应。在表4中的酶解体系下，融合蛋白b7-sumo上的sumo标签与目的蛋白p2-b7分离。利用镍离子亲和层析技术对酶解产物进行分离纯化。表4融合蛋白b7-sumo酶解体系反应组分体积(μl)融合蛋白1000μg10×sumoproteasebuffer20sumo蛋白酶2ddh2oto1000由图2所示，sumo蛋白酶已成功将表达产物酶解完全。如图3所示，将酶解体系通过镍离子亲和层析柱纯化后，可以得到大小为14kda的目的蛋白p2-b7。4、特异性鲨源单域抗体抑制肌原纤维丝氨酸蛋白酶(mbsp)的活性效果分析4.1特异性鲨源单域抗体p2-b7与鲢鱼mbsp的亲和性验证在表5的elisa试验样品设计方案下，以鲢鱼mbsp作为抗原，进行间接elisa验证，分析特异性鲨源单域抗体p2-b7与鲢鱼mbsp的亲和性。通过图4表明，通过间接elisa验证，浓度为0.557mg/ml(原液)和0.1mg/ml的目的蛋白p2-b7的elisa吸光值显著性高于阳性对照组，与鲢鱼mbsp具有很好的亲和性。表5elisa实验样品设计4.2特异性鲨源单域抗体p2-b7对鲢鱼mbsp酶活性抑制效果分析由于肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶mbsp在55℃时能分解荧光底物boc-phe-ser-arg-mca，反应释放的产物amc的量可用荧光分光光度计在激发光波长380nm和发射光波长450nm下进行测定。因此，可通过鲨源单域抗体与鱼肉mbsp反应结合测得的荧光强度来分析不同浓度的鲨源单域抗体对mbsp的抑制效果。具体方法如下：取20mmol/ltris-hcl缓冲液(ph8.0)，经过适当稀释的高度纯化的鲢鱼mbsp50μl(约0.03units)，分别加入不同稀释浓度的鲨源单域抗体(0mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、)，室温反应30min后，立即加入50μl10μmol/lboc-phe-ser-arg-mca，55℃反应30min后，以1.5ml终止液终止反应。用荧光分光光度计在激发光波长380nm和发射光波长450nm下测定荧光值。如图5所示，添加不同浓度的鲨源单域抗体与酶底物在适宜条件下充分作用后，其荧光强度与空白对照组相比具有显著性差异，说明添加不同浓度的鲨源单域抗体对鲢鱼mbsp的酶活性均具有较好的抑制作用，其中在浓度为0.1mg/ml的抗体浓度下即可对mbsp酶活产生约50％的抑制率。4.3特异性鲨源单域抗体对鲢鱼鱼糜凝胶劣化的抑制效果分析4.3.1鲢鱼鱼糜凝胶的制备取200g冷冻鲢鱼鱼糜经过半解冻后，切成条块放入真空斩拌机中(带冷凝循环)中斩拌5min，然后添加2.5％的食盐和0.01‰特异性单域抗体(同时参考已有研究文献设立对照组，阳性对照：0.03％大豆胰蛋白酶抑制剂sti；阴性对照：0.01‰bsa；空白组：pbs，添加体积均为20m1)，再真空斩拌5min，实验操作中温度控制在4℃左右，随后将斩拌后的复合溶胶灌入30mm的尼龙肠衣，扎紧封口放入4℃冰箱冷藏3天(纯鱼糜形成稳定凝胶体系的时间)。4.3.1鱼糜凝胶的动态流变学测定将mcr101流变仪进行校正后，将制备好的鱼糜凝胶切片置于其平台上，用二甲基硅油进行密封，以防止水分的挥发。选取直径为50mm的平行板及pp50转子，设定转子与平台间距为1mm。首先在25℃和1hz下进行0.01％～100％区间范围内的应变扫描测试，记录并分析储能模量(g’)与损耗模量(g”)与应变之间的关系曲线，以确定样品的线性粘弹性区间。以5/min℃的加热速率从10℃加热到100℃，之后再100℃保持5min，振荡频率设置为1hz，应变设为2％，测定储能模量、损耗模量和损耗因子对于温度的依赖性。由图6所示，在50℃下鱼肉中的mbsp被激活，凝胶劣化程度最大。加入0.01‰的鲢鱼p2-b7特异性鲨源单域抗体后，温度达到50-60℃时，其g’值的变化范围较小，90℃下g’值均显著提升，有效抑制了mbsp的活性，减少了鱼糜的凝胶劣化程度，约为56.2％。具体分析如下：在整个温度扫描的过程中，所有实验组的储能模量g’均呈现先减小后增加的趋势，且在50℃左右降至最低点。研究表明，在50-60℃范围内，内源性组织蛋白酶被激活，导致肌球蛋白重链被降解，疏水基团暴露，从而使得整个凝胶结构发生崩溃劣化。1、与其他样品组相比，control组中g’的变化最为剧烈，并且在温度扫描末段其g’最小，这说明其内源性组织蛋白酶活性最高，内部凝胶结构的劣化程度最为严重，所形成的凝胶网络的凝胶强度较低。根据已有研究，选取了0.03％sti和0.01‰bsa分别作为阴性和阳性对照，实验结果表明，bsa样品组中虽然g’变化较control组平缓，但是其值仍较小，这说明bsa虽然可以在一定程度上抑制肌球蛋白的降解但对于整个凝胶体系强度的提升作用较小。与之相比，添加sti的样品组其g’值显著增大且其变化幅度较小，这说明sti可以有效抑制鱼糜肌球蛋白重链的降解并增加体系的凝胶强度。2、添加0.01‰单域抗体p2-b7的样品组其g’的变化趋势与sti组类似，在50-60℃范围内，g’的变化程度较小，并且在整个温度扫描范围内，其g’值均显著提升，这说明p2-b7的添加能够有效的抑制白鲢鱼糜内源性组织蛋白酶的活性，使得所形成的凝胶体系的劣化程度减小，体系的凝胶强度有所增加。本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。序列表<110>中国海洋大学<120>一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂<130>2019<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>363<212>dna<213>铰口鲨(ginglymostomacirratum)<400>1ataataaggaattccatggctcgagtggaccaaacaccgcaaacaataacaaaggagacg60ggcgaatcactgaccatcaactgtgtcctacgagatagtaactgtgcattgtccagcacg120tactggtatcgcaaaaaatcgggctcaacaaacgaggagagcatatcgaaaggtggacga180tatgttgaaacagttaacagcggatcaaagtccttttctttgagaattaatgatctaaca240gttgaagacagtggcacgtatcgatgcaaggtatacggccggactccgatgatacgggat300agctgggcttggtgtcgaactggcgaagatgtatacggagatggcactgccgtgactgtg360aat363<210>2<211>129<212>prt<213>铰口鲨(ginglymostomacirratum)<400>2glyserileileargasnsermetalaargvalaspglnthrprogln151015thrilethrlysgluthrglygluserleuthrileasncysvalleu202530argaspserasncysalaleuserserthrtyrtrptyrarglyslys354045serglyserthrasnglugluserileserlysglyglyargtyrval505560gluthrvalasnserglyserlysserpheserleuargileasnasp65707580leuthrvalgluaspserglythrtyrargcyslysvaltyrglyarg859095thrprometileargaspsertrpalatrpcysargthrglygluasp100105110valtyrglyaspglythralavalthrvalasnalaalaalaserleu115120125ile当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体基因，其特征在于，核苷酸序列如seqidno:1所示：ataataaggaattccatggctcgagtggaccaaacaccgcaaacaataacaaaggagacgggcgaatcactgaccatcaactgtgtcctacgagatagtaactgtgcattgtccagcacgtactggtatcgcaaaaaatcgggctcaacaaacgaggagagcatatcgaaaggtggacgatatgttgaaacagttaacagcggatcaaagtccttttctttgagaattaatgatctaacagttgaagacagtggcacgtatcgatgcaaggtatacggccggactccgatgatacgggatagctgggcttggtgtcgaactggcgaagatgtatacggagatggcactgccgtgactgtgaat。
2.一种对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体，其特征在于，包含有如seqidno:2所示的氨基酸序列：gsiirnsmarvdqtpqtitketgesltincvlrdsncalsstywyrkksgstneesiskggryvetvnsgsksfslrindltvedsgtyrckvygrtpmirdswawcrtgedvygdgtavtvnaaasli。
3.一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂，其特征在于，包含有如权利要求2所述鲨源单域抗体。
4.一种如权利要求2所述鲨源单域抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶鲨源单域抗体基因文本库的建立；
2）以引起鲢鱼鱼糜凝胶劣化的鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶为抗原对文本库中的单域抗体基因进行淘选与鉴定，获得对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有最高特异性的鲨源单域抗体基因；
3）通过克隆表达纯化分离得到对鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶具有高特异性的鲨源单域抗体。
5.如权利要求4的制备方法，其特征在于，步骤1）具体包括：以鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶为抗原免疫铰口鲨，测定鲨鱼免疫应答情况；采集高免疫的鲨鱼外周血淋巴细胞，提取rna并合成cdna文库，利用基因重组技术构建噬菌粒载体，导入大肠杆菌构建鲨源单域抗体基因文本库并鉴定文本库容量。
6.如权利要求5的制备方法，其特征在于，步骤2）具体包括：以辅助噬菌粒侵染单域抗体基因文本库，以鲢鱼鱼肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶作为抗原，利用噬菌体展示技术通过多轮淘选，并通过elisa鉴定得到特异性最高的单域抗体基因ignarb7。
7.如权利要求6的制备方法，其特征在于，步骤3）具体包括：以pet28a-sumo为表达载体，以bamhⅰ和salⅰ为酶切位点，通过双酶切验证，构建pet28a-sumo-ignarb7重组表达质粒并用iptg诱导剂诱导，将表达所得融合蛋白进行镍琼脂糖亲和层析纯化，用sumo蛋白酶ulp1对表达融合蛋白进行酶解，通过进一步纯化得到鲨源单域抗体。
技术总结本发明涉及水产品领域，公开了一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂，该抑制剂是以引起鲢鱼鱼糜凝胶劣化的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）为抗原免疫铰口鲨，从铰口鲨血清中分离单域抗体基因，建立单域抗体基因文本库，通过噬菌体展示技术得到高特异性的单域抗体目的基因，然后利用克隆表达技术及亲和层析技术分离得到高纯度、高活性、高表达量的鲢鱼MBSP特异性鲨源单域抗体；该生物抑制剂能显著抑制鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的活性，有效抑制鲢鱼鱼糜的凝胶劣化。本发明涉及的生物抑制剂安全、特异、高效，使用过程操作简单，可应用于鲢鱼鱼糜的凝胶劣化的抑制。
技术研发人员：隋建新
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2019.12.09
技术公布日：2020.06.09
