1.本发明涉及保护性葡萄球菌外毒素疫苗。本发明具体涉及新型疫苗抗原和疫苗，该新型疫苗抗原和疫苗诱导针对金黄色葡萄球菌感染或外毒素暴露的保护性免疫，以及针对葡萄球菌外毒素诱导的败血症疾病状况的保护。
背景技术：2.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)产生多种外蛋白，这些外蛋白有助于该菌在哺乳动物宿主中定植并引起不同严重程度的疾病，从浅表皮肤感染(例如脓肿和脓疱病)到严重的侵入性感染(例如肺部疾病、骨髓炎和心内膜炎)，以及急性和可能致命的中毒性休克综合征(toxic shock syndrome，tss)和感染性休克综合征。
3.金黄色葡萄球菌表达称为致热毒素超抗原的外毒素。葡萄球菌肠毒素b是葡萄球菌的超抗原外毒素中的一种，又称为葡萄球菌外毒素b(staphylococcal exotoxin b，seb)。与常规抗原不同，超抗原与肽结合槽外的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，mhc)ii类分子结合，并通过与t细胞受体(t cell receptor，tcr)的vβ链结合来激活t细胞。超抗原远比常规抗原有效，可以触发高达30％的整个t细胞群。它们导致t细胞大量增殖和细胞因子不受控制地释放。超抗原以比普通抗原低得多的浓度激活t细胞。超抗原的激活可以在皮克至低纳克浓度下检测到，而普通抗原在微克或更高浓度时可以检测到。因此，其差异是5至8个对数级别。细胞表面上il-2受体的克隆扩增和上调是抗原呈递细胞上的mhc ii类和cd4
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细胞上的tcr交联的结果。细胞因子的大量释放是seb毒性的基础。seb也是食物中毒的常见原因，会导致严重的腹泻、恶心和肠绞痛。由于seb相当稳定，即使污染细菌被杀灭后，其毒素仍可能保持活性。
4.seb作为tss(中毒性休克综合征)的致病因子发挥着关键作用。超抗原的实验性应用导致压倒性的炎症反应，炎症细胞因子不受控制的释放导致休克和多器官衰竭(ulrich et al.vaccine 1998,16(19):1857-1864)。
5.基于关于金黄色葡萄球菌(s.aureus)seb的结构和功能关系的信息，已经建立了多个突变体，目的是消除其毒性和超抗原特性，同时保留不被削弱的特异性免疫原性和保护性(lowell et al.infection and immunity 1996,64(5):1706-1713；leclaire et al.infection and immunity 2002,770(5):2278
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2281)。
6.kappler et al.(j.exp.med.1992,175:387-396)描述了限定超抗原seb功能区域的突变。
7.fries et al.(microbiol spectr.2013,1(2):2013)公开了seb的特异性结合区域，提供了源自金黄色葡萄球菌临床分离株的seb氨基酸序列的序列比对。
8.us6713284公开了基因减毒的超抗原毒素疫苗，具体地seb其中的某些氨基酸位置被改变，从而改变了其与mhc ii类受体和t细胞抗原受体的结合。
9.woody et al.(vaccine 1997,15(2):133-139)公开了具有n23k或f44s突变的seb突变体，并描述了其在小鼠模型中的疫苗潜力。
10.jeong et al.(acta cryst.2017,f73,595
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600)公开了seb候选疫苗，其具有四个突变(n23a、y90a、r110a和f177a)，其显示出消除的超抗原活性。
11.bagnoli et al.(pnas 2015,112(12):3680
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3685)描述了联合疫苗抗原α-溶血素(hla)、胞外黏质物a(ess extracellular a，esxa)和胞外黏质物b(ess extracellular b，esxb)以及两种表面蛋白异羟肟酸铁摄取d2(surface proteins ferric hydroxamate uptake d2)和保守葡萄球菌抗原1a，这些抗原与氢氧化铝或吸附在明矾上的toll样受体7(tlr7)依赖性激动剂(smip.7-10)一起配制。
12.jp4571586b2(对应于ep1661911)公开了经修饰的seb，其具有蛋白酶抗性与降低的毒性，其包括用任何其他氨基酸置换第97位的赖氨酸和第98位的赖氨酸。此外，公开了将第23位天冬酰胺置换为酪氨酸。
13.wo99/40935(对应于ep1055429)公开了包括修饰的seb，该修饰是例如将第9、23、41或44位的一个或多个氨基酸置换，以赋予对t细胞激活的抑制活性。
14.wo2014/205111公开了多价肽寡肽，包括金黄色葡萄球菌抗原或其突变体、片段、变体或衍生物，其可以包括seb、sec1-3、see、seh、sei、sek、tsst-1、spec、sed或spea，或以上的突变体、片段、变体或衍生物，或其以任何顺序的任何组合。在某些方面，公开了包括seb突变体的寡肽，该seb突变体为包括氨基酸置换l45r/y89a/y94a的减毒类毒素seb。
技术实现要素：15.本发明的目的是提供新的seb疫苗抗原以触发保护性免疫反应。该目的由本技术权利要求的主题所解决，并在本文进一步描述。
16.本发明提供了赋予保护性免疫的疫苗抗原，特别是靶向专职性抗原呈递细胞(apc)或组成型表达mhc ii类的先天和/或适应性免疫系统的细胞。
17.本发明提供了脱毒葡萄球菌外毒素b(seb)毒素，包括至少一个脱毒seb毒素分子的保护性疫苗抗原，保护性疫苗，以及此类疫苗用于医学目的的用途；该脱毒seb毒素突变为在seb毒素序列seq id no:1的氨基酸第21至25位，或在任何其他天然存在的seb毒素序列中的相应氨基酸位置包括至少两个或至少三个点突变。
18.本文所描述的脱毒seb毒素也称为脱毒seb或脱毒葡萄球菌外毒素。
19.根据具体的方面，本发明提供了脱毒葡萄球菌外毒素b(seb)毒素，其突变为在seb毒素序列seq id no:1的氨基酸位置第21至25位(即“在aa21-25内”，也称为“在aa21-25的区域中”)包括至少两个或至少三个点突变，其中所述至少两个或三个点突变包括aa21-22、aa22-23、aa23-24、aa24-25、aa21-23、aa22-24或aa23-25的缺失，或者在任何其他天然存在的seb毒素序列中的相应氨基酸位置包括所述至少两个或三个点突变，该天然存在的seb毒素序列与seq id no:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。具体地，此类天然存在的seb毒素具有葡萄球菌超抗原的功能，除非经工程化以并入相应的脱毒突变。
20.具体地，由seq id no:1确定的野生型seb毒素来源于金黄色葡萄球菌(s.aureus，atcc 14458)。其他天然存在的seb毒素序列源自不同的金黄色葡萄球菌来源(或分离株)，这些菌株除了在以下区域以外具有可变性：t细胞受体(α/β)结合区域(seq id no:1中的aa21-25；“menmk”，seq id no:37；识别位点m21、e22、n23、m24和k25)或免疫球蛋白超家族
结合区域，例如mhc ii类受体结合区域，特别是抗原结合槽内部、相邻或外部的结合区域(例如seq id no:1中的aa42-47；“dqflyf”，seq id no:38；识别位点d42、q43、f44、l45、y46和f47；或seq id no:1中的aa89-91；或seq id no:1中的aa66-68)。此类区域在本文中称为“核心区域”。具体地，为aa21-25和aa42-47中的任一个或两个，以及任选地aa89-91或aa66-68中的任一个或两个。seb毒素序列内的任何其他区域在本文中称为seb的“非核心区域”。
21.示例性的天然存在的seb野生型变体包括或由以下序列组成：seq id no:17、19、21、23、25、27或29，每个序列包括相同的核心区域，在非核心区域中的可变性具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。seq id no:1天然存在的seb野生型变体的非核心区域内点突变数可以为1、2、3、4或5。
22.如本文进一步描述的，脱毒seb毒素的具体特征在于在t细胞受体结合区域中的脱毒点突变和任选地在免疫球蛋白超家族结合区域中的脱毒点突变。
23.具体地，脱毒点突变在seb的t细胞受体结合区域内，更具体地在aa21-25内。具体地，脱毒点突变在aa21-25的区域中，并且缺失至少两个或三个氨基酸。具体地，在aa21-25区域的脱毒点突变包括仅2、3、4或5个氨基酸的缺失，优选地至少包括n23的缺失和与n23相邻的一个或两个氨基酸的缺失。在aa21-25内的点突变数可以为2、3、4或5，具体地，其中点突变为至少2或3个连续(相邻)aa位置的突变，例如aa21-22、aa22-23、aa23-24、aa24-25、aa21-23、aa22-24或aa23-25。可选地，将位置aa23的点突变与一个或多个非连续(非相邻)的突变组合，例如在aa21和/或aa25处。
24.根据具体的方面，在aa21-25区域中的突变为至少两个、三个或四个氨基酸的缺失，至少包括n23和/或e22和/或m24，和/或m21和/或k25的缺失，例如aa22-23、aa23-24、aa21-23、aa22-24或aa23-25中的至少任何一种的缺失或置换，特别是仅aa22-24的缺失。
25.根据特别优选的方面，在氨基酸第21至25位的所述点突变包括或由以下组成：氨基酸22-24和/或21-23的缺失。
26.具体地，脱毒seb毒素包括一个或多个进一步的点突变，包括在选自以下位置的至少一个氨基酸的置换：在l45、q43或f44处，优选地为l45r、q43p、f44p或f44s；优选地，其中该脱毒seb毒素包括或由以下任一序列组成：seq id no:5、7、9或11，或者前述任一序列的脱毒seb变体序列，脱毒seb变体序列在氨基酸第21至25位包括所述至少两个点突变(优选为aa22-24的缺失)并与前述任一序列具有至少95％的序列同一性。
27.根据具体的方面，脱毒seb毒素的特征在于在其免疫球蛋白超家族结合区域中的一个或多个进一步的(额外的)点突变(即，除了在aa21-25区域中的点突变)，优选地在aa42-47的区域中，其中所述一个或多个进一步的点突变在选自以下位置包括至少一个氨基酸的置换：在l45、q43或f44处，优选地为l45r、q43p、f44p或f44s；优选地在l45处，例如l45r。
28.一般地，在序列(例如，本文所描述的氨基酸序列)中产生或确定突变是根据参考(或野生型)序列(即不包括突变的序列)进行编号的。因此，除非另有明确说明，脱毒seb毒素中的氨基酸位置为相应的野生型毒素的位置，例如由seq id no:1所确定的位置。尽管脱毒seb毒素可以包括在t细胞受体结合区域中一个或多个氨基酸的缺失，但任何此类缺失之后的位置仍将按野生型蛋白质中的位置进行编号。例如，在删除aa22-24的缺失突变体中，在l45处的点突变仍然在编号为aa45的位置，尽管此类缺失突变体的序列已经缩短了三个
氨基酸。
29.根据具体的方面，脱毒seb毒素包括或由以下序列组成：seq id no:3或其脱毒seb变体序列，脱毒seb变体序列在氨基酸第21至25位包括所述至少两个或所述至少三个点突变并与seq id no:3具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
30.具体地，脱毒seb毒素包括或由以下序列组成：seq id no:3或其脱毒seb变体序列，seq id no:3与seq id no:1的区别在于aa22-24的缺失，脱毒seb变体序列(即，seq id no:3的变体seb序列)包括所述aa22-24的缺失并与seq id no:3具有至少95％的序列同一性。
31.具体地，所述seq id no:3的脱毒seb变体序列包括在seq id no:3中的所述aa22-24的缺失；和：
32.a)在其免疫球蛋白超家族结合区域中的一个或多个进一步的点突变，优选在aa42-47内(即，在aa42-47区域内)，和/或
33.b)在seb序列的其他区域中天然存在的一个或多个进一步的点突变，例如在非核心区域中，在seb野生型变体中天然存在的一个或多个点突变，例如在以下任一序列中出现的点突变：seq id no:17、19、21、23、25、27或29，特别是以下一个或多个点突变：k7n、s14a、v82l、t133s、k141e、t150i、s225f；和/或
34.c)与seq id no:3或与seq id no:3的相应非核心区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
35.具体实施例包括seq id no:3的seb毒素变体序列，其包括如本文所描述的脱毒突变，并且其具体特征在于与seq id no:3的相应区域，特别是在seq id no:3的所有相应区域的全长上，具有至少以下任一百分比的序列同一性：95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
36.具体实施例包括seq id no:3的seb毒素变体序列，其包括如本文所描述的脱毒突变，并且其具体特征在于与seq id no:3的相应区域相比，与seq id no:3的相应非核心区域，特别是在seq id no:3的所有相应非核心区域的全长上，具有至少以下任一百分比的序列同一性：95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
37.根据具体实施例，脱毒seb毒素包括或由以下任一序列组成：seq id no:5、7、9或11，或者前述任何序列的脱毒seb变体序列，脱毒seb变体序列在氨基酸第21至25位包括所述至少两个点突变或所述至少三个点突变并与前述任一序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
38.具体地，所述seq id no:5、7、9或11中任一序列的脱毒seb变体序列包括所述至少两个或至少三个点突变，该点突变包括在相应的seq id no:5、7、9或11的氨基酸第21至25位；和：
39.a)在其免疫球蛋白超家族结合区域中的一个或多个进一步的点突变，优选在aa42-47内，和/或
40.b)在seb序列的其他区域中天然存在的一个或多个进一步的点突变，例如在非核心区域中，在seb野生型变体中天然存在的一个或多个点突变，例如在以下任一序列中出现的点突变：seq id no:17、19、21、23、25、27或29，特别是以下一个或多个点突变：k7n、s14a、v82l、t133s、k141e、t150i、s225f；和/或
41.c)与seq id no:5、7、9或11，或者与seq id no:5、7、9或11的相应非核心区域分别具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
42.具体实施例包括seq id no:5、7、9或11中任一序列的脱毒seb变体序列，其包括如本文所描述的脱毒突变，并且其具体特征在于分别与任一前述脱毒seb毒素序列的相应非核心区域，特别是在任一前述脱毒seb毒素序列的所有相应非核心区域的全长上，具有至少以下任一百分比的序列同一性：95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
43.具体实施例包括seq id no:5、7、9或11中任一序列的脱毒seb变体序列，其包括如本文所描述的脱毒突变，并且其具体特征在于分别与任一前述脱毒seb毒素序列的相应区域，特别是在任一前述脱毒seb毒素序列的所有相应非核心区域的全长上，具有至少以下任一百分比的序列同一性：95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
44.尽管在t细胞受体结合区域中存在不止一个点突变，但本发明的seb已被证明不仅是脱毒的，而且当用作疫苗抗原时令人惊讶地触发了有效的免疫反应。此类免疫反应证明是保护性的，能够靶向t细胞受体并阻止野生型seb结合至t细胞受体的能力，从而在用野生型seb和lps炎症免疫反应触发物攻击时防止相应的免疫反应和炎症反应。
45.因此，本发明进一步提供了保护性疫苗抗原，其包括或由至少一种如本文所描述的脱毒seb毒素分子组成。
46.具体地，该疫苗抗原包括或由以下组成：所述至少一种脱毒seb毒素分子与葡萄球菌疫苗抗原的组合，该葡萄球菌疫苗抗原与所述脱毒seb毒素分子相同或不同，优选地其中该组合以融合物、混合物或复合物提供，其包括所述分子和抗原，所述分子和抗原彼此结合和/或结合至载体，从而形成复合物。
47.示例性的组合为无毒或脱毒seb分子的融合物，其中所述seb分子中的至少一种(或两种)为包括如本文所描述的点突变的脱毒seb。
48.具体地，所述至少一种脱毒seb毒素分子与另一种脱毒seb毒素分子融合，任选地包括接头序列。适合使用的具体接头为肽接头，例如由一系列至少两个或至少三个氨基酸组成的肽接头。具体地，分子的融合在有或没有接头的情况下，通过肽键，以任何顺序进行。
49.根据具体的方面，融合物包括至少两个相同的如本文所述的脱毒seb毒素分子，或至少两个不同的如本文所述的seb毒素分子，这两个不同的seb毒素分子在至少一个如本文所描述的脱毒点突变处不同。至少两个分子的融合物，特别是两个相同分子的融合物，有或没有接头，在本文中也称为“串联构建体”。
50.融合可以通过编码相应肽序列的核酸分子的重组来实现，或者通过合成编码的核酸分子或融合的(多)肽序列来实现。
51.具体地，接头可以为肽接头，优选地由多个连续氨基酸残基构成，例如选自任何天然存在的氨基酸，优选gly、ser、his、met、lys、leu和thr中的任何氨基酸。接头可以由甘氨酸和丝氨酸等柔性残基构成，这样相邻的肽就可以相对于彼此自由移动。为了融合如本文所描述的两个脱毒seb毒素分子，使用短接头已足够，例如包括或由2-10个氨基酸的序列组成的肽接头，例如包括或由选自以下两个氨基酸构成的肽接头：lys-leu、his-met、gly-thr和gly-gly-gly。例如，当需要确保两个相邻分子不会在空间上相互干扰时，可以使用更长的接头，例如超过10个氨基酸的接头。
52.根据具体的方面，除了接头以外，抗原可以包括一个或多个肽间隔物，例如为了改
进多肽的结构或稳定性。
53.具体地，本文所描述的肽融合物可以包括通过生物缀合、化学缀合或交联方便地彼此结合的肽。例如，抗原可以包括肽缀合物。具体实施例可以采用多聚化结构域、载体或装置，例如适合用于固定化一系列肽的纳米结构或珠子。
54.然而，抗原可以以由两条或多条多肽链构成的分子或分子复合物提供，该多肽链通过共价或非共价键连接，或者只是混合以获得抗原组合物。
55.根据具体实施例，疫苗抗原包括或由以下任一序列组成：seq id no:13、31、33或35，或者前述任一序列的疫苗抗原变体序列，疫苗抗原变体序列在氨基酸第21至25位包括所述至少两个点突变并与前述任一序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
56.具体地，所述seq id no：13、31、33或35中任一序列的疫苗抗原变体序列包括所述至少两个或至少三个点突变，该点突变包括在相应的seq id no：13、31、33或35的氨基酸第21至25位；和：
57.a)在其免疫球蛋白超家族结合区域中的一个或多个进一步的点突变，优选在aa42-47内，和/或
58.b)在seb序列的其他区域中天然存在的一个或多个进一步的点突变，例如在非核心区域中，在seb野生型变体中天然存在的一个或多个点突变，例如在以下任一序列中出现的点突变：seq id no:17、19、21、23、25、27或29，特别是以下一个或多个点突变：k7n、s14a、v82l、t133s、k141e、t150i、s225f；和/或
59.c)与seq id no:13、31、33或35，或者与seq id no:13、31、33或35的相应非核心区域分别具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
60.具体实施例包括seq id no:13、31、33或35的疫苗抗原变体序列，其包括如本文所描述的脱毒突变，并且其具体特征在于分别与任一前述序列的相应非核心区域，特别是在任一前述序列的所有相应非核心区域的全长上，具有至少以下任一百分比的序列同一性：95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
61.具体实施例包括seq id no:13、31、33或35的疫苗抗原变体序列，其包括如本文所描述的脱毒突变，并且其具体特征在于分别与任一前述序列的相应区域，特别是在任一前述序列的所有相应区域的全长上，具有至少以下任一百分比的序列同一性：95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
62.本文所描述的疫苗抗原中包括的可选组合为复合物，其中所述分子被吸附、粘附或以其他方式固定或结合至脂质体、纳米颗粒或固体载体，例如适合用于配制疫苗制剂的那些物质。
63.可选的组合为分子的混合物，例如在疫苗制剂中以预定比例或剂量提供，例如，在佐剂化合物上配制的混合物，例如不溶性金属盐，例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝。
64.本发明进一步提供了包括本文所描述抗原的药物制剂，其还包括药学上可接受的载体，例如在免疫原性制剂中。
65.本发明进一步提供了一种保护性疫苗制剂，其包括本文所描述的抗原和药学上可接受的载体。
66.疫苗制剂的具体实施例包括佐剂，例如适合用于人类疫苗制剂的佐剂。
67.佐剂的具体例子选自：不溶性金属盐，吡喃葡萄糖基脂质a佐剂，作为先天免疫刺激剂的佐剂系统，例如as01、as03或as04，mf59，诸如toll-样受体激动剂或cpg寡核苷酸的tcr刺激剂；优选地，佐剂选自明矾、氢氧化铝或磷酸铝。
68.具体地，可以采用初免-加强策略以有效量将疫苗施用于受试者，具体为人类受试者。
69.具体地，疫苗抗原的有效量在每次施用0.0001至1mg的范围内，优选地为每剂至少100、200、300、400、500、600、700、800、900ng，或每剂至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg。
70.具体地，本文所描述的疫苗制剂以供人类使用的制剂形式提供。具体的实施例以用于肠胃外的制剂形式提供，例如肌肉内或皮下、鼻内、粘膜、口服、微针皮肤、透皮、舌下、气溶胶或吸入施用。优选地，治疗包括通过各种施用途径施用本文所描述的疫苗。
71.具体地，疫苗在seb暴露或毒性部位具有保护作用，例如在以下一个或多个部位：皮下、胃肠道黏膜、皮肤或肌肉部位。
72.根据具体的方面，疫苗制剂为包括所述疫苗抗原与一种或多种葡萄球菌超抗原类毒素抗原组合的多价疫苗；优选地，该葡萄球菌超抗原类毒素抗原选自：tsst-1、α-溶血素、γ-溶血素、β-溶血素、葡萄球菌外毒素或肠毒素，例如肠毒素a(sea)、c(sec)、i(sei)和k(sek)。
73.根据具体的方面，具体地，提供本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原用于医学、诊断或分析的用途。
74.本发明进一步提供了本文所描述的脱毒seb毒素、疫苗抗原或疫苗制剂的医学用途，具体为此类材料在制备药物制剂的方法中的用途，例如为制备疫苗制剂用于治疗受试者(例如人类受试者或患者)，特别是用于预防或治疗特定疾病状况或疾病。
75.具体地，医学用途涉及免疫疗法，例如主动免疫疗法。特异性免疫疗法通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫反应的方法，为患有疾病或者有患上或遭受疾病或疾病复发风险的受试者提供治疗。
76.具体地，提供疫苗制剂用于预防或治疗表达葡萄球菌超抗原的细菌的感染，和/或由暴露于葡萄球菌超抗原毒素直接或间接介导的疾病状况。具体地，疾病状况由目标葡萄球菌属引起或触发。
77.具体地，提供疫苗制剂用于给受试者接种疫苗以进行预防性治疗以预防葡萄球菌属的感染，特别是对有需要的受试者进行疫苗接种和免疫。
78.根据具体的方面，疫苗制剂可用于预防或治疗其中抑制、减少葡萄球菌属的生长将是有益的任何疾病、疾病状况或病症。
79.根据具体的方面，疫苗制剂可用于预防或治疗与直接或间接暴露于葡萄球菌毒素如seb相关的任何疾病、疾病状况或病症。此类治疗可用于预防或治疗此类毒素中毒的方法，例如可能由食物中毒或接触中毒引起的毒素中毒，例如通过粘膜或皮肤接触，或通过吸入葡萄球菌毒素。
80.根据具体的方面，疫苗制剂可用于预防或治疗疾病状况，该疾病状况为由革兰氏阳性细菌、病毒或真菌病原体的微生物介质或者毒素诱导的败血症状况。具体地，该败血症状况为败血症、中毒性休克综合征(tss)或败血性休克。
81.微生物毒素，例如lps或革兰氏阳性细菌、病毒或真菌病原体的类似毒素可能在具有葡萄球菌并发症倾向(例如此前曾接触葡萄球菌毒素和/或葡萄球菌感染)的受试者中引发严重的败血症。
82.根据具体的方面，该疫苗制剂可用于用该疫苗制剂对患者进行免疫，该患者在对疾病的外科手术干预或侵入性治疗后有葡萄球菌并发症的风险。在此类手术干预或侵入性治疗之前对此类患者进行免疫将降低葡萄球菌并发症的风险。
83.本发明进一步提供如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原在以下方法中的用途：
84.a)制备疫苗制剂，或
85.b)制备特异性识别seb毒素的抗体。
86.可以通过适合用于制备蛋白质或亚单元疫苗的方法来制备疫苗制剂。具体地，通过将脱毒seb毒素或疫苗抗原配制成适合用于所选施用途径的疫苗制剂来制备疫苗制剂。
87.本发明进一步提供了制备如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原的方法，通过在重组宿主细胞中表达编码相应毒素或抗原的核酸序列，以及分离和任选地纯化相应的毒素或抗原。
88.具体地，如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原以重组蛋白的形式提供，例如通过重组表达技术制备。
89.本发明进一步提供了编码如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原的核酸分子。此类核酸分子可以是密码子优化的，从而降低回复突变的风险，或改进在重组宿主生物体中的序列表达，该重组宿主生物体例如为原核或真核或昆虫宿主细胞，例如为大肠杆菌、酵母或哺乳动物表达系统。
90.具体实施例涉及包括或由以下任一序列组成的核苷酸分子：seq id no:2、4、6、8、10、12、14、32、34或36，或者以上序列的密码子优化变体。
91.本发明进一步提供了重组表达构建体，其用于在重组宿主细胞中制备如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原，其包括如本文所描述的核酸分子。此类表达构建体至少包括表达盒，该表达盒例如在载体或质粒内，或者被提供用于染色体整合至宿主细胞基因组中。
92.根据具体的方面，本发明进一步提供了表达系统，其用于通过包括本文所描述核酸分子的重组宿主细胞，在离体细胞培养物中制备如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原。
93.本发明进一步提供了包括本文所描述核酸分子或表达构建体的重组宿主细胞。
94.合适的宿主细胞可以选自细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)，但也可以选自哺乳动物、昆虫或酵母细胞，例如hek293细胞、cho细胞、ns0细胞、sf9细胞、high five细胞(昆虫细胞)、毕赤酵母、酿酒酵母等其他。
95.根据具体的方面，本发明进一步提供了制备如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原的方法，其中在一定条件下培养或维持本文所描述的重组宿主细胞以制备所述抗原。
附图说明
96.图1显示了本文提到的序列。
97.图2.seb毒素在人类外周血单核细胞(pbmc)中诱导高t细胞增殖，通过10mg至1pg
的3h-胸腺嘧啶核苷掺入进行检测。
98.图3.seb del 22-24刺激人类pmnc的增殖：突变体seb del 22-24诱导大幅降低但仍然存在的t细胞增殖。
99.图4-6显示了seb del 22-24与seb del l45r相比的改进。数据经以下得到证实：
100.图4.用seb和seb突变体刺激的pbm上清液中的il-2蛋白浓度，t细胞依赖性介质：seb毒素导致剂量依赖性的高t细胞激活，结果导致高il-2细胞因子释放。双突变变体l45r和22-24缺失没有激活t细胞，即使在高浓度下也是如此，并且与未刺激的细胞相比，il-2细胞因子的释放没有增加。
101.图5.用seb和seb突变体刺激的pbmc上清液中的il-6蛋白浓度，炎症介质：众所周知的人体内炎症反应；检测人类pbmc中il-6的剂量依赖性释放。
102.图6.用seb和seb突变体刺激的pbmc上清液中的tnfα蛋白浓度。效果是剂量依赖性的。变体l45r和缺失22-24突变体未显示高于未刺激对照的tnfα释放。
103.图7.用四次免疫后的兔血清对t细胞激活的抑制。
104.图8.用四次免疫后的兔血清对t细胞激活的抑制：针对seb del 22-24l45r的抗血清与针对seb野生型的抗血清进行比较。
105.图9.用四次免疫后的兔血清对t细胞激活的抑制：针对融合(串联)seb del 22-24l45r构建体的抗血清与针对seb野生型的抗血清进行比较。
106.图10.用seb del 22-24l45r刺激人类pbmc的增殖。人类pbmc中的t细胞增殖大幅降低。
107.图11.用seb野生型和seb del 22-24l45r刺激后的il-2基因激活。双突变体的il-2基因激活大幅降低。
108.图12.用100μg的串联seb del 22-24l45r构建体+1mg al(oh)3免疫后的elisa滴度(平均值，n＝8)。
109.图13：人类mnc的增殖，wtseb、rseb(del22-24)、rseb(n23l、l45r、y91p、q210l)和rseb(del22-24、l45r、y91p、q210l)的比较。
具体实施方式
110.在本说明书全文中使用的具体术语具有以下含义。
111.如本文所用，术语“包括(comprise)”、“包含(contain)”、“具有(have)”和“含有(include)可以作为同义词使用并且应理解为开放式限定，允许进一步的成员或部分或元素。“由
……
组成(consisting)”认为是封闭式限定，没有组成限定特征之外的其他元素。因此，“包括(comprising)”更广泛，并包含“由
……
组成”的限定。
112.如本文所用，术语“抗原”具体应指任何抗原决定簇，其可能被抗体的结合位点识别。具体地，优选的抗原是那些已经被证明具有或能够具有免疫学或治疗相关性的分子或结构，尤其是那些已对其临床功效进行测试的分子或结构。如本文所用的术语应具体包括选自抗原的分子或结构，该抗原包括免疫可及和免疫相关表位，具体为在一个或多个物种或血清型中发现的保守抗原。免疫可及的病毒表位通常由抗原呈递或包括在抗原中，该抗原在病毒粒子外表面上表达或在感染细胞表面上表达。
113.如本文所描述的选择的表位和肽可以在体内触发免疫反应，从而分别诱导针对抗
原和目标细菌的中和抗体。这提供了用抗原主动免疫的有效保护。多肽抗原为优选的抗原，因为它们具有引发细胞和体液免疫反应的固有能力。
114.本文提及的保护性抗原理解为诱导保护性免疫反应。
115.术语“保护性免疫反应”或“保护性免疫”在本文中的含义如下：保护性免疫是由免疫产生的免疫反应赋予受试者的状态，使得受试者的反应足以使其存活或中和攻击剂量的相应抗原或病原体，该剂量甚至是对未免疫受试者具有毒性或致死性的剂量，或者该反应抑制了不需要的或不受控制的炎症和/或免疫细胞的激活。葡萄球菌毒素如seb可能会导致抗原呈递细胞和/或t细胞的激活以及不受控制的炎症反应，这可能会损害器官，例如胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道、粘膜或脑的损伤，甚至可能是致命的。本文所描述的主题疫苗具体设计用于赋予保护性免疫以预防或减少此类炎症反应。可以通过体外或体内检测确定保护性免疫抑制不需要的抗原呈递细胞刺激和/或t细胞激活的作用。体内检测优选采用合适的动物模型，优选在至少两种不同物种中进行测试，例如小鼠和兔模型。
116.本文所描述的抗原理解为具体包括线性、非支链氨基酸序列的蛋白质抗原，该蛋白质抗原为天然存在的但经修饰以引入某些脱毒突变，其可以进一步修饰，例如通过突变或化学衍生化，例如通过磷酸化、甲基化、乙酰化、酰胺化、形成吡咯烷酮羧酸、异构化、羟基化、硫酸化、黄素结合、半胱氨酸氧化和亚硝基化。
117.本文所用的脱毒毒素和疫苗抗原具体设计用于在受试者中触发免疫反应，具体包括一种或多种抗原决定簇，其可能被抗体的结合位点识别或能够与hla的i类或ii类分子或其他抗原呈递分子(如cd1)的肽槽结合，因此可以作为特定t细胞的刺激剂。疫苗抗原具体包括一种或多种免疫相关表位，其在本文中理解为被受试者的免疫系统和/或相应抗体识别的结构。表位可以例如为b细胞表位或t细胞表位，例如cd4+t细胞表位或cd8+t细胞表位。
118.免疫反应或相应的中和抗体的中和活性可以在基于细胞的试验中和在体内进行检测。中和抗体可以例如通过在抗体存在下计算细菌滴度和/或通过在基于细胞的感染试验中检测细胞病变效应来确定。
119.可以使用葡萄球菌感染的体内模型测量保护性免疫反应。
120.术语“表达”以下列方式理解。包含表达产物(例如如本文所描述的脱毒seb毒素或疫苗抗原)所需的编码序列，以及控制序列(例如可操作地连接的启动子)的核酸分子可以用于表达目的。用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包括在载体中；然而，相关的dna也可以整合至宿主细胞染色体中。具体地，该术语指在合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如，用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源dna编码的蛋白质。
121.编码dna为编码特定多肽或蛋白质的特定氨基酸序列的dna序列。启动子dna为启动、调节，或以其他方式介导或控制编码dna表达的dna序列。启动子dna和编码dna可以来自相同的基因或来自不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物体。重组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中进行选择的标记(例如抗生素抗性)，以及一种或多种表达盒。
122.本文所用“载体”定义为在合适的宿主生物体中转录克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)和翻译它们的mrna所需要的dna序列。
[0123]“表达盒”是指编码表达产物的dna编码序列或dna片段，其可以在限定的限制性位
点插入至载体中。盒的限制性位点旨在确保该盒插入至正确的阅读框中。通常地，外源dna在载体dna的一个或多个限制性位点处插入，然后由载体与传播载体dna一起携带至宿主细胞中。具有插入或添加dna的dna片段或序列，例如表达载体，也可以称为“dna构建体”。
[0124]
表达载体包括表达盒以及额外地通常包括用于在宿主细胞中自主复制的原点或基因组整合位点、一种或多种选择标记(例如，氨基酸合成基因或赋予抗生素(如博莱霉素、卡那霉素、g418或潮霉素)抗性的基因)、多个限制性酶切位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组分可操作地连接在一起。如本文所用，术语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。载体常见的类型为“质粒”，通常为独立的双链dna分子，可以容易地接受额外的(外源)dna，并且可以容易地导入至合适的宿主细胞。质粒载体通常包含编码dna和启动子dna，并具有一个或多个适合插入外源dna的限制性位点。具体地，术语“载体”或“质粒”是指可以将dna或rna序列(例如，外源基因)引入至宿主细胞中，从而转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)的载体。
[0125]
如本文所用，术语“宿主细胞”应指经转化以产生特定重组蛋白的原代受试细胞及其任何后代。应当理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，但是，只要该后代保持与初始转化细胞相同的功能，那么此类改变的后代包括在此类术语中。术语“宿主细胞系”是指用于表达重组基因以制备重组蛋白的宿主细胞的细胞系。如本文所用，术语“细胞系”是指已建立的特定细胞类型的克隆，其已获得在很长一段时间内增殖的能力。此类宿主细胞或宿主细胞系可以在细胞培养物中维持和/或进行培养以制备重组多肽。
[0126]
本文所用的脱毒毒素和疫苗抗原具体以分离蛋白的形式提供。如本文所用，关于蛋白质的术语“分离的”或“分离”应指此类化合物已经从与其自然相关的环境中充分分离，从而以“纯化的”或“基本上纯的”形式存在。然而，“分离的”并不一定意味着排除人工或合成的融合物或者与其他化合物或材料的混合物，或者排除可能存在的不干扰基本活性的杂质(例如由于不完全纯化而存在)。分离的化合物可以进一步配制以制备其制剂，而其实际上仍然是分离的——例如，本文所描述的蛋白质混合物或各种融合蛋白可以与药学上可接受的载体混合，包括那些适用于分析、诊断、预防或治疗应用的载体，或者用于诊断、医疗或分析目的的赋形剂。
[0127]
如本文所用，术语“纯化的”应指包括至少50％(w/w总蛋白)、优选地至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物(例如，本文所描述的嵌合抗原)的制剂。高度纯化的产品基本上不含污染蛋白质，并且优选地具有至少70％的纯度，更优选地具有至少80％，或至少90％，或甚至至少95％，直至100％的纯度。通过适合于化合物的方法来测量纯度(例如色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc分析等)。本文所描述的分离的、纯化的蛋白质可以作为重组产物获得，该重组产物通过从表达产物的宿主细胞培养物中在细胞培养上清中纯化获得，以降低或去除宿主细胞杂质，或从细胞碎片中获得。
[0128]
以下用于获得纯化蛋白质的分离和纯化的方法均可使用：利用溶解度差异的方法，例如盐析和溶剂沉淀；利用分子量差异的方法，例如超滤和凝胶电泳；利用电荷差异的方法，例如离子-交换色谱法；利用特定亲和性的方法，例如亲和色谱法；利用疏水性差异的方法，例如反相高效液相色谱法；以及利用等电点差异的方法，例如等电聚焦。以下标准方法均可使用：例如通过微滤或切向流过滤器(tff)或离心对细胞(碎片)进行分离和洗涤；通
过沉淀或热处理进行蛋白质纯化；通过酶消化激活蛋白质；通过色谱法(例如离子交换(iex)、疏水相互作用色谱(hic)、亲和色谱、尺寸排阻(sec)或hplc色谱)对蛋白质进行纯化；通过超滤步骤对蛋白质进行沉淀浓缩和洗涤。分离和纯化的蛋白质可以通过常规方法进行鉴定，例如蛋白质印迹、hplc、活性测试或elisa。
[0129]
本文所用术语“核酸分子”是指包括多核苷酸序列的dna(包括例如cdna)或rna(包括例如mrna)分子。该分子可以为从5'至3'端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。该术语包括编码序列，例如基因、人工多核苷酸(例如包括在表达相应多肽序列的表达构建体中)。
[0130]
编码本文所描述的脱毒seb分子或疫苗抗原的核酸分子具体是通过天然存在的seb毒素序列的诱变(突变)提供的。缺失特定氨基酸的诱变涉及缺失一个或多个核苷酸。置换一种特定氨基酸的诱变可以涉及至少1或2个核苷酸的置换，其中包括所述置换核苷酸的密码子编码置换的氨基酸。在核苷酸被置换的情况下，优选在密码子内交换一个以上的核苷酸，以降低不需要的自发回复突变的风险。本文所描述的核苷酸序列和分子的密码子优化可涉及增加密码子内置换核苷酸的数量，从而例如提高突变体的稳定性，和/或避免仅通过一次自发核苷酸交换的回复突变。
[0131]
可以使用包括简并为任何序列的核苷酸序列的dna或rna分子，或包括简并序列组合的dna或rna分子，或包括密码子优化序列的dna或rna分子，以改善宿主中的表达。例如，可以使用大肠杆菌密码子优化序列。特定的rna分子可用于提供相应的rna疫苗。
[0132]
本文所描述的表达系统、基因构建体或修饰可以采用本领域已知的工具、方法和技术，例如“分子克隆：实验室手册(第3版)”(j.sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual(3rd edition),cold spring harbor laboratory,cold spring harbor laboratory press,new york(2001))中所描述的。表达载体可以包括但不限于克隆载体、修饰的克隆载体和专门设计的质粒。本文所描述的优选表达载体为适合于在细菌或真核宿主细胞中表达重组基因的表达载体，并根据宿主生物体对表达载体进行选择。合适的表达载体通常包括适合于在真核宿主细胞中表达编码重组蛋白的dna的调控序列。调控序列的例子包括启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点，以及控制转录和翻译起始和终止的序列。调控序列通常与待表达的dna序列可操作地连接。
[0133]
如本文所用，术语“天然存在的”应指在自然界中发现的那些元件、序列或产物，例如由天然的野生型生物体表达或在其中发现的。具体地，本文所描述的脱毒毒素或疫苗抗原包括非天然存在的突变(即人工(“人造”)的突变)，例如采用诱变技术产生的突变体。
[0134]
重组核酸可以具有非天然存在的序列，或者具有由两个分开的序列片段人工组合制成的序列。这种人工组合通常通过化学合成，或更常见地通过对分离的核酸片段进行人工操作，例如通过本领域熟知的基因工程技术来实现。例如，核酸可以用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸来进行化学合成，对核苷酸进行修饰旨在增加分子的生物稳定性或增加杂交形成双链的物理稳定性。
[0135]
可以通过例如将一定数量的点突变引入亲本aa序列中来提供蛋白质突变体，例如包括如本文所描述的脱毒突变的蛋白质突变体。具体地，使用诱变方法引入一个或多个点突变。
[0136]
如本文所用，术语“脱毒突变”应指在天然存在的(野生型)seb毒素的t细胞受体结
合区域或免疫球蛋白超家族结合区域中一个或两个区域内的一个或多个点突变。此类区域在本文中也称为“核心区域”。seb毒素的任何其他区域在本文中也称为“非核心区域”。脱毒突变降低、减少或消除蛋白质的毒性，从而提高对受试者施用的安全性。
[0137]
如本文所描述的点突变通常为核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的缺失、插入和/或置换中的至少一种，以实现在由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列中的某个确定位置处的一个(仅单一个)氨基酸的缺失、插入和/或置换。因此，本文所用术语“点突变”应指核苷酸序列或氨基酸序列的突变。具体地，优选的点突变为置换，特别是非保守性或保守性置换。保守性置换是在侧链和化学性质相关的氨基酸家族中发生的置换。此类家族的例子为具有碱性侧链、酸性侧链、非极性脂肪族侧链、非极性芳香族侧链、不带电荷的极性侧链、小侧链、大侧链等的氨基酸。在此方面，氨基酸是指由六十四种三联体密码子编码的二十种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可分为带中性电荷、带正电荷和带负电荷的氨基酸。优选的点突变是指不同极性和/或电荷的氨基酸的交换。
[0138]
具体诱变方法提供序列中一个或多个核苷酸的点突变，在一些实施例中为串联点突变，例如改变亲本核苷酸序列内的至少2、3、4或5个，或者甚至更多个连续的核苷酸。
[0139]
如本文所用，术语“诱变”应指制备或提供核苷酸序列变体和由所述核苷酸序列编码的相应蛋白质的方法，例如，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换，以便获得其在编码区中具有至少一个变化的变体。诱变可以通过定点、随机或半随机进行。诱变方法可以包括工程化核酸或使用相应的亲本序列信息作为模板从头合成核苷酸序列的方法。例如，可以通过诱变选择的亲本核苷酸序列来制备核苷酸序列文库。可以产生变体文库并根据具体需要的基因型或表型选择合适的突变蛋白序列。
[0140]
根据具体实施例，本文所用的任何脱毒毒素和疫苗抗原可以作为重组蛋白制备，例如通过重组dna技术制备。如本文所用，术语“重组”是指非天然存在于宿主细胞中的分子或构建体。在一些实施例中，重组核酸分子包含两个或多个天然存在的序列，它们以非天然存在的方式连接在一起。重组蛋白质是指由重组核酸编码和/或表达的蛋白质。在一些实施例中，“重组细胞”表达的基因没有以相同的形式存在于细胞的天然(即非重组)形式中；和/或“重组细胞”表达天然的基因，该基因由于有意的人为干预而异常地过度表达、低表达和/或完全不表达。重组细胞包含至少一种重组多核苷酸、多肽或蛋白质。“重组(recombination，recombining)”和产生“重组(recombined)”的核酸通常包括至少两个核酸片段的组装。
[0141]
如本文所用，术语“重组”具体是指“通过基因工程制备或基因工程的结果”，即通过人为干预。重组核苷酸序列可以通过在亲本核苷酸序列中引入一个或多个点突变来进行工程化，并且可以在包括含有此类重组核苷酸序列表达盒的重组宿主细胞中进行表达。分别由此类表达盒和宿主细胞表达的多肽也认为是“重组的”。为了本文所描述的目的，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。本文所描述的具体实施例是指嵌合抗原的制备，以及用于此类制备的重组方式，包括编码氨基酸序列的核酸、表达盒、包括编码待表达氨基酸序列的核酸的载体或质粒，以及包括任何此类方式的宿主细胞。合适的标准重组dna技术为本领域已知，尤其在“分子克隆：实验室手册”(1989年)，第2版中有所描述(sambrook et al.,“molecular cloning:a laboratory manual”(1989),2nd edition(cold spring harbor laboratory press))。
[0142]
在本文中，术语“受试者”理解为包括人类或哺乳动物受试者，包括家畜、伴侣动物和实验室动物，具体为人类，受试者为患有特定疾病状况的患者或健康受试者。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人类和其他哺乳动物受试者。如本文所用，术语“患者”总是包括健康受试者。
[0143]
具体地，本文所描述的治疗和医疗用途适用于需要预防或治疗与葡萄球菌感染和/或污染相关的疾病状况的受试者。具体地，治疗可以通过干预疾病状况的发病机制，其中葡萄球菌属为该疾病状况的致病因子。受试者可以是处于此类疾病状况风险或患有此类疾病的受试者。
[0144]
金黄色葡萄球菌细菌或毒素引起的一些常见疾病状况或病症的非限制性例子包括烧伤、蜂窝组织炎、皮肤坏死、眼睑感染、食物中毒、关节感染、肺炎、皮肤感染、手术伤口感染、烫伤皮肤综合征和中毒性休克综合征。一些疾病状况可能与毒素对细胞功能和细胞损伤或裂解的直接、间接或继发影响有关。
[0145]
根据具体的方面，本文所描述疫苗靶向的葡萄球菌属选自人类致病性葡萄球菌属，或引起人类感染的那些葡萄球菌属。在实施例中，葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、路邓葡萄球菌(staphylococcus lugdunensis)和/或腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)，特别包括抗生素抗性的种属，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，以及包括可在感染期间进化的突变病原体，或人工进化的突变体。
[0146]
在具体实施例中，提供了治疗方法以预防受试者被葡萄球菌属感染，和/或改善可能在有葡萄球菌并发症风险的受试者中出现的疾病状况。本文所描述的疫苗制剂可以具体用于治疗与葡萄球菌感染相关的疾病或病症，尤其是抗生素抗性种类的感染，包括皮肤感染、蜂窝组织炎、肺炎、脑膜炎、尿路感染、中毒性休克综合征、心内膜炎、心包炎、骨髓炎、菌血症或败血症。本文所描述的疫苗制剂还可用于预防可能在外科手术期间或之后出现的葡萄球菌感染和/或葡萄球菌并发症，例如涉及植入起搏器、人造心脏瓣膜、关节植入物或假体的外科手术。在某些实施例中，假体可以为假肢，例如手臂或腿。在某些实施例中，假体可以为髋关节置换物。在某些实施例中，假体可以为美容假体，例如但不限于眼假体、硅胶手、手指、乳房、脚、脚趾或面部植入物。在一些实施例中，进行治疗的受试者是已经接受或计划接受外科手术的受试者，其中该受试者有遭受葡萄球菌感染和/或葡萄球菌并发症的风险。
[0147]
葡萄球菌并发症具体是与金黄色葡萄球菌菌血症或中毒有关的并发症。尽管大多数葡萄球菌感染并不严重，但金黄色葡萄球菌可引起严重感染，例如血流感染、肺炎，或骨和关节感染，例如包括急性并发症(例如败血症、中毒性休克综合征(tss)、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血等)，或慢性(包括复发)疾病(例如骨髓炎、心内膜炎、留置装置感染和伤口感染)。有金黄色葡萄球菌感染并发症风险的患者包括接受血液透析的患者、注射吸毒者、糖尿病患者，以及鼻腔携带金黄色葡萄球菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的患者，和/或先前存在心脏疾病或其他合并症的患者。
[0148]
术语对某种疾病状况“有风险”是指受试者可能发展此类疾病状况，例如，由于某种易感体质、暴露于葡萄球菌细菌或毒素中，或者已经患有处于各个阶段的相应疾病状况，特别是与其他致病疾病状况或其他由病毒感染引起的疾病状况或并发症有关的疾病状况。
[0149]
如本文所用，术语“治疗”应当总是指出于预防性(即，预防感染和/或疾病状态)或
治疗性(即，治疗疾病而不考虑其发病机制)目的而对受试者进行治疗。
[0150]
如本文所用，术语“预防”是指预防措施，其旨在包括对发病机制的预防或降低发病机制风险的预防措施。
[0151]
如本文所用，关于治疗受试者的术语“疗法”是指以治愈、改善、稳定、降低发病率或预防疾病、病理状况或病症为目的的对受试者的医学管理，此类疾病、病理状况或病症被单独或一起理解为“疾病状态”。
[0152]
本文所描述的疫苗具体包括有效量的脱毒seb毒素或疫苗抗原，本文具体理解为“免疫有效量”。“免疫有效量”是指基于治疗或预防性治疗的目的，以单次剂量或作为系列剂量的一部分向受试者施用的有效的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间内，有效达到所需预防结果的量，例如预防目标葡萄球菌细菌感染或葡萄球菌并发症，或抑制由葡萄球菌细菌或毒素直接或间接引起的疾病。该量将根据待治疗受试者的健康和身体状况、年龄、受试者免疫系统合成抗体的能力、所需免疫反应的类型和程度、疫苗的制剂和其他条件而变化。
[0153]
有效量或剂量可以在0.0001至2mg的范围内，例如0.001至2mg的疫苗抗原施用于有需要的受试者，例如成人受试者。例如，疫苗抗原的有效剂量能够在受试者中引发具有有效抗体滴度水平的免疫反应，以结合和中和一种或多种目标葡萄球菌细菌或毒素，例如，在免疫后1-3个月。有效性可以通过取自受试者的血液样品中的相应抗体滴度来测定。
[0154]
在一些实施例中，有效量为当作为特定给药方案的一部分施用时与有益效果相关的量，例如，在诸如“加强”方案中的单次施用或系列施用。对于治疗，本文所描述的疫苗可以施用一次，或者可以分成单独的组分和/或多个较小的剂量以在间隔时间内施用。通常地，对受试者通过第一次注射本文所描述的疫苗进行初免后，可以在一段时间内通过相同或不同的施用途径进行一次或多次加强注射。在使用多次注射的情况下，后续的注射例如可以在前一次注射的1至52周内进行。
[0155]
本文所描述的疫苗可以在免疫原性制剂中包括脱毒seb毒素或疫苗抗原。具体实施例包括一种或多种佐剂和/或药学上可接受的赋形剂或载体。
[0156]
适用于促进某些施用方式的药物载体为本领域熟知。具体实施例涉及免疫原性制剂，其包括药学上可接受的载体和/或佐剂，其触发体液(b细胞、抗体)或细胞毒性(t细胞)免疫反应。佐剂可以具体用于增强疫苗的有效性。佐剂可以直接添加到疫苗组合物中或可以单独施用，或者与施用疫苗抗原同时或在施用疫苗抗原之前或之后不久施用。
[0157]
如本文所用，术语“佐剂”具体是指以下化合物：当联合施用时增强抗原和/或重新定向对抗原的免疫反应，但当单独施用时不会产生对抗原的免疫反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫反应，包括淋巴细胞募集、刺激b细胞和/或t细胞，以及刺激巨噬细胞。
[0158]“有效量”的佐剂可用于本文所描述的疫苗中，该“有效量”具体理解为增强对免疫原的免疫应答的量，例如，需要更低或更少剂量的免疫原性组合物以产生特定的免疫反应以及预防或对抗细菌感染、中毒或疾病的相应效果。
[0159]
术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种无毒的，不会干扰活性成分的生物活性有效性的物质，其包括但不限于缓冲溶液、防腐剂、相容性载体和任选的其他添加剂或包封物质。术语“载体”是指天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与载体结合以利于应用。药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体或相关组合物或组合生理相容的任
何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的具体例子包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、聚乙二醇等，以及其任意组合。另外的药学上可接受的载体为本领域已知，例如在“雷明顿：药学科学与实践，第22修订版”(remington:the science and practice of pharmacy,22nd revised edition(allen jr,lv,ed.,pharmaceutical press,2012))中有所描述。液体制剂可以为溶液、乳液或悬浮液，并且可以包括赋形剂，例如助悬剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。示例性的载体为载体蛋白，例如选自破伤风类毒素、白喉类毒素和crm
197
，或脂质体或阳离子肽；示例性的佐剂为明矾、磷酸铝或氢氧化铝、mf59或cpg寡核苷酸。进一步的佐剂包括(非)完全弗氏佐剂、百日咳杆菌(b.pertussis)或其毒素、或ic31。
[0160]
优选的制剂为即用型、储存稳定的形式，保质期至少为一年或两年。本发明还提供了预填充有本文所描述疫苗的递送装置，例如注射器。
[0161]
本文所描述的疫苗可以通过疫苗领域已知的常规途径施用，例如通过粘膜(例如眼、鼻、肺、口腔、胃、肠、直肠、阴道或泌尿道)表面，通过肠胃外(例如皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内)途径，或局部施用(例如，通过贴片)。施用途径的选择取决于许多参数，例如与多肽相关的佐剂。如果使用粘膜佐剂，则优选鼻内、口服或吸入途径。如果使用脂质制剂或铝化合物，则优选肠胃外途径，最优选皮下或肌肉内途径。
[0162]
注射制剂可以包括用于皮下、皮内和肌肉内注射的剂型等。这些注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂例如可以通过将蛋白质溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为注射用水性介质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，它们可以与适当的增溶剂组合使用，适当的增溶剂例如为醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)、hco-50(氢化蓖麻油聚氧乙烯(50mol)醚加成物)等。作为油性介质，例如采用芝麻油、大豆油等，可与苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。按此制备的注射剂优选填充在适当的安瓿瓶中。
[0163]
参考以下实施例将更充分地理解前述描述。然而，这些实施例仅代表实施本发明一个或多个实施例的方法，而不应理解为限制本发明的范围。
[0164]
实施例
[0165]
实施例1：制备seb突变体、疫苗抗原和制剂
[0166]
seb毒素基因从金黄色葡萄球菌中分离(atcc 14458，毒素序列seq id no:1；核苷酸序列seq id no:2)，并经过基因修饰以丧失其毒性。对决定免疫球蛋白超家族和t细胞受体结合位点的特定氨基酸在dna水平上进行改变，使得seb蛋白不能结合至以上任一受体，并且丧失其毒性特性。
[0167]
tcr结合位点的诱变通过氨基酸第22至24位的缺失来进行。免疫球蛋白超家族结合区域通过将氨基酸45位从亮氨酸交换为精氨酸而进行突变。将seb单突变体和双突变体与野生型进行比较。图1中提供了相应的序列。
[0168]
使用pet-9d质粒(novagen)在大肠杆菌bl21-ai(invitrogen)中表达seb野生型及其突变体，并测试与野生型seb相比的免疫原性和无毒性。重组蛋白通过色谱法纯化，并与al(oh)3配制成疫苗。
[0169]
制备串联重复构建体，得到1428个核苷酸的编码序列，以表达用作疫苗抗原的重
组脱毒seb串联变体。
[0170]
seb突变
[0171]
a)seq id no:1中的aa22-24缺失
[0172]
使用反向引物结合至需要缺失的上游和使用正向引物结合至需要缺失的下游，将9个核苷酸进行缺失。在两个不同的pcr反应中，野生型dna从dna的5'端扩增至缺失处以及从缺失处扩增至3'端。将两个片段连接起来，在最终的pcr中扩增缺失突变体。
[0173]
所得核苷酸序列被鉴定为seq id no:4，其编码蛋白质序列seq id no:3。
[0174]
b)seq id no:1中的l45r突变
[0175]
使用内部反向引物进行点突变l45r，其中密码子cta突变为aga。在两个不同的pcr反应中，野生型dna从dna的5'端扩增至点突变处以及从突变处扩增至3'端。将两个片段连接起来，在最终的pcr中扩增缺失突变体。
[0176]
所得核苷酸序列被鉴定为seq id no:15，其编码蛋白质序列seq id no:16。
[0177]
c)双突变体和串联突变体：seb del 22-24+l45r(也称为seb del22-24 l45r)
[0178]
相应地制备了以下双突变体和串联突变体。
[0179]
seb del 22-24,l45r
[0180]
seb del 22-24,q43p
[0181]
seb del 22-24,f44p
[0182]
seb del 22-24,f44s
[0183]
使用各种接头序列的串联seb del22-24,l45r
[0184]
在串联双突变体中，两个双突变体分子使用接头序列融合。示例性的构建体编码seq id no:13，其在串联重复之间包括双氨基酸接头(lys-leu)。
[0185]
以下seb双突变(del 22-24和l45r)的串联重复构建体如上所述使用不同的接头序列来制备，每个构建体称为rseb变体疫苗。构建体1包括ggg接头，构建体2-4各自包括由两个氨基酸组成的接头，两个氨基酸选自his、met、lys、leu、gly和thr。图1中提供了以上序列。
[0186]
构建体1
[0187]
构建体2
[0188]
构建体3
[0189]
构建体4
[0190]
实施例2：安全性
[0191]
通过以下标准检测来确定毒性：
[0192]
a)人类外周血单核细胞(pbmc)中的t细胞增殖，通过3h-胸腺嘧啶核苷掺入检测；
[0193]
b)t细胞激活，以剂量依赖性的il-2细胞因子释放作为结果；和
[0194]
c)人类pbmc中的炎症反应；检测剂量依赖性的il-6释放和tnfα释放。
[0195]
结果在图2-6和图10-11中提供。与seb野生型毒素相比，突变体seb del 22-24和seb del 22-24l45r大幅降低了人类外周血单核细胞(pbmc)中的t细胞增殖。即使在高浓度下，双突变变体seb del 22-24l45r和seb del 22-24均不会激活t细胞，并且与未刺激的细
胞相比，il-2细胞因子的释放也没有增加。人类pbmc中的il-6释放和tnfα释放是剂量依赖性的，并且由于seb del 22-24突变而大大降低。图4-6显示了与seb del l45r相比，seb del22-24显示出改善的毒性特征。
[0196]
高达10μg/ml的seb del 22-24l45r在人类pbmc中未显示出对t细胞的激活，也未显示出对il-2基因的激活。当以推注方式对兔进行给药时，未检测到毒性迹象。
[0197]
由体外和体内毒性测试所证明的，融合构建体1-4中的每种均是无毒的：高达10μg/ml的四种构建体均没有诱导激活人类pbmc的t细胞。所有串联构建体既不诱导il-2的基因激活和il-2释放，也不诱导促炎细胞因子(ifnγ、il-6、tnfα)的基因激活或分泌。当对兔进行推注或对小鼠进行高剂量给药时，未检测到毒性迹象。
[0198]
实施例3：小鼠和兔的免疫原性和保护
[0199]
使用1mg al(oh)3作为佐剂，用10μg、30μg或100μg rseb变体构建体1至4对兔进行四次免疫。通过elisa分析血清，通过中和试验测定中和抗体(用兔抗血清抑制t细胞的激活)。
[0200]
在兔的免疫模型中诱导保护性免疫。使用标准检测制备抗血清并测试其保护性。
[0201]
结果如图7-9所示。
[0202]
seb del 22-24l45r实现了结合滴度和中和滴度。甚至所有测试的串联重复构建体1-4(rseb变体构建体)均使seb del 22-24l45r的免疫原性得到改善。构建体3显示了最好的结果。
[0203]
图12显示了用100μg的串联seb del 22-24l45r构建体+1mg al(oh)3免疫后的elisa滴度(平均值，n＝8)。
[0204]
使用seb del 22-24l45r和rseb变异构建体进行3次或4次免疫后，对30μg和100μg seb毒素的攻击实现了保护。
[0205]
小鼠和兔的保护性免疫
[0206]
用各种剂量(1μg至30μg)的rseb变体构建体对小鼠免疫两次或三次。最后一次免疫后两周，用20μg seb毒素攻击小鼠，4小时后用40μg lps攻击小鼠。所有受攻击的小鼠均存活(见表3和表4)。
[0207]
表3.用seb毒素和lps攻击免疫两次的小鼠
[0208]
免疫攻击死亡小鼠数/受攻击小鼠数2
×
1μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/82
×
3μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/102
×
10μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/102
×
30μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/10
[0209]
表4.用seb毒素和lps攻击免疫三次的小鼠
[0210]
免疫攻击死亡小鼠数/受攻击小鼠数3
×
1μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/103
×
3μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/103
×
10μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/103
×
30μg rseb变体20μg seb+10μg lps0/10
[0211]
用rseb变体构建体在小鼠中进行两次和三次免疫后，以及在兔中进行三次免疫
后，用seb毒素和lps攻击，证明了rseb变体构建体的保护作用。用30μg rseb变体构建体3+1mg al(oh)3对兔进行免疫三次。最后一次免疫后10天，用30μg seb毒素攻击兔，4小时后用10μg lps攻击兔。所有三只兔均在攻击中存活。
[0212]
实施例4：包括aa22-24缺失的rseb的改善的耐受性
[0213]
毒性：比较用以下任一种刺激人类pmnc的增殖：
[0214]
wtseb(天然seb)，
[0215]
seb n23l l45r y91p q210l
[0216]
seb del 22-24
[0217]
seb del22-24 l45r y91p q210l。
[0218]
参考图13。
[0219]
与没有任何氨基酸22-24缺失的四点突变体seb n23l l45r y91p q210l相比，突变体seb del22-24 l45r y91p q210l显示出降低的毒性。缺失突变体del22-24显示出与seb del22-24l45r y91p q210l相当的毒性，并且与四点突变体seb n23l l45r y91p q210l相比毒性更低。
[0220]
讨论：与n23l的置换相比，包括在氨基酸第21-25位内的缺失(在本实施例中为aa22-24的缺失)的seb突变体改善了耐受性。此类效应独立于mhc ii类受体结合区域在第45、91和210位处的额外点突变。
技术特征：1.脱毒葡萄球菌外毒素b(seb)毒素，其突变为在seb毒素序列seq id no:1的氨基酸第21至25位包括至少两个点突变，其中所述至少两个点突变包括aa21-22、aa22-23、aa23-24、aa24-25、aa21-23、aa22-24或aa23-25中的任何缺失，或者在任何其他天然存在的seb毒素序列中的相应氨基酸位置包括所述至少两个点突变，所述天然存在的seb毒素序列与seq id no:1具有至少95％的序列同一性。2.根据权利要求1所述的脱毒seb毒素，其包括或由以下序列组成：seq id no:3或其脱毒seb变体序列，所述seq id no:3与seq id no:1的区别在于aa22-24的缺失，所述脱毒seb变体序列包括所述aa22-24的缺失并与seq id no:3具有至少95％的序列同一性。3.根据权利要求1或2所述的脱毒seb毒素，其包括一个或多个进一步的点突变，所述点突变包括在选自以下位置的至少一个氨基酸的置换：在l45、q43或f44处；优选地为l45r、q43p、f44p或f44s；优选地，其中所述脱毒seb毒素包括或由以下任一序列组成：seq id no:5、7、9或11，或者前述任一序列的脱毒seb变体序列，所述脱毒seb变体序列在氨基酸第21至25位包括所述至少两个点突变并与前述任一序列具有至少95％的序列同一性。4.保护性疫苗抗原，其包括至少一种根据权利要求1至3中任一项所述的脱毒seb毒素分子；优选地与葡萄球菌疫苗抗原组合，所述葡萄球菌疫苗抗原与所述脱毒seb毒素分子相同或不同；任选地其中所述组合以融合物、混合物或复合物提供，其包括所述分子和抗原，所述分子和抗原彼此结合和/或结合至载体，从而形成复合物。5.根据权利要求4所述的疫苗抗原，其中所述至少一种脱毒seb毒素分子与另一种脱毒seb毒素分子融合；任选地包括接头序列；优选地包括或由以下任一序列组成：seq id no:13、31、33或35，或者前述任一序列的疫苗抗原变体序列，所述疫苗抗原变体序列在氨基酸第21至25位包括所述点突变并与前述任一序列具有至少95％的序列同一性。6.保护性疫苗制剂，其包括根据权利要求4或5所述的抗原，和药学上可接受的载体；优选地包括佐剂。7.根据权利要求6所述的疫苗制剂，其中所述佐剂选自：不溶性金属盐，吡喃葡萄糖基脂质a佐剂，作为先天免疫刺激剂的佐剂系统，例如as01、as03或as04，mf59，tcr刺激剂，例如toll-样受体激动剂或cpg寡核苷酸；优选地，所述佐剂选自明矾、氢氧化铝或磷酸铝。8.根据权利要求6或7中任一项所述的疫苗制剂，其以用于肌肉内、皮下、鼻内、粘膜、口服、微针皮肤、透皮、舌下、气溶胶或吸入施用的制剂形式提供。9.根据权利要求6至8中任一项所述的疫苗制剂，其为包括所述疫苗抗原与一种或多种葡萄球菌超抗原类毒素抗原组合的多价疫苗；优选地所述葡萄球菌超抗原类毒素抗原选自：tsst-1、α-溶血素、γ-溶血素、β-溶血素和葡萄球菌外毒素或肠毒素，例如肠毒素a(sea)、肠毒素c(sec)、肠毒素i(sei)和肠毒素k(sek)。10.根据权利要求6至9中任一项所述的疫苗制剂，其用于预防或治疗表达葡萄球菌超抗原的细菌的感染，和/或由暴露于葡萄球菌超抗原毒素直接或间接介导的疾病状况。11.根据权利要求10所用的疫苗制剂，其中患者用所述疫苗制剂进行免疫，所述患者在对疾病的外科手术干预或侵入性治疗后有葡萄球菌并发症的风险；优选地其中所述疾病状况为由革兰氏阳性细菌、病毒或真菌病原体的微生物介质或毒素诱导的败血症状况；优选地其中所述败血症状况为败血症、中毒性休克综合征(tss)或败血性休克。12.权利要求1至3中任一项所述的脱毒seb毒素或权利要求4或5所述的疫苗抗原在以
下方法中的用途：a)制备疫苗制剂，或b)制备特异性识别seb毒素的抗体。13.制备权利要求1至3中任一项所述的脱毒seb毒素或权利要求4或5所述的疫苗抗原的方法，通过在重组宿主细胞中表达编码相应毒素或抗原的核酸序列，以及分离和任选地纯化相应的毒素或抗原。14.编码权利要求1至3中任一项所述的脱毒seb毒素或权利要求4或5所述的疫苗抗原的核酸分子；优选地其包括或由以下任一序列组成：seq id no:2、4、6、8、10、12、14、32、34或36，或者前述任何序列的密码子优化变体。15.重组宿主细胞，其包括在表达构建体中的权利要求14所述的核酸分子。
技术总结脱毒葡萄球菌外毒素B(SEB)毒素，其突变为在SEB毒素序列SEQ ID NO:1的氨基酸第21至25位包括至少两个点突变，其中所述至少两个点突变包括aa21-22、aa22-23、aa23-24、aa24-25、aa21-23、aa22-24或aa23-25中的任何缺失，或者在任何其他天然存在的SEB毒素序列中的相应氨基酸位置包括所述至少两个点突变，所述天然存在的SEB毒素序列与SEQID NO:1具有至少95％的序列同一性。序列同一性。
技术研发人员：M
受保护的技术使用者：生物医学研究及生物制品公司
技术研发日：2021.11.03
技术公布日：2022/12/1
