包含
β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物、以及其品质评估方法及酶反应性的判定方法
技术领域
1.本发明涉及一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物、以及其品质评估方法及酶反应性的判定方法。
背景技术：2.β-烟酰胺单核苷酸(以下有时称为“β-nmn”)是辅酶nad+的生物合成中间代谢产物。近年来，据报告，β-nmn具有在老化小鼠中改善胰岛素分泌能力的效果、在由高脂肪饮食及老化诱发2型糖尿病的小鼠模型中大幅改善胰岛素敏感性及分泌的效果(例如参照专利文献1)；参与昼夜节律的控制(例如参照专利文献2)；具有显著增强老化肌肉的粒线体功能的效果等。另外还报告了β-nmn的给药可用于改善或预防随着衰老产生的各种疾病的症状，譬如肥胖、血脂浓度上升、胰岛素敏感性降低、记忆力下降、及黄斑变性症等眼部功能变差(例如参照专利文献3)。另外，β-nmn的给药通过提高活体中的nad+量，激活长寿基因(sirtuin)，而抑制、延缓随着活体衰老产生的身体机能下降，从而期待抗老化的效果(例如参照专利文献4)。
3.另一方面，提出在将β-nmn应用于医药、补充品、及化妆品等时，使其结晶化以提高β-nmn的纯度，或提升保存稳定性(例如参照专利文献5及6)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：美国专利第7737158号说明书
7.专利文献2：美国专利申请公开第2011/123510号说明书
8.专利文献3：国际公开第2014/146044号
9.专利文献4：国际公开第2017/200050号
10.专利文献5：日本专利特表2018-534265号公报
11.专利文献6：国际公开第2018/047715号
技术实现要素：12.[发明要解决的问题]
[0013]
本发明人等发现，自己制造的β-烟酰胺单核苷酸、及在市场上能获取的β-nmn制品尽管同样地利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography；以下有时称为“hplc”)测定时的纯度高，但在给药至活体时即便给药量相同也无法获得同样的效果，另外，即便进行结晶化来提高纯度，也同样如此。即，存在虽然利用hplc测定时的纯度同等，但生理活性却不同的β-nmn，因此需要提供生理活性更高的β-nmn。
[0014]
本发明的课题在于，根据此种需求，打破现状，解决以往的所述各种问题，从而达成以下目的。即，本发明的目的在于提供一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物、以及包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质评估
方法及酶反应性的判定方法，所述包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的利用hplc测定时的纯度高，且表现出的酶反应性高，由此具有的生理活性高。
[0015]
[解决问题的技术手段]
[0016]
本发明人等为了达成所述目的而进行了努力研究，结果发现，虽然利用hplc测定时的纯度同等，但生理活性却不同的原因在于这些制品中的β-nmn的酶反应性有所不同，从而完成本发明。
[0017]
本发明是基于本发明人等的所述见解而成的，解决所述课题的方法如下所示。即，
[0018]
＜1＞一种化合物，其是包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物，其特征在于：利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上。
[0019]
＜2＞根据所述＜1＞记载的化合物，其利用hplc测定时的纯度为98％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为33单位以上。
[0020]
＜3＞根据所述＜1＞或＜2＞记载的化合物，其为结晶形态。
[0021]
＜4＞根据所述＜1＞至＜3＞中任一项记载的化合物，其中乳酸脱氢酶为源自哺乳类的骨骼肌的乳酸脱氢酶。
[0022]
＜5＞根据所述＜4＞记载的化合物，其中乳酸脱氢酶具有seq id no:1的氨基酸序列。
[0023]
＜6＞根据所述＜1＞至＜5＞中任一项记载的化合物，其实质上不含烟酰胺二核苷酸。
[0024]
＜7＞一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质评估方法，其特征在于包括：
[0025]
将利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上作为指标，评估所述包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质。
[0026]
＜8＞一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的酶反应性的判定方法，其特征在于包括：
[0027]
将利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上作为指标，判定所述包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的对乳酸脱氢酶的反应性。
[0028]
[发明的效果]
[0029]
根据本发明，可解决以往的所述各种问题，从而达成所述目的，可提供一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物、以及包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质评估方法及酶反应性的判定方法，所述包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的利用hplc测定时的纯度高，且表现出的酶反应性高，由此具有的生理活性高。
附图说明
[0030]
图1是表示β-nmn与乳酸脱氢酶的反应的图。
[0031]
图2是表示在试验例1中所测得的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品对乳酸脱氢酶(seq id no:1)的酶反应性的曲线图。
[0032]
图3a是表示在试验例3中所测得的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品对源自猪的乳酸脱氢酶(ldh)1(seq id no:4)的酶反应性的曲线图。
[0033]
图3b是表示在试验例3中所测得的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品对源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)1(seq id no:2)的酶反应性的曲线图。
[0034]
图3c是表示在试验例3中所测得的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品对源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)5(seq id no:3)的酶反应性的曲线图。
[0035]
图4a是表示在试验例4中所测得的乳酸脱氢酶(seq id no:1)对于各种浓度的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品1的相对活性值的曲线图。
[0036]
图4b是表示在试验例4中所测得的乳酸脱氢酶(seq id no:1)对于各种浓度的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品2的相对活性值的曲线图。
[0037]
图4c是表示在试验例4中所测得的乳酸脱氢酶(seq id no:1)对于各种浓度的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品3的相对活性值的曲线图。
[0038]
图4d是表示在试验例4中所测得的源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)1(seq id no:2)对于各种浓度的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品1的相对活性值的曲线图。
[0039]
图4e是表示在试验例4中所测得的源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)1(seq id no:2)对于各种浓度的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品2的相对活性值的曲线图。
[0040]
图4f是表示在试验例4中所测得的源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)1(seq id no:2)对于各种浓度的本发明的一例的β-nmn化合物及市售的β-nmn制品3的相对活性值的曲线图。
[0041]
图5a是表示根据在试验例5中所测得的使用本发明的一例的β-nmn化合物时的细胞内外的ast活性所求出的细胞毒性率(細胞障害率)的曲线图。
[0042]
图5b是表示根据在试验例5中所测得的使用β-nmn制品3时的细胞内外的ast活性所求出的细胞毒性率的曲线图。
[0043]
图6a是表示在试验例5中所测得的使用本发明的一例的β-nmn化合物时的细胞内nad含量的曲线图。
[0044]
图6b是表示在试验例5中所测得的使用β-nmn制品3时的细胞内nad含量的曲线图。
具体实施方式
[0045]
(化合物)
[0046]
本发明的化合物是包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物，且利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上。
[0047]
β-烟酰胺单核苷酸存在α、β这2种光学异构体，本发明的β-烟酰胺单核苷酸(cas编号：1094-61-7)的结构如下所示。
[0048]
[化1]
[0049][0050]
作为本发明的包含β-nmn或其药理学上所容许的盐的化合物(以下，有时称为“β-nmn化合物”)，可通过任意方法来制备。例如可将通过化学合成法、酶法、发酵法等而人工合成出的β-nmn纯化后用作有效成分。另外，β-nmn是广泛存在于活体中的成分，因此还可以将从动物、植物、微生物等天然原料中提取、纯化而获得的β-nmn用作有效成分。另外，还可以使用市售的纯化β-nmn。
[0051]
作为合成β-nmn的化学合成法，例如可通过使烟酰胺与l-核糖四乙酸酯反应，对所获得的烟酰胺单核苷酸进行磷酸化而制造β-nmn。另外，作为酶法，例如可通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(以下，有时称为“nampt”)，由烟酰胺及5'-磷酸核糖-1'-焦磷酸(以下，有时称为“prpp”)制造β-nmn，也可通过烟酰胺核苷激酶，由烟酰胺核苷制造β-nmn。另外，作为发酵法，例如可利用表达nampt的微生物的代谢系统，由烟酰胺制造β-nmn。
[0052]
所述β-nmn也可以是药理学上所容许的盐。作为所述β-nmn的药理学上所容许的盐，可以是无机酸盐，也可以是具有胺之类的碱性部位的有机酸盐。作为构成此种酸盐的酸，例如可例举：乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯基磺酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、顺丁烯二酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、半乳糖二酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。另外，作为β-nmn的药理学上所容许的盐，可以是碱金属盐，也可以是具有羧酸之类的酸性部位的有机盐。作为构成此种酸盐的碱，例如可例举碱金属盐或碱土类金属盐，其是由氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌、氨、三甲氨、三乙氨、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、n-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲基铵等碱衍生的盐。
[0053]
作为本发明的β-nmn化合物，可以是结晶形态，也可以是非晶形(amorphous)，但为了将杂质的混入抑制得更低，为了能进一步提高作为化合物的稳定性，优选通过使用甲醇溶液或乙醇等含醇类溶液的结晶步骤来进行结晶化后所得的β-nmn化合物。β-nmn化合物的结晶化方法并无特别限制，可适当选择公知的方法，例如可依照日本专利特表2018-534265号公报或国际公开第2018/047715号中所记载的方法来进行。
[0054]
＜hplc纯度＞
[0055]
作为本发明的β-nmn化合物的纯度，如果利用hplc测定时的纯度(以下，有时称为“hplc纯度”)为95％以上，就没有特别限制，可适当选择，但优选为98％以上。
[0056]
本发明中的hplc纯度意指利用hplc测定含有β-nmn的试样而检测到的源自nmn的峰面积相对于各峰面积的总量的比率。具体而言，可根据下述式求出。
[0057]-式-[0058]
hplc纯度(％)＝(源自β-nmn的峰面积)/(所测定的峰面积的总量)
×
100
[0059]
在本发明中，作为测定hplc纯度时的hplc分析方法，如果是能高效率地分离、测定β-nmn的方法、条件，就没有特别限制，可适当选择，例如可使用hypercarb
tm
(长度：15cm、内
径：4.6mm、粒径：3μm、赛默飞世尔科技公司制造)作为色谱柱，利用“yoshino,et al.,cell metabolism,2011年,vol.14,p.528-536.”中记载的方法进行测定，或者可使用tsk-gel ods色谱柱(长度：15cm、内径：4.6mm、粒径：5μm、东曹公司制造)作为色谱柱，利用“vitamin杂志、1990年、第64卷第1号、第19～25页”中记载的方法进行测定。在本发明中利用以下的方法进行了测定。
[0060]
·
hplc机器使用hplc系统prominence(岛津制作所制造)。
[0061]
·
使β-nmn试样以达到2mm的方式溶解于蒸馏水中，将其作为试样液。
[0062]
·
将试样液10μl应用于tsk-gel ods-80ts色谱柱(长度：15cm、内径：4.6mm、粒径：5μm、东曹公司制造)。
[0063]
·
色谱柱所吸附的β-nmn组分的分离可利用以下的方法实施。
[0064]
使用50mm三羟甲基氨基甲烷醋酸盐(ph 7.5)/甲醇作为洗脱液，在0-15％甲醇的浓度梯度下，将流速调整为0.7ml/分钟，进行洗脱、分离，并在吸光度260nm时进行测定。
[0065]
＜酶反应性＞
[0066]
另外，作为本发明的β-nmn化合物对乳酸脱氢酶的反应性(以下，有时称为“酶反应性”)，如果是30单位以上，就没有特别限制，可适当选择，但优选为33单位以上。
[0067]
本发明中的乳酸脱氢酶(以下，有时称为“ldh”)是也被称为l-乳酸脱氢酶(ec 1.1.1.27)的脱氢酶。
[0068]
作为所述乳酸脱氢酶，优选源自哺乳类的骨骼肌的乳酸脱氢酶，更优选具有seq id no:1的氨基酸序列、包含亚单位的四聚体的源自骨骼肌的乳酸脱氢酶(ldh)5(以下，有时称为“r-ldh5”)，但也可以使用哺乳类的其它乳酸脱氢酶，例如源自猪的乳酸脱氢酶(ldh)1、源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)1、源自人类的乳酸脱氢酶(ldh)5等。关于ldh，以乳酸为受质，催化脱氢反应而会转化为丙酮酸，但此时β-nmn会被转化为还原型β-nmn(参照图1)。
[0069]
本发明中，酶反应性是指通过以下试剂及方法进行测定所获得的值。
[0070]
＜r1试剂＞
[0071]
·
80mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(ph 8.5)
[0072]
·
19mmβ-nmn
[0073]
(假设测定试样中的β-nmn的纯度为100％。另外，β-nmn预先溶解于80mm碳酸钠溶液中)
[0074]
＜r2试剂＞
[0075]
·
100mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(ph 8.5)
[0076]
·
100mm l-乳酸
[0077]
＜酶溶液＞
[0078]
·
以ldh在反应液中的终浓度达到245u/ml的方式调整酶溶液。
[0079]
本发明中，ldh的活性单位(u)是使用nad作为辅酶时的活性单位，使用通过符合ifcc标准的人类ldh测定法进行测定时的活性单位。
[0080]
＜活性测定＞
[0081]
测定酶活性时，使用7180型日立自动分析装置(日立高新技术公司制造)。测定参数如下所示。
[0082]-测定参数-[0083]
·
分析方法
···
a级
[0084]
·
测定波长(副/主)
···
405nm/340nm
[0085]
·
反应时间
···
10分钟
[0086]
·
测光点
···
20-24
[0087]
·
试样液(酶溶液)
···
18μl
[0088]
·
r1试剂
···
120μl
[0089]
·
r2试剂
···
87μl
[0090]-测定顺序-[0091]
将酶溶液18μl与r1试剂120μl加以混合，在37℃下温育4.5分钟后(测光点1-16)，添加r2试剂87μl开始反应(测光点17)。用反应开始后1-2分钟(测光点20-24)的测定试样的吸光值减去同一测光点处的水(空白)的吸光度，算出每分钟的吸光度变化值(δmabs/min)。活性单位(对乳酸脱氢酶r-ldh5的反应性单位)是将每分钟的0.1mabs的吸光度变化值作为1单位。
[0092]
本发明的β-nmn化合物优选实质上不含烟酰胺二核苷酸(以下，有时称为“nad”)。其原因在于：当包含nad时，有可能无法准确地测定对乳酸脱氢酶的反应性。
[0093]
本发明中，所谓实质上不含烟酰胺二核苷酸是指在上文所述的hplc分析中未检测出所述β-nmn化合物中的nad。此外，并不排除在调配本发明的β-nmn化合物的制剂或饮食品中含有nad的实施方式。
[0094]
本发明的β-nmn化合物不仅利用hplc测定时的纯度高，而且所具有的对乳酸脱氢酶的酶反应性高。因此，与以往的β-nmn制品(原料药)相比，本发明的β-nmn化合物的生物利用度高，作为β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐及含有其的制品，品质很高且具有较高的生理作用。因此，不仅作为以β-nmn作为有效成分的医药而非常有效，而且作为饮食品(包括但并不限定于补充品)或饲料的原料也非常有效，或者可以通过给药或摄取来实现更好的效果。
[0095]
(化合物的品质评估方法)
[0096]
本发明的化合物的品质评估方法是包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质评估方法，该品质评估方法至少包括评估步骤，视需要进一步包括测定步骤等其它步骤。
[0097]
＜评估步骤＞
[0098]
本发明的化合物的品质评估方法中的评估步骤是如下步骤：将利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上作为指标，对包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质进行评估。
[0099]
作为所述利用hplc测定时的纯度的指标，如果是95％以上，就没有特别限制，可适当选择，但优选为98％以上。
[0100]
作为所述对乳酸脱氢酶的反应性的指标，如果是30单位以上，就没有特别限制，可适当选择，但优选为33单位以上。
[0101]-评估-[0102]
在本发明的化合物的品质评估方法中的评估步骤中，在作为评估对象的包含β-烟
酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上的情况下，评估为所述评估对象的品质良好。更具体而言，在利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上的情况下，评估为所述评估对象是生物利用度高的包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物。
[0103]
所述利用hplc测定时的纯度及对乳酸脱氢酶的反应性可以是在进行本发明的化合物的品质评估方法时所测得的，也可以是另外测得的。
[0104]
＜其它步骤＞
[0105]
作为本发明的化合物的品质评估方法中的其它步骤，只要无损本发明的效果，就没有特别限制，可适当选择，例如可例举测定步骤等。
[0106]-测定步骤-[0107]
本发明的化合物的品质评估方法中的测定步骤是如下步骤：测定作为评估对象的包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的利用hplc测定时的纯度及对乳酸脱氢酶的反应性。
[0108]
所述利用hplc测定时的纯度及对乳酸脱氢酶的反应性可通过与上文中所述的(化合物)的＜hplc纯度＞的项目及＜酶反应性＞的项目中所记载的相同方式来测定。
[0109]
(化合物的酶反应性的判定方法)
[0110]
本发明的化合物的酶反应性的判定方法是包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的酶反应性的判定方法，该判定方法至少包括判定步骤，视需要进一步包括其它步骤。
[0111]
＜判定步骤＞
[0112]
本发明的化合物的酶反应性的判定方法中的判定步骤是如下步骤：将利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上作为指标，对包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的酶反应性进行判定。
[0113]
作为所述利用hplc测定时的纯度的指标，如果是95％以上，就没有特别限制，可适当选择，但优选为98％以上。
[0114]
作为所述对乳酸脱氢酶的反应性的指标，如果是30单位以上，就没有特别限制，可适当选择，但优选为33单位以上。
[0115]-判定-[0116]
在本发明的化合物的酶反应性的判定方法中的判定步骤中，在作为判定对象的包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上的情况下，判定为所述判定对象的酶反应性高。更具体而言，在利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上的情况下，判定为所述评估对象是对乳酸脱氢酶的反应性高的包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物。
[0117]
所述利用hplc测定时的纯度及对乳酸脱氢酶的反应性可以是在进行本发明的化合物的酶反应性的判定方法时所测定的，也可以是另外测得的。
[0118]
＜其它步骤＞
[0119]
作为本发明的化合物的酶反应性的判定方法中的其它步骤，只要无损本发明的效
果，就没有特别限制，可适当选择，例如可例举测定步骤等。
[0120]-测定步骤-[0121]
本发明的化合物的酶反应性的判定方法中的测定步骤是如下步骤：测定作为评估对象的包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的利用hplc测定时的纯度及对乳酸脱氢酶的反应性。
[0122]
所述利用hplc测定时的纯度及对乳酸脱氢酶的反应性可通过与上文中所述的(化合物)的＜hplc纯度＞的项目及＜酶反应性＞的项目中所记载的相同方式来测定。
[0123]
根据本发明的化合物的评估方法及化合物的酶反应性的判定方法，可对仅凭β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的hplc纯度无法评估的生物利用度进行评估、判定，由此可提供高品质的包含β-nmn或其药理学上所容许的盐的化合物。
[0124]
另外，本发明还包括一种高品质的包含β-nmn或其药理学上所容许的盐的化合物的制造方法，该制造方法包括所述化合物的评估方法或化合物的酶反应性的判定方法。
[0125]
实施例
[0126]
以下，示出制造例及试验例对本发明进行说明，但本发明并不受这些制造例及试验例任何限定。
[0127]
(制造例1)
[0128]
＜β-nmn的酶处理＞
[0129]
将β-nmn试剂(东方酵母工业公司制造，非晶形)约100mg溶解于100mm磷酸缓冲液(ph 6.5)中，利用4n koh将ph调整为6.0后，添加10,000u的源自骨骼肌的r-ldh5，于10℃下反应10分钟。对反应液进行超滤，收集滤液，回收去除了ldh的β-nmn。将所回收的含β-nmn的溶液进行冷冻干燥，获得粉末形态的β-nmn试样。
[0130]
＜结晶化处理＞
[0131]
于试管中量取将水与乙醇以体积比为1：2的比率混合而成的水溶液5ml，使β-nmn试样溶解于其中，制备nmn的饱和水溶液。其后，将该水溶液在25℃下静置3天，析出结晶。随后，将包含晶体的该溶液离心分离并去除上清液。使所取得的结晶悬浮于过量的乙醇中后，进行离心分离，去除上清液。随后，通过在60℃下加热干燥1小时而取得晶体。
[0132]
(制造例2～4)
[0133]
使用制造批次不同的β-nmn试剂，以与制造例1相同的方式进行酶处理及结晶化处理，制造本发明的β-nmn化合物。
[0134]
(试验例1)
[0135]
于本试验例中，除制造例1中所制造的β-nmn化合物以外，还使用以下β-nmn制品，这些β-nmn制品是市场上能够获取的制品且均实施过结晶化处理。
[0136]
·
β-nmn制品1(发酵制法品，a公司制造)
[0137]
·
β-nmn制品2(化学合成品，a公司制造)
[0138]
·
β-nmn制品3(制法不明，b公司制造)
[0139]
＜hplc纯度的测定＞
[0140]
通过以下方法，对本发明的β-nmn化合物(制造例1)及β-nmn制品1～3测定hplc纯度。将所获得的结果示于以下表1中。此外，测定结果是进行3次测定后的平均值。
[0141]
[hplc纯度测定]
[0142]
·
hplc机器使用hplc系统prominence(岛津制作所制造)。
[0143]
·
使β-nmn试样以达到2mm的方式溶解于蒸馏水中，将其作为试样液。
[0144]
·
将试样液10μl应用于tsk-gel ods-80ts色谱柱(长度：15cm、内径：4.6mm、粒径：5μm、东曹公司制造)
[0145]
·
色谱柱所吸附的β-nmn组分的分离可利用以下方法实施。
[0146]
使用50mm三羟甲基氨基甲烷醋酸盐(ph 7.5)/甲醇作为洗脱液，在0-15％甲醇的浓度梯度下，将流速调整为0.7ml/分钟，进行洗脱、分离，并在吸光度260nm时进行测定。
[0147]
·
根据所获得的hplc图的总峰面积与β-nmn的峰面积，通过以下式算出hplc纯度。
[0148]-式-[0149]
hplc纯度(％)＝(源自β-nmn的峰面积)/(所测定的峰面积的总量)
×
100
[0150]
＜酶反应性的评估＞
[0151]
通过以下方法，对本发明的β-nmn化合物(制造例1)及β-nmn制品1～3评估与r-ldh5(seq id no:1)的酶反应性。将所获得的结果示于表1及图2。此外，测定结果是进行3次测定的平均值。
[0152]
[酶反应性评估]
[0153]-r1试剂-[0154]
·
80mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(ph 8.5)
[0155]
·
19mmβ-nmn
[0156]
(假设测定试样中的β-nmn的纯度为100％。另外，β-nmn预先溶解于80mm碳酸钠溶液中)
[0157]-r2试剂-[0158]
·
100mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(ph 8.5)
[0159]
·
100mm l-乳酸
[0160]-酶溶液-[0161]
·
以r-ldh5在反应液中的终浓度达到245u/ml的方式调整酶溶液。
[0162]-活性测定-[0163]
测定酶活性时，使用7180型日立自动分析装置(日立高新技术公司制造)。测定参数如下所示。
[0164]
‑‑
测定参数
‑‑
[0165]
·
分析方法
···
a级
[0166]
·
测定波长(副/主)
···
405nm/340nm
[0167]
·
反应时间
···
10分钟
[0168]
·
测光点
···
20-24
[0169]
·
试样液(酶溶液)
···
18μl
[0170]
·
r1试剂
···
120μl
[0171]
·
r2试剂
···
87μl
[0172]
‑‑
测定顺序
‑‑
[0173]
将酶溶液18μl与r1试剂120μl加以混合，在37℃下温育4.5分钟后(测光点1-16)，添加r2试剂87μl开始反应(测光点17)。在反应开始后测定5分钟，用反应开始后1-2分钟(测
光点20-24)的测定试样的吸光值减去同一测光点处的水(空白)的吸光度，算出每分钟的吸光度变化值(δmabs/min)。活性单位是将每分钟的0.1mabs吸光度变化值作为1单位。
[0174]
[表1]
[0175][0176]
根据表1的结果，制造例1的β-nmn化合物与β-nmn制品1～3的hplc纯度均为99％以上，但就酶反应性而言，制造例1的酶反应性为39单位，制品1～3的酶反应性低至23～26单位。
[0177]
此外，制造例1的β-nmn化合物与β-nmn制品1～3在hplc中均未观察到nad的波峰，实质上不含nad。
[0178]
(试验例2)
[0179]
对于制造例2～4中所制造的β-nmn化合物，通过与试验例1相同的方法测定hplc纯度及酶反应性。其结果，确认到即便利用制造批次不同的原料，本发明的β-nmn化合物的hplc纯度及酶反应性均较高。将这些结果与制造例1的试验结果一并示于以下的表2中。此外，测定结果是进行3次测定的平均值。
[0180]
此外，制造例2～4的β-nmn化合物在hplc中均未观察到nad的波峰，实质上不含nad。
[0181]
[表2]
[0182] 制造例1制造例2制造例3制造例4hplc纯度(％)99.999.9899.899.7酶反应性(单位)39403835
[0183]
(试验例3)
[0184]
＜与源自其它动物种类的ldh的酶反应性的评估＞
[0185]
为了确认源自其它动物种类及人类的ldh是否表现出同样的倾向，而对于制造例1中所制造的β-nmn化合物、及与试验例1中使用的相同的β-nmn制品1～3，评估其对ldh((a)源自猪的ldh1、(b)源自人类的ldh1、(c)源自人类的ldh5)的酶反应性。
[0186]
评估酶反应性时，除使用以下酶溶液以外，以与试验例1相同的方式进行。将所获得的结果示于图3a～c(图3a：源自猪的ldh1，图3b：源自人类的ldh1，图3c：源自人类的ldh5)。
[0187]-酶溶液-[0188]
(a)源自猪的ldh1
[0189]
以ldh在反应液中的终浓度达到45u/ml的方式调整酶溶液。
[0190]
(b)源自人类的ldh1
[0191]
以ldh在反应液中的终浓度达到45u/ml的方式调整酶溶液。
[0192]
(c)源自人类的ldh5
[0193]
以ldh在反应液中的终浓度达到245u/ml的方式调整酶溶液。
[0194]
根据试验例3的结果，与试验例1同样地，在使用源自猪的ldh1、源自人类的ldh1及
源自人类的ldh5的情况下，制品1～3对制造例1的β-nmn化合物的酶反应性均较低。
[0195]
(试验例4)
[0196]
＜ldh活性值的β-nmn化合物浓度依赖性＞
[0197]
为了确认ldh活性值的β-nmn化合物浓度依赖性，使用制造例1中所制造的β-nmn化合物、及与试验例1中使用的相同的β-nmn制品1～3，改变r1试剂中的β-nmn浓度后，测定ldh的酶活性。
[0198]
测定ldh的酶活性时，除使用以下r1试剂及酶溶液以外，以与试验例1的[酶反应性评估]相同的方式进行测定，算出每分钟的吸光度变化值(δmabs/min)。将使用200mm的制造例1的β-nmn化合物时的ldh的活性值设为100％时，各浓度的各nmn的相对活性值(％)如图4a～f(图4a～c：r-ldh5，图4d～f：源自人类的ldh1)所示。此外，测定结果是进行3次测定的平均值。
[0199]-r1试剂-[0200]
·
80mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(ph 8.5)
[0201]
·
0、10、20、50、100、或200mmβ-nmn
[0202]
(假设测定试样中的β-nmn的纯度为100％。另外，β-nmn预先溶解于100mm碳酸钠溶液中)
[0203]-酶溶液-[0204]
(i)r-ldh5
[0205]
以ldh在反应液中的终浓度达到245u/ml的方式调整酶溶液。
[0206]
(ii)源自人类的ldh1
[0207]
以ldh在反应液中的终浓度达到45u/ml的方式调整酶溶液。
[0208]
测定结果表明，在使用r-ldh5的情况下，制品1在β-nmn浓度为200mm时无法测定酶活性，无法追踪浓度依赖性(图4a)。认为其原因在于：随着β-nmn浓度变高，原因不明的抑制反应增大。在制品2(图4b)及制品3(图4c)中，随着β-nmn浓度变高，相对于制造例1的β-nmn化合物的活性值差增大。
[0209]
在使用源自人类的ldh1的情况下，制品1(图4d)、制品2(图4e)及制品3(图4f)均是随着β-nmn浓度变高，相对于制造例1的β-nmn化合物的活性值差增大。
[0210]
(试验例5)
[0211]
＜培养细胞的nmn的效果＞
[0212]
为了对制造例1及β-nmn制品3的β-nmn化合物评估生物活性，利用含有β-nmn化合物的培养基对培养细胞进行培养，测定细胞内nad的变动。
[0213]
培养细胞使用经悬浮化(浮遊化)处理的hek293细胞。培养基使用freestyle
tm 293表达培养基(赛默飞世尔科技公司制造)。
[0214]
首先，以使经悬浮化处理的hek293细胞在培养基中达到1
×
106个细胞/ml的方式进行制备，在6个125ml烧瓶中各分注30ml的量。将制造例1及β-nmn制品3的β-nmn化合物以各自终浓度达到0、0.1mm的方式添加到各烧瓶中，不更换培养基，在37℃的co2培养箱内振荡培养7天。
[0215]
振荡培养7天后，回收细胞及培养上清液以进行各种分析。首先，为了算出细胞毒性率，使用l-type wako ast
·
j2(富士胶片和光纯药公司制造)，并依据试剂指定的方法，
利用7180型日立自动分析装置(日立高新技术公司制造)测定细胞内外的天冬氨酸转氨酶(ast)活性，以检测逸脱酶。另外，为了测定细胞内nad含量，使用nad/nadh测定试剂盒(同仁化学研究所公司制造)进行nad的检测。具体而言，测定所回收的细胞的重量，利用试剂盒附带的提取缓冲液进行提取后，测定nad。细胞内的nad含量是根据测定各浓度的nad溶液所求出的校准曲线算出。
[0216]
图5a中示出使用制造例1的β-nmn化合物时根据细胞内外的ast活性所求出的细胞毒性率，图5b中示出使用β-nmn制品3的β-nmn化合物时根据细胞内外的ast活性所求出的细胞毒性率。另外，图6a中示出使用制造例1的β-nmn化合物时的细胞内nad含量，图6b中示出使用β-nmn制品3的β-nmn化合物时的细胞内nad含量。测定结果表明，在添加了制造例1的β-nmn化合物时，随着不更换培养基培养7天，由营养缺乏导致的细胞的毒性率低于添加了β-nmn制品3的情况，另外，添加了制造例1的β-nmn化合物时的细胞内nad含量高于添加了β-nmn制品3的β-nmn化合物时的细胞内nad含量。
技术特征：1.一种化合物，其是包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物，其特征在于：利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上。2.根据权利要求1所述的化合物，其利用hplc测定时的纯度为98％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为33单位以上。3.根据权利要求1或2所述的化合物，其为结晶形态。4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中乳酸脱氢酶是源自哺乳类的骨骼肌的乳酸脱氢酶。5.根据权利要求4所述的化合物，其中乳酸脱氢酶具有seq id no:1的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其实质上不含烟酰胺二核苷酸。7.一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质评估方法，其特征在于包括：将利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上作为指标，评估所述包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的品质。8.一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物的酶反应性的判定方法，其特征在于包括：将利用hplc测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上作为指标，判定所述包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物对乳酸脱氢酶的反应性。
技术总结本发明是一种包含β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上所容许的盐的化合物，其利用HPLC测定时的纯度为95％以上，且对乳酸脱氢酶的反应性为30单位以上。为30单位以上。
技术研发人员：竹谷由葵子 松川宽和 砂原美子
受保护的技术使用者：东方酵母工业株式会社
技术研发日：2021.02.10
技术公布日：2022/12/2
