线粒体加强疗法的制作方法

线粒体加强疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2020年11月25日提交的美国序列号63/118,569和于2020年3月31日提交的美国序列号63/003,174的权益，两者的全部内容通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
3.本发明总体上涉及与线粒体富集的细胞，更具体地涉及用于增进干细胞植入、增殖、归巢或存活以及改变干细胞分化模式的方法和组合物。


背景技术：

4.线粒体是在大多数真核细胞中存在的膜结合细胞器，直径范围从0.5至1.0μm。线粒体存在于几乎所有的真核细胞中，并且数量和位置因细胞类型而异。线粒体含有其自己的dna(mtdna)和其自己的用于合成rna和蛋白的机制。mtdna仅含有37个基因，因此哺乳动物体内的大多数基因产物由核dna编码。
5.线粒体在真核细胞中执行许多基本任务，诸如丙酮酸氧化、克雷布斯循环和氨基酸、脂肪酸和类固醇的代谢。然而，线粒体的主要功能是通过电子传递链和氧化磷酸化系统(“呼吸链”)生成作为三磷酸腺苷(atp)的能量。线粒体参与的另外的过程包括产热、钙离子的储存、钙信号传导、程序性细胞死亡(凋亡)和细胞增殖。
6.细胞内的atp浓度通常为1至10mm，并且atp可以通过使用单糖和复合糖(碳水化合物)或脂质作为能源的氧化还原反应产生。对于要合成为atp的复合燃料，其首先需要分解成更小、更简单的分子。复合碳水化合物水解成单糖，诸如葡萄糖和果糖。脂肪(甘油三酯)被代谢产生脂肪酸和甘油。
7.将葡萄糖氧化成二氧化碳的整个过程被称为细胞呼吸，并且可以从单个葡萄糖分子产生约30个atp分子。atp可以通过许多不同的细胞过程产生。三种用于在真核生物中生成能量的主要途径是糖酵解和柠檬酸循环/氧化磷酸化(两者都是细胞呼吸的组成部分)和β氧化。
8.由非光合真核生物造成的这种atp产生大部分发生在线粒体中，该些线粒体可占典型细胞总体积的将近25％。已知各种线粒体病症由线粒体dna中有缺损的基因引起。
9.白细胞是免疫系统的细胞，其参与保护身体免受感染性疾病和外来侵略者两者的侵害。白细胞包含不同类型的细胞，其可以通过其物理和功能特性进行区分。
10.骨髓是新血细胞产生或造血的主要部位。所有类型的造血细胞，包括白细胞，都是在骨髓中产生的。骨髓衰竭是不同疾病(例如，范可尼贫血)的主要病理特征。造血干细胞(hsc)移植疗法可以施用于需要治疗的受试者，以使在患有干细胞病症(例如，粘多糖贮积赫勒氏症)的患者中有缺陷的(deficient or defective)血细胞谱系等一种或多种血细胞类型增殖或再增殖。然而，虽然hsc具有显著的治疗潜力，但阻碍其在临床中使用的限制是与确保造血干细胞移植物在宿主中的植入相关的困难。
11.患者自身的免疫系统经常攻击外源性(自体、同种异体或同源)移植细胞并介导移植造血干细胞的排斥反应。为了避免排斥反应，在造血干细胞移植之前用免疫系统破坏剂治疗患者，例如，化疗剂或放射。不幸的是，在患者中诱导造血干细胞移植耐受性的努力经常导致严重的并发症。因此，需要新的组合物和方法来改善造血干细胞移植。
12.白细胞可分为两个主要类别——成髓细胞和成淋巴细胞。淋巴细胞是白细胞的一种亚型，包括自然杀伤细胞(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中发挥作用)、t细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和b细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。髓细胞是粒细胞系列中的年轻细胞，通常存在于骨髓中。髓细胞成熟为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，所有这些细胞都在免疫系统中起着重要作用。改变骨髓中淋巴样细胞和髓样细胞的产生率可导致诱导特异性免疫系统响应的能力。有许多已知与低淋巴细胞计数有关的疾病和病症。另外地，据报道，随着年龄的增长，免疫功能下降和循环淋巴细胞频率改变。
13.迄今为止，仍然需要新颖且安全的方法来提高白细胞含量，改善免疫缺陷系统的功能以及治疗各种疾病和病症。


技术实现要素：

14.本发明基于与线粒体富集的细胞对治疗疾病和病症有用的重大发现。本发明提供了使骨髓提高白细胞产生率的方法和组合物。具体地，本发明提供了用于通过提供线粒体富集的细胞来提高受试者体内cd45+细胞水平的方法和组合物。进一步地，本技术提供了用于增加骨髓细胞结构、cd34+细胞的植入和造血干细胞的分化的方法。
15.在一个实施例中，本发明提供了一种提高受试者体内白细胞的水平的方法，其包括从患有疾病或病症的受试者或从供体获得靶细胞；获得外源性线粒体；通过在允许外源性线粒体进入靶细胞的条件下使靶细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞；以及向受试者施用线粒体富集的靶细胞；其中该线粒体富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于靶细胞的线粒体含量，从而提高受试者体内白细胞的水平。
16.本发明还提供了使骨髓增加淋巴样细胞与髓样细胞的比例的方法和组合物。进一步地，本发明提供了用于改变cd3+细胞、cd14+细胞、cd19+细胞、cd33+细胞水平的方法和组合物。本发明还提供了提高相对于cd33+细胞的水平的cd3+细胞的水平。在一些实施例中，本发明还提供了提高cd19+的水平。
17.在一个实施例中，本发明提供了一种提高受试者体内白细胞水平的方法，其包括从患有疾病或病症的受试者或从健康供体获得靶细胞；获得外源性线粒体；通过在允许所述外源性线粒体进入靶细胞的条件下使靶细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞；以及向受试者施用线粒体富集的靶细胞；其中该线粒体富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于靶细胞的线粒体含量，由此引起受试者体内从髓样细胞向淋巴样细胞的转变。
18.在一个方面，靶细胞是多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞、cd34+细胞或其任何组合。在某些方面，靶细胞是cd34+细胞。在另外的方面，靶细胞从全血、血液部分、外周血、pbmc、血清、血浆、脂肪组织、胎盘、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓获得。在另外的方面，靶细
胞来自供体。在进一步的方面，靶细胞和/或外源性线粒体是自体的。
19.在某些方面，受试者患有疾病或病症。在一些方面，疾病或病症是年龄相关性病症、癌症、肌肉疾病和病症、糖原贮积疾病和病症、血管内皮病症或疾病、脑病症或脑疾病、胎盘病症或胎盘疾病、胸腺病症或胸腺疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病或肾脏病症、原发性线粒体疾病、胰腺病症或胰腺疾病、前列腺病症或前列腺疾病、肾脏病症或肾脏疾病、血液病症或血液疾病、心脏疾病或心脏病症、皮肤病症或皮肤疾病、免疫和炎性疾病和病症、骨疾病或骨病症、胃肠疾病或胃肠病症、眼部疾病或眼部病症或感染。
20.在进一步的方面，外源性线粒体是分离的冻融人类线粒体。在进一步的方面，外源性线粒体从人类细胞或人类组织衍生。在一些实施例中，人类细胞或人类组织选自由以下组成的组：胎盘、在培养物中培育的胎盘细胞和血细胞。在一些实施例中，人类细胞是人类干细胞。在一些实施例中，人类细胞是人类体细胞。在某些方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件包含在范围从约16至37℃的温度下将靶细胞与外源性线粒体一起温育范围从约0.5小时至30小时的时间。在另外的方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。在一个方面，外源性线粒体构成线粒体富集的靶细胞中总线粒体含量的至少1％。
21.在一个方面，线粒体富集的靶细胞的外源性线粒体含量通过选自由以下组成的组的测定来确定：至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；柠檬酸合酶的活性水平；氧(o2)消耗率；三磷酸腺苷的产生率；线粒体dna含量、异质性水平及其任何组合。
22.在另外的方面，线粒体富集的靶细胞的施用是通过静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内和肌肉内施用。在进一步的方面，将至少5
×
105至5
×
109个线粒体富集的靶细胞施用于受试者。在某些方面，在施用于受试者之前，将药学上可接受的载体添加到线粒体富集的靶细胞中。在另一方面，线粒体富集的靶细胞表达cd45。
23.在某些方面，与线粒体富集之前的靶细胞相比，该线粒体富集的靶细胞具有提高的至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白含量；提高的氧(o2)消耗率；提高的柠檬酸合酶活性水平；提高的三磷酸腺苷(atp)产生率、提高的线粒体dna含量；较低的异质性水平；或其任何组合。
24.在另一实施例中，本发明提供了一种用于提高受试者体内淋巴样细胞水平的药物组合物，其包含线粒体富集的靶细胞和药学上可接受的载体，其中线粒体富集的靶细胞富集有外源性线粒体。
25.在一个方面，通过包含以下步骤的方法来产生线粒体富集的靶细胞：从罹患疾病或致衰弱病症的受试者或从健康供体获得靶细胞；从供体获得外源性线粒体；以及通过在允许外源性线粒体进入靶细胞的条件下使靶细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞，其中线粒体富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于靶细胞的线粒体含量。
26.在某些方面，靶细胞是多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞、cd34+细胞或其任何组合。在具体的方面，靶细胞是cd34+细胞。在另外的方面，靶细胞从全血、血液部分、外周血、pbmc、血清、血浆、脂肪组织、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓获得。在某些方面，靶细胞对受试者是同种异体、自体或同源的。在一些方面，分离的线粒体是自体的。
27.在一个方面，外源性线粒体是分离的或部分纯化的冻融人类功能性线粒体。
28.在另外的方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。在另一方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件包含在范围从约16至37℃的温度下将靶细胞与外源性线粒体一起温育范围从约0.5小时至30小时的时间。在另外的方面，线粒体富集的靶细胞的线粒体含量通过选自由以下组成的组的测定来确定：至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；柠檬酸合酶的活性水平；氧(o2)消耗率；三磷酸腺苷的产生率；线粒体dna含量及其任何组合。
29.在进一步的方面，与线粒体富集之前的靶细胞相比，线粒体富集的靶细胞具有提高的至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；提高的氧(o2)消耗率；提高的柠檬酸合酶活性水平；提高的三磷酸腺苷(atp)产生率；提高的线粒体dna含量；较低的异质性水平；或其任何组合。
30.在一个方面，受试者患有疾病或病症。在另外的方面，疾病或病症是年龄相关性病症、癌症、肌肉疾病和病症、糖原贮积疾病和病症、血管内皮病症或疾病、脑病症或脑疾病、胎盘病症或胎盘疾病、胸腺病症或胸腺疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病或肾脏病症、原发性线粒体疾病、胰腺病症或胰腺疾病、前列腺病症或前列腺疾病、肾脏病症或肾脏疾病、血液病症或血液疾病、心脏疾病或心脏病症、皮肤病症或皮肤疾病、免疫和炎性疾病和病症、骨疾病或骨病症、胃肠疾病或胃肠病症、眼部疾病或眼部病症或感染。
31.在一个方面，将药物组合物施用于受试者。在某些方面，药物组合物通过静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内和肌肉内施用于受试者。在另外的方面，施用至少5
×
105至5
×
109个线粒体富集的靶细胞。
32.在一个实施例中，本发明提供了一种用于减少受试者的一种或多种淋巴细胞缺陷相关性疾病的致衰弱作用的方法，其包括在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与外源性线粒体一起温育以及向受试者施用hsc。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在各个方面，在施用于受试者之前对hsc进行洗涤。
33.在骨髓或造血干细胞移植之前，受试者可以经历调理过程以消除潜在的疾病且/或防止新细胞的排斥反应。
34.在另外的实施例中，本发明提供了一种用于改善受试者体内造血干细胞(hsc)移植的方法，其包括在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与外源性线粒体一起温育以及向受试者施用hsc。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在另外的方面，外源性线粒体从供体分离。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在一个方面，hsc在体外扩增。在另外的方面，hsc已经历至少一个冻融循环。在进一步的方面，hsc在体外扩增之前或之后经历至少一个冻融循环。在某些方面，hsc在与外源性线粒体一起温育之前或之后经历至少一个冻融循环。在另外的方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件可以包括以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。
35.在各个方面，在施用于受试者之前对hsc进行洗涤。
36.在进一步的实施例中，本发明提供了一种用于增强受试者体内用于基因疗法的细胞的植入的药物组合物，其包含线粒体富集的靶细胞和药学上可接受的载体，其中线粒体
富集的靶细胞富集有外源性线粒体。在一个方面，靶细胞在用外源性线粒体富集之前、期间或之后已进行基因修饰。
37.在一个实施例中，本发明提供了一种用于通过在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与外源性线粒体一起温育以及向受试者施用hsc来治疗受试者的免疫缺陷或免疫相关性疾病的方法。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在另外的方面，外源性线粒体从供体分离。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在一个方面，hsc在体外扩增。在另外的方面，hsc已经历至少一个冻融循环。在进一步的方面，hsc在体外扩增之前或之后经历至少一个冻融循环。在某些方面，hsc在与外源性线粒体一起温育之前或之后经历至少一个冻融循环。在另外的方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件可以包括以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。
38.在一个实施例中，本发明提供了一种通过在允许外源性线粒体进入细胞的条件下使细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的细胞，用具有目的基因的病毒载体转导线粒体富集的细胞以及向受试者施用线粒体富集的转导细胞来治疗疾病或病症的方法。在一个实施例中，本发明提供了一种通过用包含目的基因的病毒载体转导细胞；通过在允许外源性线粒体进入细胞的条件下使转导细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的细胞以及向受试者施用线粒体富集的转导细胞来治疗疾病或病症的方法。在一个方面，细胞是干细胞。在某些方面中，细胞是造血干细胞(hsc)或免疫缺陷细胞。在一些方面，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体。在另外的方面，与未经加强的细胞相比，线粒体富集的转导细胞的施用增加了b细胞的数量。在某些方面，b细胞是前b或祖b细胞。在进一步的方面，与未经加强的细胞相比，线粒体富集的转导细胞的施用增加了igm阳性细胞的数量。在一个实施例中，线粒体富集增加了转导细胞的数量。
附图说明
39.图1a至c示出了在将线粒体富集的cd34+细胞和非富集的cd34+细胞移植到nsgs小鼠体内后两个月线粒体富集对骨髓内植入的效果的分析。图1a.骨髓中的人类线粒体拷贝数。图1b.骨髓中人类细胞的相对数量。图1c.骨髓中相对人类线粒体拷贝/细胞。
40.图2a至c示出了在将线粒体富集的cd34+细胞和非富集的cd34+细胞移植到nsgs小鼠体内后两个月线粒体富集对外周血中线粒体和细胞含量的效果的分析。图2a.外周血中的人类线粒体拷贝数。图2b.外周血中人类细胞的相对数量。图2c.外周血中相对人类线粒体拷贝/细胞。
41.图3a至b示出了将线粒体富集的cd34+细胞移植到nsgs小鼠体内后六个月对骨髓的分析。图3a：对人类cd45+细胞占人类cd45+细胞和小鼠cd45+细胞总量的百分比和对cd3+细胞和cd33+细胞占人类cd45+细胞的相对百分比的流式细胞术分析。图3b：示出外源人类线粒体拷贝数的条形图。
42.图4示出了将线粒体富集的cd34+细胞和非富集的cd34+细胞移植到nsgs小鼠体内后六个月对骨髓的流式细胞术分析。
43.图5a至b示出了cd45+细胞亚群与外周血的频率。图5a：线粒体加强疗法(mat)后具体时间点对骨髓和外周血细胞的流式细胞术分析。图5b：mat后具体时间点cd45+细胞亚群
与外周血的频率。
44.图6示出了转移到受体细胞的外源性线粒体的相对水平。
45.图7示出了cd3
+
(t细胞)、cd19
+
(b细胞)、cd11b
+
(髓样细胞)的表达。在4.5个月的时间点，髓样细胞群体进一步表征为单核细胞(ly6c
high
ly6g)和中性粒细胞(ly6c
+
ly6g
+
)亚群。
46.图8示出了单核细胞和中性粒细胞摄取外源性线粒体。
47.图9示出了用于测试用btk基因加强并转导的免疫缺陷细胞的b细胞发育的实验方案。
48.图10示出了用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型(wt)细胞在第13天的绝对细胞数量。
49.图11a至b示出了hspc群体的百分比和绝对数量。图11a.对用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞内hspc群体的百分比的流式细胞术分析。图11b.ntx101和ntx109经加强的和未经加强的细胞、非转导经加强的和未经加强的细胞和野生型细胞中hspc群体的绝对数量。
50.图12示出了在加强后十三天对用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞中祖b和前b细胞群体的百分比的流式细胞术分析。
51.图13a至b示出了在加强后十三天的祖b/前b细胞群体比率和祖b和前b细胞群体绝对细胞数量。图13a.在加强十三天用ntx101或ntx109转导的经加强的和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞中的祖b细胞/前b细胞群体比率。图13b.在加强后十三天用ntx101和ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞中祖b细胞和前b细胞群体的绝对细胞数量。
52.图14示出了在加强后十七天对用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞内b细胞的百分比和绝对数量的流式细胞术分析。
53.图15示出了在加强后十七天对用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞内的igm阳性b细胞群体的流式细胞术分析。
54.图16示出了在加强后十三天对用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞和野生型细胞内gfp表达的流式细胞术分析。
55.图17示出了在加强后十七天对用ntx101或ntx109转导的经加强和未经加强的细胞、经加强的非转导细胞、未经加强的非转导细胞内gfp表达的流式细胞术分析。
56.图18示出了用慢载体(xid
ptc9
)转导的经加强和未经加强的细胞的转基因表达。
57.图19示出了对照细胞、未经加强的转导细胞和经加强的转导细胞中基因表达的流式细胞术数据。
具体实施方式
58.本发明基于富集有外源性线粒体的细胞对治疗疾病和病症有用的重大发现。本发明提供了通过提供线粒体富集的细胞使骨髓提高受试者体内白细胞产生率的方法和组合物。进一步地，本技术提供了用于增加骨髓细胞结构、cd34+细胞的植入和分化的方法。
59.在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为此类组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅在所附权利要求中受到限制。
60.如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“(一个/一种)a/an”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“该方法”的引用包括本文所描述的类型的一种或多种方法和/或步骤，其对于本领域技术人员在阅读本公开等时将变得显而易见。
61.本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文中，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示以引用的方式并入的程度相同。
62.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是将理解，修改和变化涵盖在本公开的精神和范围内。现在描述优选的方法和材料。
63.本发明提供了用于靶向和全身递送治疗有效量的完全分离的线粒体的细胞平台，更具体地说是干细胞衍生的细胞平台及其在受试者中使用的方法。本发明基于几个令人惊讶的发现，表明静脉内注射富集有外源性线粒体的骨髓衍生的造血干细胞可以有益地影响受试者的各个组织。换言之，在施用富集有外源性线粒体的干细胞之后，可以在各个器官和组织中实现功能的改善。
64.本发明部分地基于以下发现：干细胞和骨髓细胞可接受与完整的外源性线粒体富集，并且人骨髓细胞尤其可接受与线粒体富集，如例如wo 2016/135723中所公开的。不受任何理论或机制的束缚，假定干细胞或骨髓细胞与外源性线粒体的共温育促进完整的功能性线粒体向干细胞或骨髓细胞的转变。
65.还发现，干细胞或骨髓细胞，包括但不限于骨髓衍生的造血干细胞，与线粒体的富集程度和细胞的线粒体功能的改善取决于用于线粒体富集的条件，包括但不限于分离的外源性或部分纯化的线粒体的浓度以及温育。
66.本发明在某些方面提供了用于改善线粒体富集的靶细胞的植入、增殖和这些经加强的细胞向骨髓的归巢的方法和组合物。具体而言，与已接受未用外源性线粒体加强或与其富集的靶细胞的受试者相比或与富集或加强之前的靶细胞相比，已用外源性线粒体加强的靶细胞已改善了植入并改善了经加强的细胞向受试者的骨髓的引导。
67.在一个方面，本发明提供了方法和组合物，该些方法和组合物用于通过使从罹患疾病或病症的受试者或从健康受试者获得或衍生的靶细胞与外源性线粒体富集以及将“线粒体富集的”靶细胞移植到受试者体内来提高受试者体内cd45+细胞的水平，提高相对于cd33+细胞的cd3+细胞的水平以及增加淋巴样细胞与髓样细胞的比例。
68.本发明提供了一种用于提高的受试者体内淋巴样细胞的水平的方法，该方法包括从罹患或患有疾病或病症的受试者或从健康受试者获得靶细胞；从供体获得外源性线粒体；通过在允许外源性线粒体进入靶细胞的条件下使靶细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞；以及向受试者施用线粒体富集的靶细胞，其中富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于靶细胞的线粒体含量。在一个方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个靶细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。
69.本发明另外提供了用于提高的受试者体内淋巴样细胞的水平的药物组合物，其包含线粒体富集的靶细胞和药学上可接受的载体，其中线粒体富集的靶细胞富集有外源性线粒体。线粒体富集的靶细胞通过以下步骤产生：从罹患或患有疾病或病症的受试者或从健康受试者获得靶细胞；从供体获得外源性线粒体；以及通过在允许外源性线粒体进入靶细胞的条件下使靶细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞；其中富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于靶细胞的线粒体含量。在一个方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个靶细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。
70.淋巴样细胞或淋巴细胞是对抗原提供免疫响应的白细胞。淋巴样细胞包括t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞。t细胞和b细胞是适应性免疫响应的主要细胞组分。t细胞参与细胞介导的免疫，而b细胞主要负责体液免疫。nk细胞是先天免疫系统的一部分并在防御宿主免受肿瘤和病毒感染的细胞中起主要作用。
71.如本文所用，术语“提高的白细胞的水平”是指与未施用线粒体富集的靶细胞的受试者相比，与已施用不是线粒体富集的靶细胞的受试者相比或与施用线粒体富集的靶细胞之前的受试者体内白细胞的水平相比，已施用线粒体富集的靶细胞的受试者的白细胞的数量增加。根据一些实施例，cd45+细胞的水平提高至少1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。
72.如本文所用，术语“提高的淋巴样细胞水平”是指与未施用线粒体富集的靶细胞的受试者相比，与已施用不是线粒体富集的靶细胞的受试者相比或与施用线粒体富集的靶细胞之前的受试者体内淋巴样细胞的水平相比，已施用线粒体富集的靶细胞的受试者的淋巴样细胞的数量增加。在某些方面，cd3+细胞的水平提高至少1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。
73.如本文所用，术语“增加的淋巴样细胞与髓样细胞的比例”是指与未施用线粒体富集的靶细胞的受试者相比，与已施用不是线粒体富集的靶细胞的受试者相比或与施用线粒体富集的靶细胞之前的受试者体内淋巴样细胞与髓样细胞的比例相比，已施用线粒体富集的靶细胞的受试者的淋巴样细胞与骨髓样细胞的比例增加。在某些方面，增加是至少1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。
74.如本文所用，术语“靶细胞”是干细胞、祖细胞或骨髓衍生的干细胞。具体地，靶细胞包括多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞、cd34+细胞及其任何组合。在本发明的方法中，靶细胞在与外源性线粒体富集之前没有被主动改变或修饰(例如，mtdna或线粒体功能的降低)。更具体地，靶细胞中的线粒体功能和/或线粒体dna在与外源性线粒体接触之前未被主
动改变或修饰。
75.如本文所用，术语“干细胞”通常是指任何哺乳动物干细胞。干细胞是未分化的细胞，其可以分化成其它类型的细胞并且可以分裂以产生更多相同类型的干细胞。干细胞可以是全能的或多能的。
76.如本文所用，术语“人类干细胞”通常是指在人中天然存在的所有干细胞，以及所有体外产生或衍生的并与人类相容的干细胞。在一些实施例中，人类干细胞是自体的。在一些实施例中，人类干细胞是同种异体的。“祖细胞”，像干细胞一样，具有分化成具体类型细胞的趋势，但已经比干细胞更具特异性，并被推动分化成其“目标”细胞。干细胞和祖细胞之间最重要的区别是干细胞可以无限复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。如本文所用的术语“人类干细胞”进一步包括“祖细胞”和“未完全分化的干细胞”。
77.hspc是所有免疫细胞、先天性和适应性免疫系统以及髓样和淋巴样谱系细胞的祖细胞。作为干细胞，hspc寿命很长；作为造血细胞，hspc进行全身循环并影响身体内的每个器官系统，是解决多系统疾病的关键。线粒体代谢对于造血干细胞和祖细胞的持久性和功能以及免疫细胞的功能和炎症平衡至关重要。免疫功能障碍是线粒体疾病患者发病和死亡的主要原因，并且众所周知，其会导致神经退行性后遗症。免疫系统受到能量缺陷的影响，线粒体疾病患者的表现经常与原发性免疫缺陷患者的表现类似，包括在具有免疫能力的人群中不常见的异常感染。重要的是，即使在没有输血依赖或血细胞减少的患者中，也存在感染期间代谢失代偿的较高风险，这可能是由于在免疫细胞线粒体功能方面的细胞内在缺陷。
78.临床上，最近证明拯救免疫细胞线粒体功能可以发挥多系统作用，包括贫血的改善、肌肉萎缩的改善、体力活动的改善、心血管功能的改善和组织衰老的减少。造血细胞发挥非造血作用的建议机制包括免疫细胞线粒体功能障碍相关的炎症减少或能够抑制远端组织细胞凋亡的因子的分泌增强。
79.在某些实施例中，干细胞是多能干细胞(psc)。在其它实施例中，psc是非胚胎干细胞。根据一些实施例，胚胎干细胞被明确排除在本发明的范围之外。在一些实施例中，干细胞是诱导性psc(ipsc)。在某些实施例中，干细胞是胚胎干细胞。在某些实施例中，干细胞从骨髓细胞衍生。在特定实施例中，干细胞是cd34+细胞。在特定实施例中，干细胞是间充质干细胞。在其它实施例中，干细胞从脂肪组织衍生。在又一些其它实施例中，干细胞从血液衍生。在进一步的实施例中，干细胞从脐带血衍生。在进一步的实施例中，干细胞从口腔黏膜衍生。在具体的实施例中，从罹患疾病或病症的患者或从健康受试者获得的干细胞是骨髓细胞或骨髓衍生的干细胞。每种可能性代表本发明的独立实施例。
80.如本文所用，术语“多能干细胞(psc)”是指可以无限增殖并且在体内产生多种细胞类型的细胞。全能干细胞是可以产生体内所有其它细胞类型的细胞。胚胎干细胞(esc)是全能干细胞，而诱导性多能干细胞(ipsc)是多能干细胞。
81.如本文所用，术语“诱导性多能干细胞(ipsc)”是指可以从人类成体细胞生成的一种类型的多能干细胞。在本文中可以生成ipsc的体细胞的一些非限制性实例包括成纤维细胞、内皮细胞、毛细血管血细胞、角质形成细胞、髓样细胞、上皮细胞。
82.如本文所用，术语“胚胎干细胞(esc)”是指从囊胚的内部细胞团衍生的一种类型的全能干细胞。
83.如本文所用，术语“骨髓细胞”通常是指天然存在于人类骨髓中的所有人类细胞，并指天然存在于人类骨髓中的所有细胞群体。术语“骨髓干细胞”和“骨髓衍生的干细胞”是指从骨髓的干细胞群体衍生。
84.在一些方面，靶细胞是多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞、cd34+细胞及其任何组合。
85.在一些实施例中，自体或同种异体人类干细胞是多能干细胞(psc)或诱导性多能干细胞(ipsc)。在进一步的实施例中，自体或同种异体人类干细胞是间充质干细胞。
86.根据几个实施例，人类干细胞从脂肪组织、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓衍生。每种可能性代表本发明的独立实施例。在具体的实施例中，人类干细胞从骨髓衍生。
87.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括骨髓组织生成细胞。如本文所用的术语“骨髓组织生成细胞”是指参与骨髓组织生成，例如，参与骨髓和由此产生的所有细胞，即所有血细胞的产生的细胞。
88.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括红血球生成细胞。如本文所用的术语“红血球生成细胞”是指参与红细胞生成，例如，参与红血细胞(红血球)的产生的细胞。
89.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括多潜能造血干细胞(hsc)。如本文所用的术语“多潜能造血干细胞”或“成血细胞”是指通过造血过程产生所有其它血细胞的干细胞。
90.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包含共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞或其任何组合。在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包含间充质干细胞。如本文所用的术语“共同髓样祖细胞”是指生成髓样细胞的细胞。如本文所用的术语“共同淋巴样祖细胞”是指生成淋巴细胞的细胞。
91.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞进一步包含巨核细胞、红血球、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施例。
92.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括间充质干细胞。如本文所用的术语“间充质干细胞”是指可以分化成多种细胞类型的多能基质细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。
93.在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括骨髓组织生成细胞。在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞由红血球生成细胞组成。在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括多潜能造血干细胞(hsc)。在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞或其任何组合。在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞包括巨核细胞、红血球、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。在某些实施例中，骨髓衍生的干细胞由间充质干细胞组成。在某些实施例中，干细胞包括多个从外周血获得的人类骨髓干细胞。
94.造血祖细胞抗原cd34，也称为cd34抗原，是一种在人体中由cd34基因编码的蛋白。cd34是细胞表面糖蛋白中的分化簇，并作为细胞间粘附因子发挥作用。在某些实施例，骨髓干细胞表达骨髓祖细胞抗原cd34(cd34+)。在某些实施例，骨髓干细胞在其外膜上呈递骨髓
祖细胞抗原cd34。在某些实施例中，cd34+细胞来自脐带血。
95.如本文所用，术语“cd34+细胞”是指特征为cd34阳性的造血干细胞，无论其来源如何。在某些实施例中，cd34+细胞从骨髓获得、从动员至血液的骨髓细胞获得或从脐带血获得。
96.如本文所用，短语“从罹患病症的受试者或从未罹患病症的供体获得的干细胞”是指从受试者分离时受试者/供体中是干细胞的细胞。
97.如本文所用，短语“从罹患病症的受试者衍生”或“从未罹患病症的供体衍生的干细胞”是指不是受试者/供体中的干细胞且已被操作以成为干细胞的细胞。如本文所用的术语“操作”是指使用本领域已知的方法中的任一种方法(yu j.等人，《科学(science)》，2007，第318(5858)卷，第1917至1920页)将体细胞重编程为未分化状态并成为诱导性多能干细胞(ipsc)，并且任选地，进一步将ipsc重编程成为期望谱系或群体的细胞(chen m.等人，《眼科学与视觉科学调查(iovs)，2010，第51(11)卷，第5970至5978卷》)，诸如骨髓细胞(xu y.等人，《公共科学图书馆期刊(plos one)》，2012，第7(4)卷，第e34321页)。
98.在一些实施例中，干细胞在体外培养并扩增。在某些实施例中，干细胞在线粒体富集之前或之后经历至少一个冻融循环。
99.在某些实施例中，干细胞从罹患疾病或病症的受试者直接衍生。在某些实施例中，干细胞从供体直接衍生。如本文所用的术语“直接衍生”是指从其它细胞直接衍生的干细胞。在某些实施例中，造血干细胞(hsc)从骨髓细胞衍生。在某些实施例中，造血干细胞(hsc)从外周血衍生。
100.在某些实施例中，干细胞从罹患疾病或病症的受试者间接衍生。在某些实施例中，干细胞从供体间接衍生。如本文所用的术语“间接衍生”是指从非干细胞衍生的干细胞。在某些实施例中，干细胞从被操作成为诱导性多能干细胞(ipsc)的体细胞衍生。
101.在一些实施例中，靶细胞从全血、血液部分、外周血、pbmc、血清、血浆、脂肪组织、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓获得。在某些实施例中，干细胞从罹患疾病或病症的受试者的骨髓直接获得。在某些实施例中，干细胞从供体的骨髓直接获得。如本文所使用的术语“直接获得”是指例如通过诸如手术或用注射器通过针头抽吸从骨髓本身获得的干细胞。
102.在某些实施例中，干细胞从罹患疾病或病症的患者的骨髓间接获得。在某些实施例中，干细胞从供体的骨髓间接获得。如本文所使用的术语“间接获得”是指从除骨髓本身之外的位置获得的骨髓细胞。
103.在某些实施例中，干细胞从罹患疾病或病症的受试者的外周血获得。在某些实施例中，干细胞从健康供体的外周血获得。如本文所用的术语“外周血”是指在血液系统中循环的血液。
104.如本文所用，术语“自体细胞”或“是自体的细胞”是指患者的自身细胞。术语“自体线粒体”是指从患者的自身细胞或从母系相关细胞中获得的线粒体。术语“同种异体细胞”或“同种异体线粒体”是指来自不同的供体个体。
105.如本文和权利要求中所使用的术语“同源”是指足以允许个体之间的移植而没有排斥反应的遗传同一性或遗传接近同一性。在线粒体的上下文中，术语同源在本文中与术语自体线粒体互换使用，意思是相同的母系血统。
106.术语“疾病”和“病症”意指任何不被认为是正常的或异于生理状态的病。疾病和病
症几乎可以影响身体的任何器官、组织或功能。疾病或病状的非限制性实例包括癌症、肌肉疾病和病症、糖原贮积疾病和病症、血管内皮病症或疾病、脑病症或脑疾病、胎盘病症或胎盘疾病、胸腺病症或胸腺疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病或病症、胰腺病症或胰腺疾病、前列腺病症或前列腺疾病、肾脏病症或肾脏疾病、血液病症或血液疾病、心脏疾病或心脏病症、皮肤病症或皮肤疾病、免疫和炎性疾病和病症、骨疾病或骨病症、胃肠疾病或胃肠病症以及眼部疾病或眼部病症。在某些方面，疾病或病症是与年龄相关性疾病或病症。
107.年龄相关性疾病是一种最常见的疾病，其频率随着细胞日趋衰老而增加。本质上，年龄相关性疾病是由衰老引起的并发症。年龄相关性疾病要与衰老过程本身区分开来，因为所有成年动物都会衰老，但并非所有成年动物都会患有与年龄相关性疾病。
108.线粒体质量和活性的下降与正常衰老相关，并与很多与年龄相关性疾病的发展相关。线粒体有助于衰老过程的具体方面，包括细胞衰老、慢性炎症和干细胞活性的年龄依赖性下降。大量支持性证据表明，由于线粒体dna突变的积累，线粒体功能障碍会随着年龄的增长而发生。在人类大脑、心脏、骨骼肌和肝脏组织中，各种线粒体dna点突变已被证明随着年龄的增长而显著增加。据报道，在动物模型和人体中，线粒体dna缺失/插入的频率随着年龄的增长也有所增加。据推测，复制循环和线粒体dna突变的积累可能是干细胞衰老的保守机制，因此线粒体影响或调节衰老的许多关键方面(sun等人，《细胞(cell)》，2016，61：654-66；srivastava，《基因(genes)》，2017，8：398；ren等人，《基因》，2017，8：397)。
109.如本文所用，术语“线粒体疾病”和术语“原发性线粒体疾病”可以互换使用。如本文所用的术语“原发性线粒体疾病”是指通过线粒体dna中已知的或无可争辩的致病突变或通过基因产物导入线粒体的核dna的基因突变诊断的线粒体疾病。根据一些实施例，原发性线粒体疾病是先天性疾病。根据一些实施例，原发性线粒体疾病不是继发性线粒体功能障碍。术语“继发性线粒体功能障碍”和“获得性线粒体功能障碍”在整个申请中可互换使用。
110.如本文所用，术语“罹患疾病或病症的受试者”或“患有疾病或病症的受试者”是指经历由某些病状引起的致虚弱作用的人类受试者。该病症可指癌症、年龄相关性病症、肾疾病、胰腺疾病、肝疾病、肌肉病症、脑部疾病或原发性线粒体疾病、继发性线粒体功能障碍以及其它疾病或病症。
111.如本文所用，术语“体外方法”是指步骤仅在人体外执行的方法。特别是，体外方法包括在体外对随后重新引入或移植到待治疗的受试者中的细胞进行的操作。
112.如本文所用，术语“供体”是指提供外源性线粒体的供体。在一些实施例中，供体未患疾病或病症或未患与受试者所罹患的相同的疾病或病症。
113.关于线粒体的术语“外源性”或“分离的外源性”是指从细胞外部的来源引入靶细胞(例如，干细胞)的线粒体。例如，在一些实施例中，外源性线粒体通常从异于靶细胞的供体细胞衍生或分离。例如，外源性线粒体可以在供体细胞中产生或制备，从供体细胞纯化、分离或获得，此后引入靶细胞。外源性线粒体可以是如从供体获得的同种异体线粒体，也可以是从受试者获得的自体线粒体。分离的线粒体可能包括功能性线粒体。在某些实施例中，外源性线粒体是完整的线粒体。
114.如本文所用，线粒体上下文中的术语“分离的”和“部分纯化的”包括至少部分地从其它细胞组分中纯化的外源性线粒体。外源分离或部分纯化的线粒体中线粒体蛋白的总量介于样本内细胞蛋白总量的约10％和90％之间。
115.如本文所用，术语“功能性线粒体”是指显露出指示正常线粒体dna(mtdna)和正常、非病理水平的活性的参数的线粒体。线粒体的活性可以通过本领域熟知的多种方法进行测量，诸如膜电位、o2消耗量、atp产生和柠檬酸合酶(cs)活性水平。
116.在某些实施例中，外源性线粒体构成线粒体富集的细胞中总线粒体含量的至少1％。在某些实施例中，外源性线粒体构成线粒体富集的靶细胞中总线粒体含量的至少10％。在一些实施例中，外源性线粒体构成线粒体富集的靶细胞中总线粒体含量的至少3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。在某些实施例中，分离的线粒体中线粒体蛋白的总量介于细胞蛋白总量的10％和90％、20％和80％、20％和70％、40％和70％、20％和40％或20％和30％之间。每种可能性代表本发明的独立实施例。在某些实施例中，分离的线粒体中线粒体蛋白的总量介于样本内细胞蛋白总量的20％和80％之间。在某些实施例中，分离的线粒体中线粒体蛋白的总量介于线粒体和其它亚细胞部分的组合重量的20％和80％之间。在某些实施例中，分离的线粒体中线粒体蛋白的总量为线粒体和其它亚细胞部分的组合重量的80％以上。
117.在某些实施例中，外源性线粒体获自人类细胞或人类组织。在一些实施例中，人类细胞或人类组织选自由以下组成的组：胎盘、在培养物中培育的胎盘细胞和血细胞。在一些实施例中，人类细胞是人类干细胞。在一些实施例中，人类细胞是人类体细胞。在一些实施例中，细胞是培养物中的细胞。在本文中可以生成ipsc的体细胞的一些非限制性实例包括成纤维细胞、内皮细胞、毛细血管血细胞、角质形成细胞、髓样细胞、上皮细胞。
118.关于线粒体的术语“自体的”是指从与细胞相同的来源引入靶细胞(例如，干细胞)的线粒体。例如，在一些实施例中，自体线粒体从作为靶细胞来源的受试者衍生或分离。例如，自体线粒体可以从受试者的细胞中纯化/分离/获得，此后引入受试者的靶细胞中。
119.关于线粒体的术语“内源性”是指由细胞制备/表达/产生并且不是从外部来源引入细胞中的线粒体。在一些实施例中，内源性线粒体含有由细胞的基因组编码的蛋白和/或其它分子。在一些实施例中，术语“内源性线粒体”等同于术语“宿主线粒体”。
120.根据本发明的原理，将外源性人类线粒体引入可能是人类干细胞的靶细胞中，从而使这些细胞与外源性线粒体富集。应当理解，这样的富集改变了靶细胞的线粒体含量：虽然原初人类干细胞基本上具有一个宿主/自体线粒体群体，但富集有外源性线粒体的靶细胞基本上具有两个线粒体群体——第一宿主/内源性线粒体群体和另一个所引入的线粒体(即外源性线粒体)群体。因此，术语“富集(enriched)”涉及细胞在接受/掺入外源性线粒体后的状态。确定两个线粒体群体之间的数量和/或比率是简单的，因为这两个群体可能在几个方面有所不同，例如，在其线粒体dna方面。因此，短语“与外源性人类线粒体富集的人类干细胞”等同于短语“包含内源性线粒体和外源性分离线粒体的人类干细胞”。例如，包含总线粒体含量的至少1％的外源性分离的线粒体的人类干细胞被认为包含比率为99∶1的宿主内源性线粒体和外源性分离的线粒体。例如，“总线粒体的3％”意味着富集后，原始(内源性)线粒体含量为总线粒体的97％，而所引入的(外源性)线粒体为总线粒体的3％——这相当于(3/97＝)3.1％的富集。另一个实例——“总线粒体的33％”意味着富集后，原始(内源性)线粒体含量为总线粒体的67％，而所引入的(外源性)线粒体为总线粒体的33％——这相当于(33/67＝)49.2％的富集。
121.在一些实施例中，在将外源性线粒体引入靶细胞后，内源性线粒体与外源性线粒
体的鉴定/辨别可以通过各种方式进行，包括但不限于：鉴定内源性线粒体和外源性线粒体之间的mtdna序列的差异，例如，不同的单倍型，鉴定源自外源性线粒体的源组织的特异性线粒体蛋白，诸如，例如，来自胎盘的细胞色素p450胆固醇侧链裂解酶(p450scc)、来自棕色脂肪组织的ucp1等或其任何组合。
122.异质性是指细胞或个体中存在一种以上类型的线粒体dna。异质性水平是突变mtdna分子对野生型/功能性mtdna分子的比例，并且是考虑线粒体疾病严重程度的重要因素。虽然较低的异质性水平(足够量的线粒体是发挥作用的)与健康表型相关联，但较高的异质性水平(量不足的线粒体是发挥作用的)与病理相关联。在某些实施例中，富集的干细胞的异质性水平比从受试者或供体获得或衍生的干细胞的异质性水平低至少1％、3％、5％、15％、20％、25％或30％。
123.如本文所用，术语“线粒体富集的靶细胞”是指已插入外源性线粒体的靶细胞。在某些实施例中，线粒体富集的靶细胞分化为cd45、cd3、cd33、cd14、cd19、cd11、cd15、cd16等表达细胞。在某些实施例中，线粒体富集的靶细胞表达cd45、cd3、cd33、cd14或cd19。cd45是一种受体连接蛋白酪氨酸磷酸酶，其存在于除红血球和浆细胞外的造血谱系的所有细胞中。cd3是免疫响应效率的标志物。具体而言，cd3在前胸腺细胞中表达。细胞上cd45和cd3的表达可以通过本领域已知的包括流式细胞术在内的任何手段来确定。根据一些实施例，cd45、cd3、cd33、cd14和/或cd19表达发生在将线粒体富集的细胞施用于受试者后。
124.如本文所用，术语“接触(contacting)”是指使线粒体和细胞足够接近以促进线粒体进入细胞。术语向靶细胞引入或插入线粒体可与术语接触互换使用。
125.如本文所用的短语“允许分离的线粒体进入靶细胞的条件”通常是指诸如时间、温度、培养基以及线粒体与干细胞之间的接近度等参数。例如，人类细胞和人类细胞系按常规在液体培养基中温育，并保存在37℃和5％co2气氛下的无菌环境中，诸如组织培养箱中。根据本文公开和举例说明的替代实施例，细胞可以在室温下在补充有人类血清白蛋白的盐水中温育。
126.在某些实施例中，在范围从约16至约37℃的温度下将人类干细胞与分离的线粒体温育范围从约0.5至30小时的时间。在某些实施例中，将人类干细胞与分离的线粒体温育范围从约1至30或约5至25小时的时间。在具体的实施例中，温育进行约20至30小时。在一些实施例中，温育进行至少1、3、5、8、10、13、15、18、20、21、22、23或24小时。在其它实施例中，温育进行直至至少5、10、15、20或30小时。在具体的实施例中，温育进行约24小时。在某些实施例中，温育进行到靶细胞中的线粒体含量与其初始线粒体含量相比平均提高约1％至45％为止。
127.在一些实施例中，温育在室温(16℃至30℃)下进行。在其它实施例中，温育在37℃下进行。在一些实施例中，温育在5％co2气氛中进行。在其它实施例中，温育不包括添加高于空气中存在的水平的co2。
128.在又一些进一步的实施例中，温育在补充有人类血清白蛋白(hsa)的培养基中进行。在另外的实施例中，温育在补充有hsa的盐水中进行。根据某些示范性实施例，允许分离的外源性线粒体进入人类干细胞从而使所述人类外源性线粒体与所述人类干细胞富集的条件包括在室温下在补充有4.5％人血清白蛋白的盐水中的温育。
129.在某些实施例中，将分离的线粒体与靶细胞在获得线粒体后约1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟温育。在另外的实施例中，在获得分离的线粒体后，将分离的线粒体与靶细胞温育约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一个方面，线粒体从供体获得。在另一方面，外源性线粒体对靶细胞是自体的或同种异体的。
130.在某些实施例中，温育在37℃下进行。在某些实施例中，温育进行至少6小时。在某些实施例中，温育进行至少12小时。在某些实施例中，温育进行至少12至24小时。在某些实施例中，温育以约1
×
105至1
×
107个靶细胞/单位量具有或展现出0.88毫单位柠檬酸合酶(cs)的外源性线粒体的比率进行。在某些实施例中，温育以约1
×
106个原初干细胞/单位量具有或展现出0.88毫单位cs的外源性线粒体的比率进行。在某些实施例中，如由cs活性所确定的，这些条件足以使原初干细胞的线粒体含量提高至少约1％、3％、5％或10％。每种可能性代表本发明的独立实施例。
131.如本文所用，术语“富集(enriching)”是指任何旨在提高线粒体含量例如，完整线粒体的数量或哺乳动物细胞线粒体的功能性的动作。在特定的实施例中，与富集之前的相同干细胞相比，富集有外源性线粒体的干细胞将显示出功能增强。
132.柠檬酸合酶(cs)发现于线粒体基质中，但由核dna编码。柠檬酸合酶参与克雷布斯循环的第一步骤，并通常用作完整线粒体存在的定量酶标志物(larsen s.等人，《生理学杂志(j.physiol.)》，2012，第590(14)卷，第3349至3360页；cook g.a.等人，《生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta.》，1983，第763(4)卷，第356至367页)。
133.如本文所解释的，线粒体剂量可以以cs活性单位或外源性线粒体量的其它可量化测量的mtdna拷贝数表示。“cs活性单位”定义为能够在1分钟内转化1ml反应体积中的一个微摩尔底物的量。
134.在一些实施例中，干细胞与外源性线粒体的富集包括向靶细胞中引入一剂至少0.044至176毫单位(mu)的柠檬酸合酶(cs)活性/百万个细胞、至少0.088至176mu的cs活性/百万个细胞、至少0.2至150mu的cs活性/百万个细胞、至少0.4至100mu的cs活性/百万个细胞、至少0.6至80mu的cs活性/百万个细胞、至少0.7至50mu的cs活性/百万个细胞、至少0.8至20mu的cs活性/百万个细胞、至少0.88至17.6mu的cs活性/百万个细胞或至少0.44至17.6毫单位的cs活性/百万个细胞的线粒体。
135.如本文所用，术语“线粒体含量”是指细胞内线粒体的量，或指多个细胞内线粒体的平均量。如本文所用的术语“提高的线粒体含量”是指可检测地高于线粒体富集之前靶细胞的线粒体含量的线粒体含量。
136.在某些实施例中，富集有外源性线粒体的人类干细胞的线粒体含量可检测地高于靶细胞的线粒体含量。根据各个实施例，线粒体富集的靶细胞的线粒体含量为至少3％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少100％、至少200％或更多，高于靶细胞的线粒体含量。
137.在某些实施例中，靶细胞新鲜使用。在一些实施例中，在与线粒体富集之前或之后将靶细胞冷冻并融化。
138.在某些实施例中，靶细胞或线粒体富集的靶细胞的线粒体含量通过确定柠檬酸合酶的含量来确定。在某些实施例中，干细胞或富集的干细胞的线粒体含量通过确定柠檬酸合酶的活性水平来确定。在某些实施例中，干细胞或富集的干细胞的线粒体含量与柠檬酸
合酶的含量相关。在某些实施例中，干细胞或富集的干细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的活性水平相关。cs活性可以通过市售的试剂盒来测量，例如，使用cs活性试剂盒cs0720(西格玛(sigma))。
139.线粒体dna含量可以通过在线粒体富集之前和之后对线粒体基因进行定量pcr来测量，相对于核基因归一化。
140.在具体的情况下，在线粒体富集之前，相同的细胞作为对照来测量cs和atp活性并确定富集水平。
141.在某些实施例中，如本文所用的术语“可检测地高于”是指正常值和增加值之间的统计学显著增加。在某些实施例中，如本文所用，术语“可检测地高于”是指非病理性增加，即达到与实质性较高值相关联的病理症状没有变得明显的水平。在某些实施例中，如本文所用的术语“增加”是指比在线粒体富集之前在健康受试者或多个健康受试物的对应细胞或对应线粒体中或在靶细胞中发现的对应值高约1.05倍、1.1倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或更多倍数的值。每种可能性代表本发明的独立实施例。
142.如本文所用的术语“提高的线粒体dna含量”是指可检测地高于线粒体富集之前靶细胞中线粒体dna含量的线粒体dna含量。线粒体含量可以通过测量sdha或cox1含量来确定。在说明书和权利要求的上下文中的“正常线粒体dna”是指不携带/不具有已知与线粒体疾病相关联的突变或缺失的线粒体dna。如本文所用的术语“正常氧(o2)消耗率”是指来自健康个体的细胞的平均o2消耗量。如本文所用的术语“柠檬酸合酶的正常活性水平”是指来自健康个体的细胞中柠檬酸合酶的平均活性水平。如本文所用的术语“正常三磷酸腺苷(atp)产生率”是指来自健康个体的细胞中的平均atp产生率。
143.干细胞与外源性线粒体的富集程度可以通过功能和/或酶学测定来确定，包括但不限于氧(o2)消耗率、柠檬酸合酶的含量或活性水平、三磷酸腺苷(atp)产生率。在替代方案中，干细胞与外源性线粒体的富集可通过检测供体的线粒体dna来证实。根据一些实施例，干细胞与外源性线粒体的富集程度可以通过异质性的变化水平和/或通过mtdna拷贝数/细胞来确定。每种可能性代表本发明的独立实施例。
144.tmrm(四甲基罗丹明甲酯)或相关的tmre(四甲基罗丹明乙酯)是细胞渗透性荧光染料，其通常用于通过识别线粒体膜电位的变化来评估活细胞中的线粒体功能。根据一些实施例，富集水平可以通过用tmre或tmrm染色来确定。
145.根据一些实施例，线粒体膜的完整性可以通过本领域已知的任何方法来确定。在非限制性实例中，线粒体膜的完整性使用四甲基罗丹明甲酯(tmrm)或四甲基罗丹明乙酯(tmre)荧光探针来测量。每种可能性代表本发明的独立实施例。在显微镜下观察并显示tmrm或tmre染色的线粒体具有完整的线粒体外膜。如本文所用，术语“线粒体膜”是指选自由以下组成的组的线粒体膜：线粒体内膜、线粒体外膜和两者。
146.在某些实施例中，线粒体富集的人类干细胞中的线粒体富集水平通过对细胞中总线粒体dna的至少具有统计学代表性的部分进行测序以及确定宿主/内源性线粒体dna和外源性线粒体dna的相对水平来确定。在某些实施例中，线粒体富集的人类干细胞中的线粒体富集水平由单核苷酸多态性(snp)分析来确定。在某些实施例中，最大的线粒体群体和/或最大的线粒体dna群体是宿主/内源性线粒体群体和/或宿主/内源性线粒体dna群体；且/或第二大线粒体群体和/或第二大线粒体dna群体是外源性线粒体群体和/或外源性线粒体
dna群体。每种可能性代表本发明的独立实施例。
147.根据某些实施例，干细胞与外源性线粒体的富集可以通过本领域公认的常规测定来确定。在某些实施例中，线粒体富集的人类靶细胞中的线粒体富集水平由以下各项来确定：(i)宿主/内源性线粒体dna和外源性线粒体dna的水平；(ii)选自由以下组成的组的线粒体蛋白的水平：柠檬酸合酶(cs)、细胞色素c氧化酶(cox1)、琥珀酸脱氢酶复合体黄素蛋白亚基a(sdha)及其任何组合；(iii)cs活性水平；(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施例。
148.在某些实施例中，线粒体富集的人类干细胞中的线粒体富集水平由以下中的至少一项确定：(i)同种异体线粒体情况下的宿主线粒体dna和外源性线粒体dna的水平；(ii)柠檬酸合酶活性的水平；(iii)琥珀酸脱氢酶复合体黄素蛋白亚基a(sdha)或细胞色素c氧化酶(cox1)的水平；(iv)氧(o2)消耗率；(v)三磷酸腺苷(atp)产生率或(vi)其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施例。用于测量这些各个参数的方法在本领域中是众所周知的。
149.在一些实施例中，干细胞与外源性人类线粒体的富集包含在将人类干细胞与所述分离的外源性人类外源性线粒体温育后洗涤线粒体富集的靶细胞。此步骤提供了线粒体富集的靶细胞，其基本上没有细胞碎片或线粒体膜残余物和未进入干细胞的线粒体。在一些实施例中，洗涤包含在将人类靶细胞与所述分离的外源性人类线粒体温育后对线粒体富集的靶细胞进行离心。根据一些实施例，该些方法产生与游离线粒体分离的线粒体富集的人类干细胞，即未进入干细胞的线粒体，或其它细胞碎片，并且药物组合物含有与游离线粒体分离的线粒体富集的人类干细胞。根据一些实施例，该些方法产生并且药物组合物含有线粒体富集的人类干细胞，其不包含可检测量的游离线粒体。
150.在某些实施例中，上述方法进一步包括在温育和/或接触之前或期间对靶细胞和分离的外源性线粒体进行的浓缩。在某些实施例中，上述方法进一步包括在温育和/或接触之前、期间或之后对靶细胞和分离的外源性线粒体进行离心。在一些实施例中，上述在其各个实施例中的方法包括在对靶细胞同分离的线粒体温育之前、期间或之后的单个离心步骤。
151.在某些实施例中，离心速度为约7,000g或8,000g。根据进一步的实施例，离心以介于300g和8000g之间；500g和8000g之间；1000g和8000g之间；300g和5000g之间；2000g和4000g之间；2500g和8500g之间；3000g和8000g之间；4000g和8000g之间；5,000和10,000g之间；7000g和8000g之间或2500g以上的速度进行。在一些实施例中，离心进行范围从约2分钟至30分钟；从3分钟至25分钟；从5分钟至20分钟；或从8分钟至15分钟的时间。
152.在一些实施例中，离心在范围从约2℃至6℃；4℃至37℃；4℃至10℃或16℃至30℃的温度下进行。在具体的实施例中，离心在4℃下进行。在一些实施例中，上述在其各个实施例中的方法包括在将靶细胞与分离的外源性线粒体温育之前、期间或之后的单次离心，紧接着将细胞在低于30℃的温度下静息。在一些实施例中，允许分离的外源性线粒体进入人类靶细胞的条件包括在靶细胞与分离的线粒体温育之前、期间或之后的单次离心，紧接着将细胞在范围介于16℃和28℃之间的温度下静息。
153.在一些实施例中，该些方法生成且/或药物组合物含有浓度为至少104至2
×
108、5
×
105至1.5
×
107或5
×
105至4
×
107个线粒体富集的靶细胞/千克受试者体重的线粒体富集
的干细胞。在一些实施例中，该些方法生成且/或药物组合物含有浓度为至少106至107个线粒体富集的人类干细胞/千克患者体重的线粒体富集的靶细胞。在其它实施例中，该些方法生成且/或药物组合物含有浓度为至少105至至少106个线粒体富集的人类干细胞/千克患者体重的线粒体富集的靶细胞。在一些实施例中，该些方法生成且/或药物组合物含有浓度为总计至少5
×
105直至5
×
109个线粒体富集的靶细胞的线粒体富集的干细胞。在一些实施例中，该些方法生成且/或药物组合物含有浓度为总计至少106直至109个线粒体富集的靶细胞的线粒体富集的靶细胞。在其它实施例中，该些方法生成且/或药物组合物包含总计至少2
×
106直至5
×
108个线粒体富集的靶细胞。
154.在某些实施例中，靶细胞是新鲜的。在某些实施例中，靶细胞被冷冻，然后在温育之前融化。在某些实施例中，分离的外源性线粒体是新鲜的。在某些实施例中，分离的外源性线粒体被冷冻，然后在温育之前融化。在某些实施例中，线粒体富集的靶细胞是新鲜的。在某些实施例中，线粒体富集的靶细胞被冷冻，然后在施用之前融化。
155.在某些实施例中，线粒体未被冷冻。在进一步的实施例中，分离的线粒体被冷冻，然后储存并在使用之前融化。在进一步的实施例中，线粒体富集的靶细胞无需冷冻和储存即可使用。在又一些进一步的实施例中，线粒体富集的靶细胞在冷冻、储存和融化后使用。适合细胞制剂冷冻和融化以保持活力的方法是本领域众所周知的。
156.如本文所用，术语“冻融循环”是指将分离的外源性线粒体冷冻至低于0℃的温度，将线粒体保持在低于0℃的温度达限定的时间段并将分离的线粒体融化至室温或体温或任何高于0℃的温度，这使得能够用分离的线粒体处理靶细胞。如本文所用，术语“室温”通常是指介于18℃和25℃之间的温度。如本文所用，术语“体温”是指介于35.5℃和37.5℃之间的温度，优选37℃。
157.在另一实施例中，已经历冻融循环的线粒体在-20℃或更低、-4℃或更低或-70℃或更低的温度下冷冻。根据另一实施例，线粒体的冻结是逐渐的。根据某一些实施例，线粒体的冷冻就是快速冷冻。如本文所用，术语“快速冷冻”是指通过使线粒体经受低温来快速冷冻线粒体。
158.在另一实施例中，将经历冻融循环的线粒体在融化之前至少冷冻30分钟。根据另一实施例，冻融循环包含在融化之前将分离的外源性线粒体冷冻至少30、60、90、120、180、210分钟。每种可能性代表本发明的独立实施例。在另一实施例中，将已经历冻融循环的分离的外源性线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、48、72、96或120小时。在另一实施例中，已经历冻融循环的分离的外源性线粒体在融化之前冷冻至少4、5、6、7、30、60、120或365天。根据另一实施例，冻融循环包含在融化之前将分离的外源性线粒体冷冻至少1、2、3周。根据另一实施例，冻融循环包含在融化之前将分离的外源性线粒体冷冻至少1、2、3、4、5、6个月。每种可能性代表本发明的独立实施例。根据另一实施例，冻融循环后分离的外源性线粒体的氧消耗量等于或高于冻融循环之前的外源性线粒体的氧消耗量。
159.根据某些实施例，融化在室温下进行。在另一实施例中，融化在体温下进行。根据另一个实施例，融化在能够根据本发明的方法施用线粒体的温度下进行。根据另一实施例，融化逐渐地进行。
160.在某些实施例中，上述方法进一步包括向罹患疾病或病症的受试者或向供体施用诱导骨髓细胞动员至外周血的药剂的先前步骤。
161.在某些实施例中，诱导在骨髓中产生的骨髓细胞/干细胞动员到外周血的药剂选自由以下组成的组：粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、1，1
′‑
[l，4-亚苯基双(亚甲基)]双[l，4，8，l1-四氮杂环十四烷](普乐沙福(plerixafor))，cas号155148-31-5)、cxcr4抑制剂、其盐及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施例。
[0162]
在某些实施例中，上述方法进一步包括从罹患疾病或病症的受试者和/或从供体的外周血中分离干细胞。如本文所用的术语“从外周血中分离”是指从血液的其它成分中分离干细胞。
[0163]
在单采期间，受试者或供体的血液经过分离出一种特定成分并将其余成分返回循环的设备。因此，这是一种在体外执行的医疗程序。在某些实施例中，分离通过单采进行。
[0164]
在某些实施例中，可以是干细胞的靶细胞从罹患疾病或病症的受试者或从供体获得，并且靶细胞具有(i)正常氧(o2)消耗率；(ii)正常柠檬酸合酶含量或活性水平；(iii)正常三磷酸腺苷(atp)产生率；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
[0165]
在某些实施例中，可以是干细胞的靶细胞从罹患疾病或病症的受试者或从供体获得，并且与未罹患疾病或病症的受试者相比，靶细胞具有降低的(i)氧(o2)消耗率；(ii)降低的柠檬酸合酶含量或活性水平；(iii)降低的三磷酸腺苷(atp)产生率；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。
[0166]
在某些实施例中，与靶细胞相比的，线粒体富集的靶细胞具有(i)提高的氧(o2)消耗率、(ii)提高的柠檬酸合酶含量或活性水平、(iii)提高的三磷酸腺苷(atp)产生率、(iv)提高的线粒体dna含量、(v)较低的异质性水平或(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的任何组合。
[0167]
如本文所用的术语“提高的氧(o2)消耗率”是指可检测地高于线粒体富集之前的氧(o2)消耗率的氧(o2)消耗率。
[0168]
如本文所用的术语“提高的柠檬酸合酶含量或活性水平”是指柠檬酸合酶的含量或活性水平可检测地高于线粒体富集之前的柠檬酸合酶的含量值或活性水平。
[0169]
如本文所用的术语“提高的三磷酸腺苷(atp)产生率”是指可检测地高于线粒体富集之前的三磷酸腺苷(atp)产生率的三磷酸腺苷(atp)产生率。
[0170]
根据一些方面，本发明提供了一种治疗需要这种治疗的人类受试者的疾病或病症或其症状的方法，该方法包含向受试者施用包含多个线粒体富集的靶细胞的药物组合物的步骤。
[0171]
术语“治疗”在本文中与术语“治疗方法”可互换使用，并且指以下两项：1)治愈、减缓、减轻症状和/或停止诊断的病理状况或病症进展的治疗处理或措施和2)防病/预防措施。那些需要治疗的个体可包括已患有特定医学病症的个体以及那些最终可能获得该病症的个体(即那些需要预防措施的个体)。
[0172]
术语“治疗有效量”、“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“有效量”等是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的组织、系统、动物或人类的生物学或医学响应的主题化合物的量。一般而言，响应是患者症状的改善或期望的生物学结局。有效量可以如本文所述确定。
[0173]
术语“施用(administration of/administering)”应当理解为向需要治疗的受试
者提供治疗有效量的药物组合物。施用途径可以是肠内施用、局部施用或肠胃外施用。这样，施用途径包括但不限于静脉内施用、腹膜内施用、动脉内施用和肌肉内施用。如本文所用的短语“肠胃外施用(parenteral administration/administered parenterally)”是指除肠内和局部施用之外的施用方式。药物组合物可以以多种单位剂型施用，取决于施用方法。合适的单位剂型包括但不限于散剂、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂、贴剂、鼻喷雾剂、注射剂、可植入缓释制剂、脂质复合体等。
[0174]
在另一方面，本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含多个如上所述的线粒体富集的靶细胞。在某些实施例中，上述药物组合物用于治疗患有疾病的人类受试者的某些症状的方法。
[0175]
如本文所用，“药物组合物”是指包含活性成分和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的制剂。术语“活性成分”可以互换地指“有效成份”，并且意指任何能够在施用后引起所追求的效果的药剂。活性成分的实例包括但不限于化学化合物、药物、治疗剂、小分子等。
[0176]
所谓“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成份相容并且对其受体或制剂的活性成分的活性无害。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在本领域中是众所周知的，例如，《雷明顿制药科学(remington
′
s pharmaceutical sciences)》，第16版，osol，a.编辑(1980)。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且可以包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成反离子，诸如钠；金属络合物(例如，锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。载体的实例包括但不限于脂质体、纳米颗粒、软膏、胶束、微球、微粒、乳膏、乳剂和凝胶。赋形剂的实例包括但不限于诸如硬脂酸镁等抗粘附剂、诸如糖类及其衍生物(蔗糖、乳糖、淀粉、纤维素、糖醇等)等粘合剂、如明胶和合成聚合物等蛋白、诸如滑石和二氧化硅等润滑剂和诸如抗氧化剂、维生素a、维生素e、维生素c、棕榈酸视黄酯、硒、半胱氨酸、蛋氨酸、柠檬酸、硫酸钠和对羟基苯甲酸酯等防腐剂。稀释剂的实例包括但不限于水、乙醇、盐水溶液、乙二醇、矿物油和二甲亚砜(dmso)。
[0177]
在某些实施例中，症状选自由以下组成的组：行走能力受损、运动技能受损、语言技能受损、记忆力受损、体重减轻、恶病质、低血碱性磷酸酶水平、低血镁水平、高血肌酐水平、低血碳酸氢盐水平、低血碱过量、高尿葡萄糖/肌酐比率、高尿氯化物/肌酐比率、高尿钠/肌酐比率、高血乳酸水平、高尿镁/肌酐比率、高尿钾/肌酐比率、高尿钙/肌酐比率、糖尿、镁尿、高血尿素水平、低c肽水平、高hbalc水平、甲状旁腺功能减退、上睑下垂、听力丧失、心脏传导障碍、淋巴细胞中低atp含量和氧消耗量、心境障碍，包括双相障碍、强迫症、抑郁症以及人格障碍。每种可能性代表本发明的独立实施例。应当理解，将症状定义为“高”和“低”分别对应于“可检测地高于正常”和“可检测地低于正常”，其中正常水平是在多个未罹
患线粒体疾病的受试者中的对应水平。
[0178]
在某些实施例中，将富集的干细胞施用于具体组织或器官。在某些实施例中，富集的干细胞具有至少104个线粒体富集的靶细胞。
[0179]
在某些实施例中，线粒体富集的靶细胞通过肠胃外施用来施用。在某些实施例中，药物组合物通过全身施用、静脉注射或静脉输液来施用。在某些实施例中，富集的干细胞具有至少105个线粒体富集的靶细胞。在某些实施例中，线粒体富集的靶细胞具有约至少104、至少104至至少108、至少106至至少108、至少105至至少2
×
107、至少106至至少5
×
106或至少105个线粒体富集的靶细胞。
[0180]
在某些实施例中，可以是干细胞的线粒体富集的靶细胞具有以下中的至少一项：(i)与线粒体富集之前靶细胞中的线粒体dna含量相比提高的线粒体dna含量；(ii)与线粒体富集之前靶细胞中的氧(o2)消耗率相比提高的氧气(o2)消耗率；(iii)与线粒体富集之前靶细胞中柠檬酸合酶的含量或活性水平相比提高的柠檬酸合酶含量或活性水平；(iv)与线粒体富集之前靶细胞中的三磷酸腺苷(atp)产生率相比提高的三磷酸腺苷(atp)产生率；(v)较低的异质性水平；或(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的任何组合。
[0181]
在某些实施例中，分离的外源性线粒体中线粒体蛋白的总量介于细胞蛋白总量的10％和80％、20％和70％、40％和70％、20％和40％或20％和30％之间。每种可能性代表本发明的独立实施例。在某些实施例中，分离的外源性线粒体中线粒体蛋白的总量介于样本内细胞蛋白总量的20％和80％之间。在某些实施例中，分离的外源性线粒体中线粒体蛋白的总量介于线粒体和其它亚细胞部分的组合重量的20％和80％之间。在某些实施例中，分离的外源性线粒体中线粒体蛋白的总量为线粒体和其它亚细胞部分的组合重量的80％以上。
[0182]
在一些实施例中，上述在其各个实施例中的方法进一步包括通过在能够扩增靶细胞的增殖培养基中培养所述干细胞来扩增靶细胞。在其它实施例中，该方法进一步包含通过在能够扩增靶细胞的培养物或增殖培养基中培养所述细胞来扩增线粒体富集的靶细胞。如本技术通篇所用，术语“培养物或增殖培养基”是流体培养基，诸如细胞培养基、细胞生长培养基、为细胞提供营养物质的缓冲液。
[0183]
在某些实施例中，靶细胞对罹患疾病或病症的受试者是同种异体的。术语“对受试者是同种异体的”是指干细胞或线粒体与患者的细胞hla匹配或至少部分hla匹配。根据某些实施例，根据特异性线粒体dna单倍群的鉴定，供体与受试者匹配。在某些实施例中，受试者是干细胞和/或线粒体的来源。
[0184]
如本文所用的术语“hla匹配”是指期望靶细胞的受试者和供体尽可能接近hla匹配，至少达到受试者不产生针对供体的靶细胞的急性免疫响应的程度。这种免疫响应的预防和/或治疗可以在急性或慢性使用免疫抑制剂或不使用免疫抑制剂的情况下实现。在某些实施例中，来自供体的干细胞与患者hla匹配到患者不排斥干细胞的程度。
[0185]
在某些实施例中，患者通过免疫抑制疗法进一步治疗，以防止干细胞移植物的免疫排斥反应。
[0186]
如本文所用的术语“单倍群”是指在母系上有着共同祖先的人的遗传群体。线粒体单倍群通过测序确定。
[0187]
在某些实施例中，线粒体来自相同的单倍群。在其它实施例中，线粒体来自不同的
单倍群。
[0188]
在某些实施例中，上述方法进一步包括在施用药物组合物之前向受试者施用移植前调理剂的先前步骤。如本文所用的术语“移植前调理剂”是指任何能够杀死人类受试者骨髓内的骨髓细胞的药剂。在某些实施例中，移植前调理剂是白消安(busulfan)。
[0189]
根据某些实施例，分离的线粒体根据受试者的病症从选自特异性线粒体单倍群的供体分离。
[0190]
淋巴细胞缺陷是受试者的淋巴细胞水平异常低的病状。受试者可能患有t淋巴细胞减少症、b淋巴细胞减少症或nk淋巴细胞减少症。淋巴细胞缺陷与皮质类固醇的使用、病毒、微生物和真菌感染、营养不良、体育锻炼过度、全身性红斑狼疮、类风湿关节炎、结节病和多发性硬化症相关联。
[0191]
淋巴细胞缺陷相关性疾病或病症是受试者的淋巴细胞水平异常低的任何疾病或病症。淋巴细胞缺陷相关性疾病或病症的实例包括病毒、微生物和真菌感染；全身性红斑狼疮；类风湿关节炎；结节病和多发性硬化症。
[0192]
在一个实施例中，本发明提供了一种用于减少受试者的一种或多种淋巴细胞缺陷相关性疾病的致衰弱作用的方法，其包括在允许分离的外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与外源性线粒体一起温育以及向受试者施用来自(a)的hsc。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在另外的方面，外源性线粒体从供体分离。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在各个方面，在施用于受试者之前对hsc进行洗涤。
[0193]
在骨髓或造血干细胞移植之前，受试者可以经历调理过程以消除潜在的疾病并防止新细胞的排斥反应。调理方案包括化疗剂和/或全身照射的施用。
[0194]
如本文所用，术语“经调理的受试者”是指将要进行骨髓或hsc移植并已经历涉及施用化疗剂和/或全身照射的调理治疗的受试者。
[0195]
如本文所用，术语“未经调理的受试者”是指将要进行骨髓或hsc移植并未经历涉及施用化疗剂和/或全身照射的调理治疗的受试者。
[0196]
在另外的方面，本发明提供了一种用于改善受试者体内造血干细胞(hsc)移植的方法，其包括在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与分离的外源性线粒体一起温育；以及向受试者施用hsc。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在另外的方面，外源性线粒体从供体分离。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在各个方面，在施用于受试者之前对hsc进行洗涤。
[0197]
在一个实施例中，本发明提供了一种通过在允许外源性线粒体进入细胞的条件下使细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的细胞，用具有目的基因的病毒载体转导线粒体富集的细胞以及向受试者施用线粒体富集的转导细胞来治疗疾病或病症的方法。在一个实施例中，本发明提供了一种通过用具有目的基因的病毒载体转导细胞；通过在允许外源性线粒体进入细胞的条件下使转导细胞与外源性线粒体接触来产生线粒体富集的细胞；以及向受试者施用线粒体富集的转导细胞来治疗疾病或病症的方法。在一个方面，细胞是干细胞。在某些方面中，细胞是造血干细胞(hsc)或免疫缺陷细胞。在一些方面，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体。在另外的方面，与未经加强的细胞相比，线粒体富集的转导细胞的施用增加了b细胞的数量。在某些方面，b细胞是前b或祖b细胞。在进一步的方
面，与未经加强的细胞相比，线粒体富集的转导细胞的施用增加了igm阳性细胞的数量。在一个实施例中，线粒体富集增加了转导细胞的数量。
[0198]
基因疗法技术基于经基因修饰的自体造血干细胞(hsc)的移植。基因疗法使用基因来治疗或预防疾病。最常见的基因疗法形式涉及插入正常基因来替换异常基因。其它方法包括将异常基因换成正常基因、修复异常基因以及改变基因开启或关闭的程度。干细胞基因疗法基于对相对少量的干细胞进行的基因修饰。这些干细胞通过自我更新在体内长期存在并生成大量基因“纠正”的后代。hsc对基因疗法是特别有吸引力的目标，因为其基因修饰将在其分化时传递给所有血细胞谱系。
[0199]
hsc及其后代的有效长期基因修饰需要一种准许将校正dna稳定整合到基因组中而不影响hsc功能的技术。因此，诸如γ逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒等整合重组病毒系统的使用已经主导了该领域(chang，a.h.等人(2007)《分子疗法(mol.ther.)》15：445-456)。在针对腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada-scid；aiuti，a.等人(2009)《新英格兰医学杂志(n.engl.j.med.)》360：447-458)、x连锁重症联合免疫缺陷(scid-x1；hacein-bey-abina，s.等人(2010)《新英格兰医学杂志》363：355-364)和威斯科特-奥尔德里奇综合征(was；boztug，k.等人(2010)《新英格兰医学杂志》363：1918-1927)的基于y逆转录病毒的临床试验中已取得治疗成效。另外，慢病毒已在x-连锁肾上腺脑白质营养不良(ald；cartier，n.等人(2009)《科学》326：818-823)、异染性脑白质营养不良(mld；biffi，a.等人(2013)《科学》341：1233158)和was(aiuti，a.等人(2013)《科学》341：1233151)的治疗方面被用作递送媒介物。
[0200]
载体可以是整合或非整合载体，是指载体将表达盒和/或转基因整合到细胞基因组中的能力。整合载体或非整合载体均可用于递送含有可操作地连接到调控元件的基因的表达盒。载体的实例包括但不限于(a)非病毒载体，诸如核酸载体，包括线性寡核苷酸和环状质粒；人工染色体，诸如人类人工染色体(hac)、酵母人工染色体(yac)和细菌人工染色体(bac或pac)；附加型载体；转座子(例如，piggybac)；(b)病毒载体，诸如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和aav载体。病毒对核酸的递送有几个优点，包括对某些靶细胞或组织的高感染性和/或嗜性。在一些情况下，病毒用于递送核酸分子或表达盒，该核酸分子或表达盒包含一种或多种如本文所述的可操作地连接到基因的调控元件。
[0201]
表达载体可以包括控制目的多核苷酸的转录的调控元件。调控元件的非限制性实例包括启动子、多聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如，内部核糖体进入区段，ires)、增强子或内含子。此类元件可能不是必需的，尽管其可以通过影响转录、mrna的稳定性、翻译效率等来增加表达。此类元件可以根据需要包括在核酸构建体中以获得细胞中核酸的最优表达。载体还可以包括其它元件。例如，载体可以包括编码信号肽的核酸，使得所编码的多肽被导向特定的细胞位置(例如，信号分泌序列以导致蛋白被细胞分泌)或编码选择性标志物核酸。选择性标志物的非限制性实例包括嘌呤霉素、腺苷脱氨酶(ada)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、g418、aph)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、潮霉素b磷酸转移酶、胸苷激酶(tk)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(xgprt)。此类标志物对选择培养物中稳定转化体是有用的。调控序列通常可从哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因衍生。在宿主中复制的能力，通常由复制起点和选择基因赋予，以促进识别转化体。本领域技术人员可以选择合适的调控区以包括在这样的载体中。
[0202]
载体可以是基因组整合载体或“整合载体”，其可以整合到宿主细胞的染色体dna中；或附加型载体，例如，能够进行染色体外复制的核酸。能够指示载体可操作连接到的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、疱疹病毒和牛乳头状瘤病毒载体(有关病毒和非病毒载体的综述，请参见，kay等人，《美国国立科学院院报(proc.natl.acad.sci.usa)》94：12744-12746(1997)。病毒载体被修饰，因此病毒的天然嗜性和致病性已被改变或去除。病毒的基因组也可以被修饰以增加其感染性并适应编码目的多肽的核酸的包装。
[0203]
术语“aav”是腺相关病毒的缩写，并可用于指病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有血清型、亚型以及天然存在和重组形式，除非另有要求。缩写“raav”是指重组腺相关病毒，也称为重组aav载体(或“raav载体”)。术语“aav”包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rhlo及其杂种、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、灵长类aav、非灵长类aav和绵羊aav。
[0204]“慢病毒载体”在基因疗法中的使用是指一种使用慢病毒可以使基因在生物体内插入、修饰或缺失的方法。慢病毒是通过向其宿主细胞的基因组插入dna进行感染的病毒家族。许多此类病毒已成为在基因疗法中使用病毒进行研究的基础，但慢病毒在其感染非分裂细胞的能力方面是独一无二的，因此具有更广泛的潜在应用。慢病毒可以成为内源性逆转录病毒(erv)，将其基因组整合到宿主种系基因组中，使得病毒从此由宿主的后代遗传。为了在基因疗法中有效，必须插入、改变和/或去除宿主细胞基因。为此，科学家们使用慢病毒的感染机制来实现基因疗法的期望结局。可用于基因疗法的慢病毒的非限制性实例包括从牛免疫缺陷病毒、山羊关节炎脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、人类免疫缺陷病毒1、人类免疫缺陷病毒2、杰姆布拉纳病病毒、美洲狮慢病毒、猿免疫缺陷病毒或维斯纳梅迪病毒衍生的病毒。
[0205]
除了使用基于逆转录病毒和慢病毒的载体外，从诸如腺病毒和腺相关病毒(aav)等其它病毒衍生的病毒也可用于修饰造血干细胞和祖细胞。
[0206]
如本领域技术人员所知，基因修饰可以通过采用位点特异性核酸内切酶诱导dna中的双链断裂(dsb)(例如，锌指核酸酶(zfn)、类转录激活因子效应物核酸酶(talens)、成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)通过靶向基因编辑来实现。
[0207]
在另一实施例中，基因疗法可用于增强基因表达。根据一些实施例，与未经加强的转导细胞相比，经加强的转导细胞提供了增加的增殖。根据一些实施例，与未经加强的转导细胞相比，经加强的转导细胞的分化增加。在另一方面，与未经加强的转导细胞相比，用线粒体加强的转导细胞基因表达增加。根据一些实施例，与未经加强的转导细胞相比，经加强的转导细胞的表达转基因的细胞的数量增加。
[0208]
在进一步的实施例中，本发明提供了一种用于改善受试者体内造血干细胞(hsc)移植的方法，其包括在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与分离的外源性线粒体一起温育；以及向受试者施用hsc。在一个方面，hsc是经基因修饰的。在另外的方面，受试者患有选自原发性免疫缺陷(例如，维斯科特-奥尔德里奇综合征、白细胞粘附缺陷、x连锁高igm综合征、x连锁淋巴细胞增生性疾病、x连锁无丙种球蛋白血症、x连锁严重结合免疫缺陷、慢性肉芽肿性疾病)、血红蛋白病(例如，镰状细胞疾病、β型地中海贫血)、贮积和代谢障碍(例如，戈谢病和其它脂沉积症、黏多醣贮积症(i-vii)、x连锁肾上腺脑白质营
养不良、异染性脑白质营养不良、骨硬化症)、先天性血球减少症和干细胞缺陷(例如，范科尼贫血、舒-戴二氏综合征、柯士文综合征)的疾病或病症。在进一步的方面，溶酶体贮积症是i型戈谢病。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在另外的方面，外源性线粒体从供体分离。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在各个方面，在施用于受试者之前对hsc进行洗涤。
[0209]
在一个实施例中，本发明提供了一种用于通过在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将hsc与外源性线粒体一起温育以及向受试者施用hsc来治疗受试者的免疫缺陷或免疫相关性疾病的方法。在某些方面，hsc是自体或同种异体干细胞。在另外的方面，外源性线粒体从供体分离。在进一步的方面，外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。在一个方面，hsc在体外扩增。在另外的方面，hsc已经历至少一个冻融循环。在进一步的方面，hsc在体外扩增之前或之后经历至少一个冻融循环。在某些方面，hsc在与外源性线粒体一起温育之前或之后经历至少一个冻融循环。在另外的方面，允许外源性线粒体进入靶细胞的条件可以包括以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将靶细胞与外源性线粒体一起温育。
[0210]
如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”指以下两项：1)治愈、减缓、减轻症状和/或停止诊断的病理状况或病症进展的治疗处理或措施和2)防病/预防措施。那些需要治疗的个体可包括已患有特定医学病症的个体以及那些最终可能获得该病症的个体(即那些需要预防措施的个体)。
[0211]
免疫相关性疾病是影响免疫系统的疾病。此类疾病和病症包括自身免疫疾病和免疫缺陷疾病和病症。自身免疫性疾病是一种导致免疫系统产生攻击正常身体组织的抗体的疾病。自身免疫性疾病的实例包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(cfids)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、查格-施特劳斯综合征、瘢痕性类天疱疮、crest综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、盘状狼疮、原发性混合性冷凝球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、甲状腺功能减退、特发性肺纤维化、特发性血小板减少症紫癜(itp)、iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型关节炎、扁平苔藓、狼疮、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病和重症肌无力。
[0212]
免疫缺陷疾病和病症削弱免疫系统保卫身体免受入侵或攻击身体的外来或异常细胞(例如，细菌、病毒、真菌和癌细胞)的伤害的能力。因此，可能会出现不寻常的细菌、病毒或真菌感染或淋巴瘤或其它癌症。有两种类型的免疫缺陷病症：原发性和继发性。原发性免疫缺陷病症通常在出生时就表现出来，并且是通常具有遗传性的遗传病症。原发性免疫缺陷病症通常在婴儿期或儿童期变得明显。然而，一些原发性免疫缺陷病症(诸如常见的变异型免疫缺陷)直到成年才被发现。常见的原发性免疫缺陷病症的实例包括威斯科特-奥尔德里奇综合征、严重联合免疫缺陷病(scid)、迪乔治综合症、共济失调毛细血管扩张、慢性
肉芽肿性疾病、婴儿暂时性低丙种球蛋白血症、无丙种球蛋白血症、补体缺陷症和选择性iga缺陷症。
[0213]
继发性免疫缺陷病症通常在晚年发展，通常由使用某些药物或由另一个病症引起，诸如糖尿病或人类免疫缺陷病毒(hiv)感染。继发性免疫缺陷病症比原发性免疫缺陷病症更常见。常见的继发性免疫缺陷病症的实例包括hiv、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0214]
以下实例被呈现以提供对本发明的更完整的理解。为说明本发明的原理而阐述的具体技术、条件、材料、比例和报告的数据是示范性的并且不应被解释为限制本发明的范围。
[0215]
实例
[0216]
实例1：
[0217]
富集的干细胞向小鼠模型中的移植
[0218]
线粒体从健康人类供体的血液分离。线粒体在-80℃下冷冻。cd34+细胞从患有皮尔逊综合症的受试者的冷冻和融化的脐带血细胞(ubc)分离。受试者被诊断为在mtdna的8,470至13,447位上4,977个核苷酸的缺失。将线粒体融化，然后将主题cd34+细胞与0.88mu/1
×
106个细胞的人类线粒体温育22小时。随后，将培养基除去，并对细胞进行洗涤并重新悬浮在4.5％hsa中。使用序列分析，加强通过鉴定细胞中人类线粒体的存在来验证。然后将经加强的细胞进行静脉注射到3周龄nsgs小鼠(50k个细胞/小鼠)。
[0219]
对3组小鼠进行测试：mat组：nsgs小鼠以50k个细胞/150ul移植有人类经加强的cd34+细胞。对照组：nsgs小鼠以50k个细胞/150ul移植有人类cd34+细胞。原初组：原初小鼠。
[0220]
表1
[0221]
组小鼠数量mat：ubc+mito加强6对照：ubc7原初1
[0222]
移植后2个月：
[0223]
将mat组3只小鼠和对照组3只小鼠处死。抽取外周血(pb)，并且骨髓(bm)细胞从股骨和胫骨中分离。为了确定人类内源性和外源性线粒体dna(mtdna)的拷贝数，dna从bm和pb中分离，并使用dpcr进行分析。
[0224]
为了确定cd34+细胞向造血细胞亚群体的分化，在流式细胞术中对外周血和bm样本进行分析。首先，确定人类cd45+细胞％，因为cd45抗原存在于所有人类白细胞上，包括外周血中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。随后，cd45+细胞进一步分为cd45+cd33+(髓样谱系)、cd45+cd3+(t细胞)、cd45+cd19+(b细胞)、cd45+cd14+(单核细胞)亚群体。
[0225]
此外，利用流式细胞术分析来确定mcd45细胞对hcd45细胞的百分比。
[0226]
结果bm：处理后2个月，mat组和对照组之间的bm结果示于图1中。
[0227]
表2
[0228][0229]
结果pb：pb dpcr：对照组和mat组在pb中的人类线粒体拷贝数、人类细胞数和mtdna拷贝的结果示于图2中。在外周血中观察到总(外源性+内源性)mtdna拷贝/细胞显著增加。
[0230]
移植后6个月：
[0231]
将每组小鼠和原初小鼠处死。为了测量内源性和外源性人类mtdna的水平，dna从bm和外周血中分离，并使用数字pcr(dpcr)进行分析。
[0232]
结果bm：bm-dpcr展现了对照组(包含非扩增型人类细胞的小鼠)、mat组(移植有线粒体扩增的人类细胞)、ntc(“无模板”)、原初组(无处理)的外源性线粒体拷贝数/ng dna。由于所使用的snp测定基于区分内源性和外源性人类mtdna的两个等位基因(在mtdna的10831位上的g/a)的单核苷酸变异，因此对特异性等位基因的选择性并不完美，因此假阳性结果在对照组中也很明显。尽管如此，从mat小鼠衍生的bm细胞具有显著更多的外源性线粒体拷贝数/ng dna，表明mat细胞的植入增加并且细胞增殖可能增加。(图3，右侧条形图)。
[0233]
bm流式细胞术结果：移植后6个月，与从对照小鼠衍生的bm细胞相比，从mat小鼠衍生的bm细胞包含显著更高水平的cd45+人类细胞。mat小鼠中cd45+细胞的增加表明植入增加、归巢改善、细胞增殖增加、细胞活力提高或细胞凋亡减少。进一步分析人类cd45+细胞向亚群体的分化。cd45+细胞亚群体包括cd3+(t细胞)、cd14+(巨噬细胞)、cd19+(b细胞)、cd33+细胞(髓样细胞)。
[0234]
与对照相比，mat小鼠具有不同的细胞分化模式。如流式细胞术分析所见，mat小鼠具有较高百分比的cd3+细胞(t细胞)和较低百分比的cd33+细胞，而对照小鼠具有较高百分比的cd33+细胞和较低百分比的cd3+细胞。与对照小鼠相比，mat小鼠也具有较高百分比的cd19+细胞。这些结果表明从髓样细胞向淋巴样细胞的转变(图4和表3)。
[0235]
表3
[0236][0237]
实例2：
[0238]
治疗受试者的淋巴细胞缺陷/增加受试者体内淋巴细胞群体
[0239]
用于减少患有淋巴细胞缺陷相关性疾病的受试者的淋巴细胞缺陷的致衰弱作用的方法的步骤是：(1)获得自体或同种异体造血干细胞；(2)从供体的细胞中分离线粒体。外源性线粒体的分离可以在储存在-80℃(至少)冷冻并在使用之前融化的线粒体的过程之前进行；(3)将hsc与分离的外源性线粒体一起温育；(4)洗涤骨髓细胞；(5)向受试者输注与线粒体富集的hsc。在整个期间，评估患者的血细胞计数和生化血液标志物的变化。
[0240]
实例3：
[0241]
用于改善骨髓整植的线粒体加强疗法
[0242]
为了改善经调理或未经调理的患者的植入并因此改善细胞移植，细胞在移植到患者之前进行线粒体加强。一种改善对其有需要的受试者体内造血干细胞移植的方法包含(1)从受试者或供体获得造血干细胞(hsc)；(2)从供体细胞中分离线粒体(外源性线粒体的分离可以在储存在-80℃(至少)冷冻并在使用之前融化的线粒体的过程之前进行)；(3)将hsc与分离的外源性线粒体一起温育；(4)洗涤骨髓细胞；和(5)向受试者施用与线粒体富集的hsc。hsc可能是自体或同种异体造血干细胞。
[0243]
实例4：
[0244]
用于改善基因疗法的线粒体加强疗法
[0245]
hsc及其后代的有效长期基因修饰需要一种准许将校正dna稳定整合到基因组中而不影响hsc功能的技术。因此，诸如γ逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒等整合重组病毒系统的使用已经主导了该领域(chang，a.h.等人(2007)《分子疗法》15：445-456)。在针对腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada-scid；aiuti，a.等人(2009)《新英格兰医学杂志》360：447-458)、x连锁重症联合免疫缺陷(scid-x1；hacein-bey-abina，s.等人(2010)《新英格兰医学杂志》363：355-364)和威斯科特-奥尔德里奇综合征(was；boztug，k.等人(2010)《新英格兰医学杂志》363：1918-1927)的基于y逆转录病毒的临床试验中已取得治疗成效。另外，慢病毒已在x-连锁肾上腺脑白质营养不良(ald；cartier，n.等人(2009)《科学》326：818-823)、异染性脑白质营养不良(mld；biffi，a.等人(2013)《科学》341：1233158)和was(aiuti，a.等人(2013)《科学》341：1233151)的治疗方面被用作递送媒介物。
[0246]
成簇规律间隔的短回文重复序列/crispr相关(crispr/cas)系统，即crispr/cas系统，是一种用于快速基因组工程的强大工具，其中含有与靶向dna序列互补的间隔序列的单引导rna(sgrna)将dna核酸内切酶(例如，诸如cas9酶)引导至基因组靶标。结合后，cas9产生双链dna断裂。可利用dna修复机制、非同源末端接合(nhej)或同源重组(hr)来引入基因插入和缺失。crispr/cas9已在各个物种中实施，诸如大肠杆菌(escherichia coli)、酿酒酵母(s.cerevisiae)和哺乳动物细胞。dna核酸内切酶的其它实例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csyl、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3和csf4。
[0247]
crispr系统的元件(例如，同向重复序列、同源重组编辑模板、引导序列、tracrrna序列、靶序列、引发位点、调控元件和rna引导的dna内切核酸酶)是本领域技术人员所熟知的。也就是说，给定靶序列，本领域技术人员可以设计对特定靶序列具有特异性的功能性crispr元件。本文所述的方法不限于特异性crispr元件的使用。
[0248]
除了使用基于逆转录病毒和慢病毒的载体外，从诸如腺病毒和腺相关病毒(aav)等其它病毒衍生的病毒也可用于修饰造血干细胞和祖细胞。
[0249]
为了增强旨在基因疗法中使用的细胞的植入(例如，溶酶体贮积症，诸如i型戈谢病、原发性免疫缺陷)，细胞用分离的外源性线粒体进行扩增。细胞可能在基因修饰hsc之前、期间或之后进行加强供基因疗法使用。一种用于增强受试者体内细胞植入的方法包含(1)从受试者或供体获得造血干细胞(hsc)；(2)从供体细胞中分离线粒体(外源性线粒体的分离可以在储存在-80℃(至少)冷冻并在使用之前融化的线粒体的过程之前进行)；(3)将hsc与分离的外源性线粒体一起温育；(4)洗涤骨髓细胞；和(5)向受试者施用与线粒体富集的hsc。hsc可能是自体或同种异体造血干细胞。
[0250]
实例5：
[0251]
线粒体加强后线粒体功能障碍小鼠模型中外源性线粒体的连续转移
[0252]
为了评估生物分布以及经加强的hspc或其后代是否能够将患病动物模型中的线粒体转移到体内的其它细胞，将基因标记的细胞注射到线粒体功能障碍的小鼠模型(polg小鼠)中。
[0253]
使用了一种新的小鼠体内系统，该系统将有助于追踪线粒体加强的骨髓细胞或其携带的线粒体在静脉输注后的归巢位置。使用rosa
nt-ng
/pham
切除
小鼠模型，其中所有细胞核都用红色荧光(dtomato)标记，所有线粒体都用绿色荧光(蛋白cox8-dendra)标记，因此称为“红绿色”细胞。加强用从rosa
nt-ng
/pham
切除
小鼠中分离的
‘
绿色’线粒体进行。
[0254]
由于hspc和外源性线粒体的分布或持久性可能受到有机体胁迫的影响，因此使用了polg小鼠模型，其中polgd
257
a突变损害了线粒体dna聚合酶的校对功能，导致mtdna突变和缺失的积累。polg小鼠模型用经加强的红绿色hspc进行处理，以评估线粒体加强的细胞及其线粒体的体内生物分布。
[0255]
从rosant-ng/pham
切除
小鼠衍生的泛表达红色标记的细胞核(dtomato)和绿色标记的线粒体(dendra)的谱系阴性细胞(lin-)用从rosant-ng/pham
切除
小鼠的肝细胞中分离的dendra线粒体加强并注射到在25至28周(雄性)和30至35周(雌性)时给药的polg小鼠。
[0256]
表4
[0257] cox-1水平的归一化倍数#所注射的细胞/小鼠lin-雌性1.9197klin-雄性1.5242k
[0258]
加强水平用mat后细胞中mtdna编码的细胞色素c氧化酶1(cox-1)的蛋白水平进行测量。将cox-1值相对于未经处理的细胞和由杰纳斯绿评估的细胞数量归一化。
[0259]
在受体polg小鼠中，三种细胞类型可能是可识别的：1)红绿色细胞，源自所输注的细胞或其后代、2)非荧光细胞，源自polg受体和3)纯绿色细胞，提供线粒体转移到受体polg细胞的证据。
[0260]
在注射后12小时、1周和4.5个月时，抽取血液并提取bm，并通过流式细胞术和共聚焦显微镜对pb和bm两者进行分析。
[0261]
证明了外源性线粒体从输注的hspc到外周血中的内源性细胞的长期持久性和不断转移。图5a至b展示了pb内cd45
+
细胞亚群的频率。dtomato
+
dendra
+
的比例随着时间的推移从注射后12小时的0.0015％增加至注射后4.5个月的0.37％。类似地，发生线粒体转移的
dtomato-dendra
+
细胞的比例从0.0015％增加至7.3％。由于线粒体cox8-dendra2蛋白仅由rosa
nt-ng
/pham
切除
核基因组编码，因此一旦传递到polg受体细胞，则为短暂的，外周血中dtomato-dendra
+
细胞的持续存在是源自所输注的细胞或其后代的外源性线粒体不断转移的证据。
[0262]
为了确定转移到受体细胞的外源性线粒体的相对水平，外周血细胞用mitotracker深红进行染色。对接受线粒体(绿色细胞)到红绿色细胞的细胞中外源性线粒体与总线粒体之间的比率的变化倍数进行测量。
[0263]
证明了外源性线粒体在1个月时占总细胞线粒体含量的8.4％，在4.5个月时占6.1％(图6)。
[0264]
mat后4.5个月，在小鼠肾脏中也发现了含有绿色线粒体的细胞。
[0265]
由于受体polg细胞中存在绿色线粒体，因此该数据表明有外源性线粒体的持久性和不断转移。重要的是，这是外源性线粒体含量的下限，因为其受到cox8-dendra蛋白半衰期的限制。
[0266]
实例6：
[0267]
线粒体被转移到各种造血细胞类型
[0268]
使用流式细胞术对造血细胞类型进行测试以确定哪些细胞类型是细胞内线粒体转移的受体。在1个月和4.5个月的时间点，对总cd45
+
和cd45
+
dtomato-dendra
+
群体进行pb中主要免疫细胞亚群的分布的评估(图7)。
[0269]
在4.5个月的时间点，摄取外源性线粒体的髓样群体被进一步表征，并证明了单核细胞(ly6c
高
ly6g)和中性粒细胞(ly6c
+
ly6g
+
)两者摄取线粒体(图8)。
[0270]
髓样细胞群体优先摄取外源性线粒体，但许多细胞类型(包括t细胞和b细胞)都被证明能摄取线粒体。
[0271]
数据表明，源自所输注的hspc的外源性线粒体不断转移到外周血中存在的各种造血细胞类型。此外，在远处组织中携带外源性线粒体的细胞的证据表明，外源性线粒体不仅持续存在于免疫细胞中，还持续存在于非造血组织中。
[0272]
总之，已证明，在mat处理后至少4.5个月内，来自所输注的hspc的线粒体可以转移到外周血和远端组织中的另外的造血细胞。
[0273]
实例7：
[0274]
线粒体加强后细胞功能的评估
[0275]
已观察到polg小鼠外周血中的cd11b
+
髓样细胞从dtomato
+
dendra
+
细胞摄取外源性线粒体。因此，对包含外源性线粒体的cd11b
+
髓样细胞的活性水平进行进一步评估。
[0276]
dtomato
+
dendra
+
谱系阴性细胞在室温下用从rosa
nt-ng
/pham
切除
小鼠肝脏分离的dendra2
+
线粒体加强21小时，并静脉注射到polg小鼠。
[0277]
在处理后1周、1个月、3个月和4.5个月，从未经处理的polg小鼠和经处理的小鼠中对外周血(pb)进行提取。通过facs对所提取的pb进行髓样细胞分类。从未经处理或经媒介物对照处理的小鼠中提取的髓样细胞在以下测定中用作对照。
[0278]
为了评估经处理的小鼠和对照小鼠髓样细胞活性的差异，对细胞进行rnaseq以评价髓样细胞转录组的变化。类似地，对按细胞表面标志物或单细胞rnaseq分类的特异性髓样细胞亚群体(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等)进行rnaseq。另外，通过基于细胞
的测定对髓样细胞或髓样细胞亚群体活性水平进行评估，包括但不限于细胞因子表达、代谢和线粒体活性，包括atp水平、cs活性、线粒体膜电位或细胞特异性功能活性评估，诸如单核细胞到巨噬细胞分化、吞噬测定、对诱导物的响应和netosis测定。
[0279]
加强对髓样细胞亚群体的效果可使用从原初和线粒体加强的小鼠或人类pbmc分离的髓样细胞通过上述测定进行进一步评价。
[0280]
预计接受线粒体的髓样前体细胞的增殖、分化和/或活性增加，造成总血髓样细胞和髓样亚群体的出现增加。另外地，线粒体加强后，血髓样细胞将被线粒体摄取所激发，从而产生更强大的功能(例如，中性粒细胞netosis对病原体或巨噬细胞吞噬的响应)。
[0281]
实例8：
[0282]
加强对免疫缺陷细胞和基因疗法的效果
[0283]
b细胞发育进程由导致b细胞抗原受体(bcr)组装、表达和信号传导的连续事件引导。重(h)和轻(l)链免疫球蛋白基因在祖b和前b阶段(分别)重新排列，并且对完整的表面igm在未成熟阶段进行表达。进一步的发育进程和成熟提供了具有免疫能力的原初b细胞集合。布鲁顿酪氨酸激酶(btk)基因是b细胞抗原受体(bcr)信号传导通路的关键组分，并在b细胞的发育、存活和激活中起关键作用。btk的表达不限于b细胞，因为btk也在包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的髓样谱系的细胞中表达。x连锁缺陷(xid)小鼠携带btk基因的自发突变。由于b细胞发育受损，xid小鼠被用作人类x连锁免疫缺陷病症的模型。例如，x连锁无丙种球蛋白血症(xla)，这是一种由布鲁顿酪氨酸激酶(btk)基因突变引起的遗传病症。这些突变导致b淋巴细胞成熟失败、血清免疫球蛋白水平低和特异性抗体产生失败以及其它免疫信号的交替。
[0284]
这些实验确定了加强对免疫缺陷细胞和基因疗法的效果。这是通过测试用btk基因加强并转导的免疫缺陷细胞的b细胞发育来完成的。
[0285]
lin-细胞从xid小鼠的骨髓中分离。将细胞与或不与从c57bl/6j小鼠胎盘衍生的线粒体(4.4mu cs活性/1
×
106个细胞)温育21小时。在温育后，经加强和未经加强的细胞、相同数量的细胞要么未转导，要么用ntx109或ntx101慢病毒构建体转导。每个构建体包含包含btk启动子btk转基因-a2-gfp(绿色荧光蛋白)的盒。表5示出了所测试的组。
[0286]
表5
[0287][0288][0289]
转导后二十二小时，对细胞进行洗涤并铺板以进行恢复。在第2天到第13天，细胞在诱导b细胞增殖和分化的条件下培育，诸如在存在il 7的情况下培育细胞。在第13天，细胞用lps/cpg进行诱导以进行b细胞成熟，使细胞能够分化成表达b220和igm的细胞。在第13天和第17天，细胞使用流式细胞术进行分析以确定绝对细胞数量和b细胞亚群体。实验方案
示于图9中。
[0290]
在第13天，与相应的未经加强的ntx101和未经加强的ntx109细胞相比，在经加强的ntx101细胞和经加强的ntx109细胞中观察到绝对细胞数量分别增加了11.4倍和5倍。另外地，经加强的ntx109细胞的细胞数量对应于wt细胞数量(图10)。与未经加强的非转导lin-细胞相比，在经加强的非转导lin-细胞中观察到绝对细胞数量增加了6.9倍(图10)。
[0291]
之后的hspc群体在第13天确定(图11a至b)。与未经加强的非转导lin-细胞相比，经加强的非转导lin-细胞的hspc群体百分比减少了47％。与未经加强的非转导lin-细胞相比，未经加强的ntx101细胞展现出hspc群体百分比减少了11％。然而，与未经加强的非转导lin-细胞相比，经加强的ntx101细胞展现出hspc群体百分比减少了31％。与未经加强的ntx101细胞相比，经加强的ntx101细胞展现出hspc群体百分比减少了22％。与未经加强的非转导lin-细胞相比，未经加强的ntx109细胞展现出hspc群体百分比减少了22％。然而，与未经加强的非转导lin-群体相比，在经加强的ntx109群体中观察到hspc群体百分比减少了37％。另外地，与未经加强的ntx109细胞相比，在经加强的ntx109细胞中观察到hspc群体百分比降减少了19％。另外地，表5中所描述的经加强的组与其相应的未经加强的组相比包含显著更多的hspc(图11b)。
[0292]
b细胞群体(前b和祖b细胞)在加强后13天确定。加强后观察到更高的前b细胞群体百分比。与未经加强的ntx101细胞相比，在经加强的ntx101细胞中观察到前b细胞百分比增加了1.76倍。与未经加强的ntx109细胞相比，在经加强的ntx109细胞中观察到前b细胞百分比增加了1.73倍。与未经加强的非转导细胞相比，在经加强的非转导lin-细胞中观察到前b细胞百分比增加了1.14倍(图12)。
[0293]
进行加强后对细胞13的免疫表型分析(图13a至b)。经加强的ntx101细胞中的祖/前b细胞比率为2.54，而未经加强的ntx101细胞中的祖/前b细胞比率为6.6。因此，与未经加强的ntx101细胞相比，经加强的ntx101细胞中祖b/前b细胞比率减少了62％。与未经加强的ntx109细胞相比，经加强的ntx109细胞中的祖b/前b细胞比率减少了53％(祖b/前b细胞比率：分别为4.7对9.9)。经加强的ntx109细胞的祖b/前b细胞比率与在wt细胞中发现的比率类似。与未经加强的非转导lin-细胞相比，经加强的非转导lin-细胞的祖b/前b细胞比率未观察到显著变化(比率：2.12对2.17)。另外地，表5中所描述的经加强的组与其相应的未经加强的组相比包含显著更多的前b细胞和祖b细胞(图13b)。
[0294]
细胞数量和b细胞群体在加强后17天确定(图14)。加强后十七天，与未经加强的非转导lin-细胞相比，经加强的非转导细胞展现出细胞数量增加了18倍(分别为3,980个细胞对72,500个细胞)。另外地，17天后，与wt相比，经加强的非转导细胞包含多1.9倍的细胞(分别为72,500对37,000个细胞)。经加强的非转导细胞的b细胞群体百分比比未经加强的非转导细胞的b细胞群体高7.4倍，占细胞群体的38.88％，相比之下，未经加强的非转导lin-细胞的b细胞群体占细胞群体的5.2％。与未经加强的转导细胞相比，加强且转导的细胞展现出多35倍和16倍的细胞(ntx101包含1，259个细胞，而经加强的ntx101包含45,000个，并且ntx109包含3,932个细胞，而经加强的ntx109包含65,500个)。与未经加强的ntx101细胞相比，观察到经加强的ntx101 lin-细胞的b细胞群体百分比增加了3.3倍(66.9％对28.4％)。与未经加强的ntx109细胞相比，观察到经加强的ntx109细胞的细胞群体的b细胞群体百分比增加了1.26倍(53.8％对42.6％)。
[0295]
在加强后十七天确定加强对igm阳性b细胞的效果(图15)。转导细胞在加强后未显示细胞群体中igm阳性百分比的增加。igm阳性b细胞占经加强的ntx101群体的13.7％，相比之下，未经加强的ntx101的igm阳性细胞占19.7％。对于nxt109，经加强的ntx109细胞的细胞群体中的17.11％是igm阳性细胞，相比之下，未经加强的ntx109群体的25.61％的细胞是igm阳性细胞。然而，与未经加强的非转导lin-细胞相比，经加强的非转导细胞展现出igm阳性b细胞群体的百分比增加了5.8倍(分别为13.05％对2.24％)。经加强的细胞中igm阳性细胞群体的百分比比wt对照小鼠(cba)衍生的lin-细胞中的igm阳性b细胞百分比高2.5倍(分别为13.05％对5.20％)。虽然与未经加强的转导细胞相比，经加强的转导细胞中igm阳性b细胞的细胞群体相对部分(即细胞百分比)较低，但在进行加强的细胞中，总细胞的绝对数量显著更高，因此igm阳性b细胞的绝对数量也显著更高。
[0296]
在加强后十三天确定基因表达(图16)。在b细胞分化过程中从每组细胞中提取相同的细胞数，并使用流式细胞术进行gfp表达的分析。如gfp所反映的，与未经加强的ntx109细胞相比，在经加强的ntx109细胞中观察到表达btk的细胞的百分比增加了2.62倍(图16)，表明经加强的ntx109的转导增加。与未经加强的ntx101细胞相比，在经加强的ntx101细胞中未观察到gfp表达增加。
[0297]
在加强后十三天确定基因表达(图17)。与未经加强的ntx109细胞相比，经加强的ntx109细胞中的btk表达增加4.2倍(分别为14.52％对3.43％)。
[0298]
如通过细胞的绝对数量所测量的，与未经加强的细胞或与wt细胞相比，经加强的xid lin-细胞(转导和非转导)展现出细胞增殖增加。经加强的xid lin-细胞(转导和非转导)展现出群体的hspc百分比减少。与未经加强的细胞相比，经加强的xid lin-细胞(转导和非转导)展现出群体的b细胞百分比增加和绝对细胞数量增加，表明b细胞分化增强。与未经加强的非转导细胞相比，经加强的非转导细胞中igm阳性细胞的百分比更高。与未经加强的组相比，进行加强的所有细胞组中总细胞的绝对数量显著更高，因此igm阳性b细胞的绝对数量也显著更高。与未经加强的ntx109细胞相比，用ntx109载体转导的经加强的细胞展现出btk表达细胞的百分比增加，这表明加强在恢复xid lin-细胞中的btk表达方面具有有益效果。
[0299]
实例9：
[0300]
加强对基因疗法的效果
[0301]
对致死性照射的xid小鼠移植用慢载体(xid
ptc9
)或wtlin-细胞(xid
cba/ca
)转导的经加强或未经加强的xid lin-细胞的效果进行评估。
[0302]
xid小鼠移植有经加强(mnv)或未经加强的(nt)xidlin-细胞，这些细胞在pgk组成型启动子下用包含gfp转基因的ptc9慢载体转导。与非转导xid和wt lin-细胞相比，对转导细胞进行并行体外表征以通过测量相对载体拷贝数(vcn)和gfp的蛋白表达来评价细胞产物中转基因的表达水平。
[0303]
在所有测试条件下，相对vcn都表露出可比较的基因组整合事件。转基因表达(gfp阳性细胞的百分比)在所有转导细胞(经加强的和对照)中都很明显(图18)。
[0304]
在将转导的xid lin-细胞移植到xid小鼠后六周收集血液，并使用流式细胞术对转基因表达进行评估(对于nt ptc9，n＝5只小鼠，对于mnv ptc9，n＝4只小鼠)。
[0305]
虽然动物之间在表达gfp的细胞的百分比方面有差异，但加强提高了表达gfp的细
胞的最小、最大和平均百分比(图19)。表6示出了在每个所测试的转基因和wt动物中表达gfp的细胞的百分比。
[0306]
表6
[0307][0308][0309]
尽管已经参照上述实例描述了本发明，但应当理解，修改和变化涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由以下权利要求限制。

技术特征：
1.一种提高受试者体内白细胞水平的方法，其包含：a)从受试者获得靶细胞；b)从供体细胞获得外源性线粒体；c)通过在允许所述外源性线粒体进入所述靶细胞的条件下使所述靶细胞与所述外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞；和d)向所述受试者施用所述线粒体富集的靶细胞，其中所述线粒体富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于所述靶细胞的线粒体含量，从而提高受试者体内白细胞的水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞、cd34+细胞及其任何组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞是cd34+细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞从全血、血液部分、外周血、pbmc、血清、血浆、脂肪组织、胎盘、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓获得。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：年龄相关性病症、癌症、肌肉疾病和病症、糖原贮积疾病和病症、血管内皮病症或疾病、脑病症或脑疾病、胎盘病症或胎盘疾病、胸腺病症或胸腺疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病或肾脏病症、原发性线粒体疾病、胰腺病症或胰腺疾病、前列腺病症或前列腺疾病、肾脏病症或肾脏疾病、血液病症或血液疾病、心脏疾病或心脏病症、皮肤病症或皮肤疾病、免疫和炎性疾病和病症、骨疾病或骨病症、胃肠疾病或胃肠病症、眼部疾病或眼部病症和感染。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源性线粒体是分离或部分纯化的冻融人类线粒体。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源性线粒体构成所述线粒体富集的靶细胞中总线粒体含量的至少1％。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源性线粒体从选自由以下组成的组的人类细胞或组织衍生：胎盘、培养物中培育的胎盘细胞、血细胞和干细胞。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体富集的靶细胞的线粒体含量通过选自由以下组成的组的测定来确定：至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；柠檬酸合酶的活性水平；氧(o2)消耗率；三磷酸腺苷的产生率；线粒体dna含量、异质性水平及其任何组合。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体富集的靶细胞的施用是静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内施用。12.根据权利要求1所述的方法，其中将数量介于至少5
×
105和5
×
109之间的线粒体富集的靶细胞施用于所述受试者。13.根据权利要求1所述的方法，其中与线粒体富集之前的靶细胞相比，所述线粒体富集的靶细胞具有：a)提高的至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；b)提高的氧(o2)消耗率；
c)提高的柠檬酸合酶活性水平；d)提高的三磷酸腺苷(atp)产生率；e)提高的线粒体dna含量；f)较低的异质性水平；或g)其任何组合。14.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在施用于所述受试者之前向所述线粒体富集的靶细胞添加药学上可接受的载体。15.根据权利要求1所述的方法，其中允许所述外源性线粒体进入所述靶细胞的所述条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将所述靶细胞与所述外源性线粒体一起温育。16.一种用于提高受试者体内淋巴样细胞的水平的药物组合物，其包含线粒体富集的靶细胞和药学上可接受的载体，其中所述线粒体富集的靶细胞富集有外源性线粒体。17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述线粒体富集的靶细胞由包含以下步骤的方法产生：a)从罹患疾病或病症的受试者或从供体获得靶细胞；b)从供体获得外源性线粒体；和c)通过在允许所述外源性线粒体进入所述靶细胞的条件下使所述靶细胞与所述外源性线粒体接触来产生线粒体富集的靶细胞，其中所述线粒体富集的靶细胞的线粒体含量可检测地高于所述靶细胞的线粒体含量。18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、共同髓样祖细胞、共同淋巴样祖细胞、cd34+细胞及其任何组合。19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述靶细胞是cd34+细胞。20.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述靶细胞从全血、血液部分、外周血、pbmc、胎盘、血浆、脂肪组织、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓获得。21.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述外源性线粒体是分离或部分纯化的冻融人类线粒体。22.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述靶细胞是自体的。23.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述外源性线粒体是自体的。24.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述线粒体富集的靶细胞的所述线粒体含量通过选自由以下组成的组的测定来确定：至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；柠檬酸合酶的活性水平；氧(o2)消耗率；三磷酸腺苷的产生率；线粒体dna含量及其任何组合。25.根据权利要求17所述的药物组合物，其中与线粒体富集之前的靶细胞相比，所述线粒体富集的靶细胞具有：a)提高的至少一种选自sdha和cox1的线粒体蛋白的含量；b)提高的氧(o2)消耗率；c)提高的柠檬酸合酶活性水平；d)提高的三磷酸腺苷(atp)产生率；
e)提高的线粒体dna含量；或f)较低的异质性水平；或g)其任何组合。26.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述受试者患有疾病或病症。27.根据权利要求26所述的药物组合物，所述疾病或病症选自由以下组成的组：年龄相关性病症、癌症、肌肉疾病和病症、糖原贮积疾病和病症、血管内皮病症或疾病、脑病症或脑疾病、胎盘病症或胎盘疾病、胸腺病症或胸腺疾病、自身免疫性疾病、肾脏疾病或肾脏病症、原发性线粒体疾病、胰腺病症或胰腺疾病、前列腺病症或前列腺疾病、肾脏病症或肾脏疾病、血液病症或血液疾病、心脏疾病或心脏病症、皮肤病症或皮肤疾病、免疫和炎性疾病和病症、骨疾病或骨病症、胃肠疾病或胃肠病症、眼部疾病或眼部病症和感染。28.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物施用于所述受试者。29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中将数量介于至少5
×
105和5
×
109之间的线粒体富集的靶细胞施用于所述受试者。30.根据权利要求17所述的药物组合物，其中允许所述外源性线粒体进入所述靶细胞的所述条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将所述靶细胞与所述外源性线粒体一起温育。31.一种用于减少受试者的一种或多种淋巴细胞缺陷相关性疾病的致衰弱作用的方法，其包含：(a)在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将所述hsc与所述外源性线粒体一起温育；和(b)向所述受试者施用来自(a)的所述hsc。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述hsc是自体或同种异体干细胞。33.根据权利要求30所述的方法，其中所述外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。34.根据权利要求30所述的方法，其中允许所述外源性线粒体进入所述hsc的所述条件包含约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率。35.一种用于改善受试者体内造血干细胞(hsc)移植的方法，其包含：(a)在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将所述hsc与所述外源性线粒体一起温育；和(b)向所述受试者施用来自(a)的所述hsc。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述hsc是自体或同种异体干细胞。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。38.根据权利要求35所述的方法，其中所述hsc在体外扩增。39.根据权利要求35所述的方法，其中所述hsc已经历至少一个冻融循环。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述hsc在体外扩增之前或之后已经历至少一个冻融循环。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述hsc在与所述外源性线粒体一起温育之前或之后已经历至少一个冻融循环。42.根据权利要求35所述的方法，其中允许分离的线粒体进入所述hsc的条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将所述靶细胞与所述外源性线粒体
一起温育。43.一种用于增强受试者体内用于基因疗法的细胞植入的药物组合物，其包含线粒体富集的靶细胞和药学上可接受的载体，其中所述线粒体富集的靶细胞富集有外源性线粒体。44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述靶细胞在用所述外源性线粒体富集之前、期间或之后已进行基因修饰。45.一种用于治疗受试者的免疫缺陷或免疫相关性疾病的方法，其包含：(a)在允许外源性线粒体进入造血干细胞(hsc)的条件下将所述hsc与所述外源性线粒体一起温育；和(b)向所述受试者施用来自(a)的所述hsc。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述hsc是自体或同种异体干细胞。47.根据权利要求45所述的方法，其中所述外源性线粒体已经历至少一个冻融循环。48.根据权利要求45所述的方法，其中所述hsc在体外扩增。49.根据权利要求45所述的方法，其中所述hsc已经历至少一个冻融循环。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述hsc在体外扩增之前或之后已经历至少一个冻融循环。51.根据权利要求49所述的方法，其中所述hsc在与所述外源性线粒体一起温育之前或之后已经历至少一个冻融循环。52.根据权利要求45所述的方法，其中允许分离的线粒体进入所述hsc的条件包含以约0.088至176mu柠檬酸合酶(cs)活性/106个细胞的比率将所述靶细胞与所述外源性线粒体一起温育。53.一种治疗疾病或病症的方法，其包含：a)通过在允许外源性线粒体进入细胞的条件下使所述细胞与所述外源性线粒体接触来产生线粒体富集的细胞，b)用包含目的基因的病毒载体转导线粒体富集的细胞；和c)向受试者施用所述线粒体富集的转导细胞，从而治疗所述疾病或病症。54.一种治疗疾病或病症的方法，其包含：a)用包含目的基因的病毒载体转导细胞；b)通过在允许外源性线粒体进入所述细胞的条件下使所述转导细胞与所述外源性线粒体接触来产生线粒体富集的转导细胞；和c)向受试者施用所述线粒体富集的转导细胞，从而治疗所述疾病或病症。55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述细胞是干细胞。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞(hsc)。57.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述细胞是免疫缺陷细胞。58.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体。59.根据权利要求53或54所述的方法，其中与未经加强的细胞相比，所述线粒体富集的
转导细胞的施用增加了b细胞的数量。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述b细胞是前b或祖b细胞。61.根据权利要求53或54所述的方法，其中与未经加强的细胞相比，所述线粒体富集的转导细胞的所述施用增加了igm阳性细胞的数量。62.根据权利要求53所述的方法，其中线粒体富集增加了转导细胞的数量。

技术总结
本发明提供了使骨髓提高白细胞产生率的方法和组合物。具体地，本发明提供了用于通过提供线粒体富集的细胞来提高受试者体内CD45+细胞水平的方法和组合物。进一步地，本申请提供了用于增加骨髓细胞结构、CD34+细胞的植入和分化的方法。和分化的方法。


技术研发人员：N
受保护的技术使用者：米诺维亚治疗公司
技术研发日：2021.03.29
技术公布日：2022/12/2