指导和优化GVHD患者的治疗管理的FMT表现预测测试的制作方法

指导和优化gvhd患者的治疗管理的fmt表现预测测试
技术领域
1.本发明涉及gvhd管理领域。特别地，本发明涉及肠道微生物群在gvhd中的作用并提供了一种方法，所述方法用于确定患者是否有可能从旨在调节此微生物群的治疗(例如粪菌移植(fmt))中受益，或者用于确定在fmt之前是否需要另一种治疗来增加患者成功应答fmt的可能性。


背景技术：

2.gvhd
3.移植物抗宿主病(gvhd)是同种异基因造血干细胞移植(allo-hsct)的主要并发症，由供体免疫t细胞对宿主细胞上的蛋白质(特别是人类白细胞抗原(hla))的免疫介导炎症反应组成。allo-hsct是为了治愈从恶性疾病到遗传性贫血的多种血液系统障碍所需的。
4.当次要组织相容性抗原不匹配或其他原因触发供体的免疫系统攻击受体时，就会发生排斥，从而导致特有的炎性疾病。自体同源hsct(细胞源自同一患者)后不会发生gvhd。
5.取决于症状出现的特定时间，gvhd有两种主要形式：
[0006]-急性gvhd(agvhd)：在hsct后100天内发生的临床病理综合征(发病中位值典型地是移植后21至25天)；主要累及三个器官：皮肤(》80％的gvhd患者)、胃肠(gi)道(50％-55％)和肝脏(50％)。任何一个器官或这些器官的组合都可能受到影响。
[0007]-慢性gvhd(cgvhd)表现为纤维化皮肤病、细支气管炎、唾液腺和泪腺疾病以及嗜酸细胞性筋膜炎，并且典型地发生在hsct后超过100天，通常发生在急性gvhd之后。
[0008]
gvhd的当前治疗
[0009]
gvhd管理是具有挑战性的。使用皮质类固醇进行免疫抑制形成了急性和慢性gvhd一线疗法的基础，取决于初始的疾病严重程度，所述免疫抑制在少于50％的agvhd患者和40％-50％的cgvhd患者中产生了持续应答。
[0010]
对于那些对类固醇应答不良(类固醇难治性(sr))或类固醇不能逐渐减量(类固醇依赖性(sd))的患者，预后非常差。
[0011]
最近的一项研究描述了预测类固醇抗性gvhd的长期结果的生物标志物，包括全身性治疗1周后致瘤性抑制因子2(st2)和再生胰岛衍生蛋白3-α(reg3α)的水平(major-monfried等人,2018)。
[0012]
患者微生物群的重要性
[0013]
接受allo-hsct的患者可能会暴露于细胞毒性药物化疗、全身放射治疗、免疫抑制剂和广谱抗生素。这些治疗会导致肠道微生物群发生巨大改变，并对肠道黏膜造成不同程度的损害，从而导致宿主防御系统的破坏。
[0014]
在allo-hsct的过程中，患者显示出微生物群落的显著变化，其特点是整体微生物多样性和丰富性下降，对宿主防御起到支持作用的有益细菌(例如厚壁菌门)的破坏，以及通常次要的细菌种类(包括一些病原体和病原微生物(pathobiont)(例如，艰难梭菌、一些肠杆菌科细菌)和多重药物抗性(mdr)细菌)的优势增加(malard等人,2018)，这一特点与随
后的菌血症和感染性并发症相关(taur等人,2012)。
[0015]
当前的标准肿瘤学护理并未考虑到微生物群管理，包括其基线状态。然而，最近的几项研究报告，肠微生物群通过多种机制(包括异种代谢(xenometabolism)、免疫相互作用和改变的群落结构)影响化疗疗效和毒性。在没有功能性微生物组的情况下，这些治疗可能不是最理想的(iida等人,2013；alexander等人,2017；ma等人,2019)。
[0016]
在allo-hsct患者中，肠微生物群的多样性在allo-hsct后的总生存期(malard等人,2018)中以及在gvhd患者的结果(taur等人,2014，peled等人,2020)中起到关键作用。事实上，观察到微生物群多样性的丧失与更明显的胃肠gvhd相关(holler等人,2014)。几项研究报告，被破坏的微生物群(例如多样性丧失、单一分类群的主导)与不良的患者结果(如gvhd相关死亡率)有关，并强调微生物群与其宿主之间相互作用的重要性，以及恢复肠道微生物群的完整性的机会(malard等人,2018；taur等人,2012；taur等人,2014；peled等人,2020；holler等人,2014；golob等人,2017；jenq等人,2015)。
[0017]
fmt恢复allo-hsct患者的肠微生物群
[0018]
因此，除了标准护理设备外，最近还提出了操纵肠微生物群以抑制或减少allo-hsct患者的治疗相关并发症的策略。几项案例研究报告，在胃肠agvhd的治疗中使用粪便微生物群转移(fmt，也称为粪便微生物疗法，定义为通过上消化道或下消化道途径施用来自健康供体的处理过的粪便以恢复肠微生物群稳态)获得有希望的结果(kakihana等人,2016；spindelboeck等人,2017；qi等人,2018；van lier等人,2019；shouval等人,2018)。
[0019]
然而，鉴于目前在这一预后不良的患者群体中报告的案例数量很少，难以鉴别哪些患者应该并且能够真正从这样的fmt中受益。
[0020]
在缺乏对目标人群的定义的情况下，患者可以接受fmt，尽管他/她的临床状况将并不允许实现临床应答，或者他/她的微生物肠道尚未准备好从粪便移植产品中受益。
[0021]
gvhd患者群体是非常脆弱的，并且如果有效的治疗不能迅速到位，会出现高死亡率。因此，在危重疾病和危及生命的紧急情况下，对未准备好从fmt治疗中受益的患者进行治疗可能会导致时间和治疗机会的损失。
[0022]
本发明旨在满足对fmt表现预测测试的未满足需求，以指导和优化gvhd患者的治疗管理。


技术实现要素：

[0023]
本发明涉及一种方法，其用于评估需要用活细菌补充他/她的胃肠微生物群(例如fmt)的受试者是否能从所述补充中受益，即，评估施用的活细菌是否能够植入，从而引起受试者的胃肠微生物群组成的显著变化。此方法对于优化gvhd患者的治疗管理是特别有利的，这种优化是通过以下来进行的：对能够成功地接受这样的补充的患者和那些很可能将不会从此治疗中受益并且在接受活细菌之前需要调节治疗以改善这些细菌在他们的肠中植入的可能性的患者进行区分。
[0024]
此方法包括：
[0025]
a.测量来自所述受试者的胃肠生物样品中的与良好预后相关的细菌的丰度，其中所述细菌属于选自下组的至少一个类别，该组由以下组成：
[0026]-厚壁菌门；
[0027]-芽孢杆菌纲和放线菌纲；
[0028]-芽孢杆菌目、乳杆菌目和微球菌目；
[0029]-葡萄球菌科、乳杆菌科和微球菌科；以及
[0030]-葡萄球菌属、乳杆菌属、蜜蜂球菌属和节杆菌属；
[0031]
和/或
[0032]
b.测量来自所述受试者的胃肠生物样品中的与不良预后相关的细菌的丰度，其中所述细菌属于选自下组的至少一个类别，该组由以下组成：
[0033]-拟杆菌门和变形菌门；
[0034]-拟杆菌纲；
[0035]-拟杆菌目和肠杆菌目；
[0036]-拟杆菌科、紫单胞菌科、氨基酸球菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、梭菌科、普雷沃氏菌科和丹毒丝菌科；以及
[0037]-拟杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属、多尔氏菌属(dorea)、粪球菌属、布劳特氏菌属(blautia)、另枝菌属(alistipes)、罕见小球菌属(subdoligranulum)、罗氏菌属(roseburia)、副拟杆菌属和毛螺菌属；以及
[0038]
c.使用在步骤a和/或步骤b中得到的结果以及计算公式，计算出至少一个得分(#r)，所述得分反映受试者的微生物群通过所述补充得到显著改善的可能性；以及
[0039]
d.将在步骤c中得到的每个得分与一个或几个参考值进行比较，并且推断受试者是否能够成功地接受用活细菌补充他/她的胃肠微生物群或者在所述补充之前受试者是否需要准备治疗。
[0040]
根据本发明的其他方面，可以将宿主参数与以上微生物群参数结合，以预测fmt或用活细菌进行的其他补充治疗的成功或失败。
[0041]
本发明还涉及fmt产品在测试为阳性的受试者中治疗gvhd的用途。
[0042]
本发明的另一方面是使用调节治疗(例如靶向不利的细菌的不可吸收的抗生素和/或渗透性泻药治疗)以使患者做好准备，然后使得他/她可以从fmt或用活细菌进行的另一补充治疗中受益。
[0043]
还提供了用于进行根据本发明的方法的材料和试剂盒。
附图说明
[0044]
图1：根据本发明的临床途径
[0045]
图2：heracles研究设计
[0046]
图3：heracles研究，sr-agvhd患者，braycurtis相似性vs imp，otu水平
[0047]
图4：heracles研究，sr-agvhd患者，相比于v1，与产品相似性的进化
[0048]
图5：heracles研究，sr-agvhd患者，maat指数。上分图：butycore；中分图：核心微生物群；下分图：maat健康指数。
[0049]
图6：eap患者，braycurtis相似性vs imp，otu水平
[0050]
图7：eap患者，butycore maat指数
[0051]
图8：eap患者，maat健康指数
[0052]
图9：血液瓜氨酸
[0053]
图10：硫酸吲哚酚(indoxylsulfate)
[0054]
图11：粪便连蛋白(zonulin)
[0055]
图12：前白蛋白(血液)
[0056]
图13：总胆固醇
[0057]
图14：基线处的胃肠应答的微生物群生物标志物
[0058]
图15：判别分析结果。a：具有显著的分层作用的每个预选择的分类群的效应量。b：分类群，按照分类水平(p：门，c：纲，o：目，f：科，g：属)进行分组。对预后特征没有显著影响的分类群用白色表示。
[0059]
图16：基线时胃肠应答的额外微生物群生物标志物，及阈值(通过16s测序测量的丰度)。
[0060]
图17：整体预测分析结果。具有内部交叉验证平均auc的岭(ridge)逻辑回归展示为对于每个时间点的置信区间(浅灰色带)包围的灰色线。还提到了每次就诊时包括的患者人数。
[0061]
图18：主要标志物预测结果。每个标志物(行)被认为是预测模型中对于至少一个时间点的重要驱动因素(量化为权重)。条形代表标志物对应的具有置信区间的权重。负权重(向左的条形)表示对无应答者更重要的测量值，正权重(向右的条形)表示对应答者更重要的测量值。
具体实施方式
[0062]
在gvhd的临床背景下，尤其是类固醇难治性gvhd(sr-agvhd)的背景下，本发明是特别相关的。本发明是对fmt治疗的优化。临床医生知晓：
[0063]-一方面，使用将在患者中定植不良的fmt治疗患者可能不会像希望的一样有效。对于这一患者群体来说，这可能会占用特别宝贵的时间，而且要花钱，但获得治疗益处的可能性很低。事实上，一些患者在接受fmt之前可能需要额外的治疗，以增加fmt有效调节患者微生物群并具有临床益处的可能性。
[0064]-另一方面，为每一位患者提供这样的“准备治疗”会导致对不需要这种治疗的患者也进行了治疗。最好的情况是这会导致时间损失，而糟糕的情况是会降低这些患者应答的可能性。
[0065]
因此，本发明旨在提供fmt表现预测测试，以对在fmt之前需要治疗来增加他们对其应答的可能性的患者和那些不需要任何这样的准备治疗并能以较大的成功可能性直接接受fmt的患者进行区分。
[0066]
在此背景下，申请人建立了两个项目来研究fmt在gvhd人群中的潜在益处。在随后的实验部分中描述的这些项目的结果带来了一种分层工具，以鉴别符合fmt条件的患者。
[0067]
因此，本发明涉及一种方法，其用于评估需要用活微生物补充他/她的胃肠微生物群的受试者是否能从所述补充中受益，所述方法包括：
[0068]
a.测量来自所述受试者的胃肠生物样品中的与良好预后相关的细菌的丰度，其中所述细菌属于选自下组的至少一个类别，该组由以下组成：
[0069]-厚壁菌门；
[0070]-芽孢杆菌纲和放线菌纲；
[0071]-芽孢杆菌目、乳杆菌目和微球菌目；
[0072]-葡萄球菌科、乳杆菌科和微球菌科；以及
[0073]-葡萄球菌属、乳杆菌属、蜜蜂球菌属和节杆菌属；
[0074]
和/或
[0075]
b.测量来自所述受试者的胃肠生物样品中的与不良预后相关的细菌的丰度，其中所述细菌属于选自下组的至少一个类别，该组由以下组成：
[0076]-拟杆菌门和变形菌门；
[0077]-拟杆菌纲；
[0078]-拟杆菌目和肠杆菌目；
[0079]-拟杆菌科、紫单胞菌科、氨基酸球菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、梭菌科、普雷沃氏菌科和丹毒丝菌科；以及
[0080]-拟杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属、多尔氏菌属、粪球菌属、布劳特氏菌属、另枝菌属、罕见小球菌属、罗氏菌属、副拟杆菌属和毛螺菌属；以及
[0081]
c.使用在步骤a和/或步骤b中得到的结果以及计算公式，计算出至少一个得分(#r)，所述得分反映受试者的微生物群通过所述补充得到显著改善的可能性；以及
[0082]
d.将在步骤c中得到的每个得分与一个或几个参考值进行比较，并且推断受试者是否能够成功地接受用活微生物补充他/她的胃肠微生物群或者在所述补充之前受试者是否需要准备治疗。
[0083]
如本文所使用的，术语“包含”或“包括”旨在意指组合物和方法包括选自所列举的列表中的要素，但不排除其他要素。
[0084]
单数形式“一个/一种(a)”和“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个计算公式(a calculation formula)”包括多个计算公式。
[0085]
在本文中，如果用活微生物补充胃肠微生物群(例如，fmt)使得接受这种补充的受试者的微生物群组成发生显著变化，则它被认为是“成功的”。如下文实验部分所解释的，补充的成功可以使用多种指数来评估，例如与施用的微生物组合物(例如fmt产品)的otu braycurtis相似性、butycore指数、核心微生物组指数和健康指数(在实验部分定义)，以及血液瓜氨酸浓度和血液吲哚酚-3-硫酸酯浓度等参数。特别是，如果受试者的胃肠微生物群与针对用活微生物补充胃肠微生物群而施用的产品之间的otu braycurtis相似性在一次、2次或3次施用后几天内(例如，5到12天)增加至少5％(与第一次产品施用前观察到的受试者的胃肠微生物群与产品之间的相似性相比)，则可以认为这样的补充是成功的。
[0086]
在上述方法中，“可以成功接受”补充治疗(即，包含用来补充他/她的胃肠微生物群的活微生物的产品)的受试者因此是补充将可能成功的人，即，所述补充将使得他/她的胃肠微生物群组成发生显著变化，而在施用补充组合物之前不需要任何准备治疗或调节治疗。
[0087]
同样地，“可以受益于”或“可能受益于”补充治疗的受试者是补充将可能成功的人，即，所述补充将使得他/她的胃肠微生物群组成发生显著变化，而在施用补充组合物之前不需要任何准备治疗或调节治疗。
[0088]
希望的是成功的补充将导致需要这样的补充的受试者的临床应答。然而，这种情况只有当所选补充产品足以改善受试者的病症时，才会发生。否则，补充同样(即，所施用的
微生物在受试者的肠中植入)可以是成功的，只是对受试者的健康没有作用，或者在更坏的情况下，对受试者的健康产生有害的作用。因此，在本文中，“补充的成功”与对该治疗的临床应答并不同义。
[0089]
如本文所使用的，术语“良好预后”意指补充将实现至少一部分施用的活细菌的植入的预后，而“不良预后”意指补充将不会使微生物群组成发生显著变化的预后。
[0090]
当进行要求保护的方法时，技术人员可以使用任何适当的参考来归一化测量的丰度。适当的参考的非限制性实例包括细菌的总数、细菌+古细菌的总数、以及任何内部参考，尤其是当在步骤c中的计算是“良好预后”和“不良预后”细菌水平之间的比率时。
[0091]
根据上述方法的特定实施方式，确定以下值：
[0092]-在步骤a中确定第一值(#g)，并且/或者
[0093]-在步骤b中确定第二值(#b)，
[0094]-在步骤c中，#r1＝#g，#r2＝1:#b，并且/或者#r3＝#g:#b，使得#r1、#r2和/或#r3高于一个或多个参考值表明良好预后，并且#r1、#r2和/或#r3低于一个或多个参考值表明不良预后。
[0095]
在上述实施方式中，使用针对与良好预后相关的细菌选择的分类群的测量的丰度来计算#g。例如，它可以是这些分类群的相对丰度的和。当然，这个和可以是加权和，以反映每个分类群在预后中的重要性。例如，相比归于大量存在但与预后相关性差的分类群的权重，技术人员可以将更大的权重归于通常存在量非常低但与预后高度相关的分类群。
[0096]
相同的推理适用于#b的计算。
[0097]
技术人员还可以在步骤c中使用比所示比率更复杂的公式。唯一的条件是相应地调整一个或多个参考值。当然，将排除导致零值或无穷大结果的计算公式。
[0098]
如本文所使用的，“用活微生物补充受试者的胃肠微生物群”是指施用任何包含活微生物的组合物，目的是改善受试者的微生物群。这样的组合物可以包含一种单一菌株的纯培养物、几种培养菌株的混合物和/或微生物的复杂群落，例如源自一个或几个供体的粪便材料。粪菌移植(fmt)是根据本发明的补充活微生物的实例。
[0099]
根据特定实施方式，进行根据本发明的方法，以评估需要用活微生物补充他/她的胃肠微生物群(例如通过粪菌移植(fmt))的受试者是否能从所述移植中受益。
[0100]
根据另一特定实施方式，受试者患有同种异基因造血干细胞移植(allo-hsct)后的移植物抗宿主病(gvhd)。
[0101]
上述方法特别可用于评估患有同种异基因造血干细胞移植(allo-hsct)后的急性类固醇难治性移植物抗宿主病(sr-agvhd)的受试者(和/或在受试者患有具有胃肠影响的gvhd的情况下)是否能从活微生物的补充(例如fmt)中受益。
[0102]
当进行上述方法时，技术人员可以在上文所示的与良好预后或不良预后相关的不同分类群中自由地选择分类群的任何组合。可以组合相同或不同分类水平的分类群。技术人员还可以将这些分类群与另外的分类群组合，并且如已经提到的，技术人员可以使用任何相关公式来计算分别与良好预后和不良预后相关的#g值和/或#b值。用于进行本发明的公式的非限制性实例如下所示(注意：以下所示的和应理解为所示分类群的加权和-技术人员可以定义每个分类群的权重以优化结果的预测值)：
[0103]
(i)#g＝厚壁菌门，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0104]
(ii)#g＝厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0105]
(iii)#g＝厚壁菌门+放线菌纲，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0106]
(iv)#g＝放线菌纲+厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0107]
(v)#g＝厚壁菌门，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0108]
(vi)#g＝厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0109]
(vii)#g＝厚壁菌门+放线菌纲，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0110]
(viii)#g＝放线菌纲+厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
[0111]
(ix)#g＝厚壁菌门并且#r＝#g；和/或
[0112]
(x)#g＝厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，并且#r＝#g；和/或
[0113]
(xi)#g＝厚壁菌门+放线菌纲，并且#r＝#g；和/或
[0114]
(xii)#g＝放线菌纲+厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，并且#r＝#g；和/或
[0115]
(xiii)#b＝拟杆菌门，并且#r＝1:#b；和/或
[0116]
(xiv)#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝1:#b；和/或
[0117]
(xv)#g＝芽孢杆菌纲+任选地放线菌纲，#b＝拟杆菌纲+任选地γ变形菌纲+任选地反壁菌纲(negavicutes)+任选地梭菌纲，并且#r＝#g:#b；和/或(xvi)#g＝芽孢杆菌目+乳杆菌目+微球菌目，#b＝拟杆菌目+肠杆菌目+任选地月形单胞菌目+任选地梭菌目，并且#r＝#g:#b；和/或
[0118]
(xvii)#g＝葡萄球菌科+乳杆菌科+微球菌科+任选地肠球菌科，#b＝拟杆菌科+紫单胞菌科+氨基酸球菌科+毛螺菌科+任选地肠杆菌科，并且#r＝#g:#b；和/或
[0119]
(xviii)#g＝葡萄球菌属+乳杆菌属+蜜蜂球菌属+节杆菌属，#b＝拟杆菌属+埃希氏菌属+志贺氏菌属，并且#r＝#g:#b。
[0120]
(xix)#g＝芽孢杆菌纲+微球菌目，#b＝拟杆菌纲+肠杆菌目+氨基酸球菌科+毛螺菌科，并且#r＝#g:#b。
[0121]
(xx)#b＝毛螺菌科+瘤胃球菌科+梭菌科，普雷沃氏菌科+丹毒丝菌科，并且#r＝1:#b。
[0122]
(xxi)#b＝拟杆菌属+瘤胃球菌属+粪杆菌属+多尔氏菌属+粪球菌属+布劳特氏菌属+另枝菌属+罕见小球菌属+罗氏菌属+副拟杆菌属+毛螺菌属，并且#r＝1:#b。
[0123]
为进行本发明的方法，技术人员可以使用用于量化细菌的任何适当的方法。这样的方法的非限制性实例包括定量pcr(qpcr)、16s测序、全宏基因组测序、微阵列、免疫检测(例如elisa测试)、代谢组学(例如，液相色谱与串联质谱偶联或气相色谱与串联质谱偶联)以及培养和/或流式细胞术法。
[0124]
根据本发明的特定实施方式，相关分类群的丰度通过定量pcr测量。聚合酶链反应(pcr)技术是众所周知的并且容易获得，不需要精确的描述。基于pcr的技术使用扩增引物来进行，所述扩增引物设计为对测量的靶标具有特异性。因此，本发明还涉及一组适于进行
上述方法的引物，即，一组包含用于扩增序列的引物对的引物，所述引物对于在所述方法的步骤a和/或b中待检测的微生物分类群中的每一个具有特异性。这样的一组引物包含最少4个引物，但是它可以包含更多个引物，例如6、8、10、16、20、30、40、50、60、70、80、100、200、300、500、1000个或更多个引物。成套试剂盒也是本发明的一部分，所述成套试剂盒包含这样的一组引物和用于从样品(例如直肠拭子或粪便样品)中提取细菌dna的反应剂。
[0125]
在另一特定实施方式中，通过使用核酸微阵列在步骤a和/或b中对选择的物种的相对丰度进行评估。“核酸微阵列”由连接至固体支持物(它可以是微型芯片、载玻片或微球体大小的珠粒)的不同核酸探针组成。探针可以是核酸例如cdna(“cdna微阵列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微阵列”)，并且寡核苷酸可以是约25至约60个碱基对或更小的长度。为了确定样品中靶核酸的拷贝数，将此样品标记并在杂交条件下与微阵列接触，从而在连接至微阵列表面的探针序列和与其互补的靶核酸之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物的存在。技术人员可获得微阵列杂交技术的许多变体。
[0126]
因此，设计用于进行根据本发明的方法的核酸微阵列也是本发明的一部分。这样的核酸微阵列包含对在所述方法的步骤a和/或b中待检测的每个细菌分类群具有特异性的核酸探针。根据本发明的微阵列还可以包含至少一种寡核苷酸，其用于检测至少一种对照细菌物种的至少一种基因和/或任何掺入型对照序列。优选地，寡核苷酸的长度是约50个碱基。可以使用本领域已知的任何微阵列寡核苷酸设计方法，基于对相关分类群具有特异性的基因组序列来设计合适的微阵列寡核苷酸。特别地，可以使用为设计微阵列寡核苷酸而开发的任何可用软件，例如像oligoarray软件、goarrays软件、array designer软件、primer3软件、mopo16s软件或promide软件，这些均是本领域技术人员已知的。
[0127]
根据另外的实施方式，使用测序来确定从受试者得到的样品中相关分类群的丰度。任选地，例如在测序之前通过限制性核酸酶或机械片段化，将dna片段化。使用本领域已知的任何技术进行测序，包括连接测序法、焦磷酸测序、合成测序法、单分子测序或下一代测序。测序还包括基于pcr的技术，例如像乳液pcr。许多平台可用于进行下一代测序(ngs，也称为“大规模平行dna测序”或“高通量dna测序”)，例如但不限于illumina genome analyzer平台、roche 454平台、abi solid平台、helicos单分子测序平台、使用单聚合酶分子的实时测序(eid等人,2009)、离子激流测序(wo 2010/008480)、pacbio测序(rhoads等人,2015)和牛津纳米孔测序(clarke等人,2009)。
[0128]
根据又另一个实施方式，通过选择性培养基上的细菌培养来测量从受试者得到的样品中相关分类群的丰度。例如，将粪便样品稀释，然后在厌氧条件下在具有厚壁菌门选择性培养基的培养皿上和另一个具有拟杆菌门选择性培养基的培养皿上培养；允许细菌生长，然后计数菌落以评估2个门的相对量。
[0129]
从受试者获得的样品中相关分类群的丰度也可以通过流式细胞术测量：例如，样品中的厚壁菌门可以用荧光团标记并且拟杆菌门可以用另一种荧光团标记。然后使用细胞仪测量发射的荧光来评估属于厚壁菌门和拟杆菌门的细胞数量。
[0130]
可以在本发明的框架中用作“参考值”的值的实例在下面的实验部分(实例5和图16)中披露。这些值是从一个特定的群组中得到的，其中细菌丰度是经由16s测序测量的。参考值的其他实例如下：
[0131]-使用上文公式(xx)，即，#b＝毛螺菌科+瘤胃球菌科+梭菌科+普雷沃氏菌科+丹毒
丝菌科，并且#r＝1:#b，参考值是约100，其意味着#r》100表明受试者可能从fmt中受益。
[0132]-使用上文公式(xxi)，即，#b＝拟杆菌属+瘤胃球菌属+粪杆菌属+多尔氏菌属+粪球菌属+布劳特氏菌属+另枝菌属+罕见小球菌属+罗氏菌属+副拟杆菌属+毛螺菌属，并且#r＝1:#b，参考值是约50，其意味着#r》50表明受试者可能从fmt中受益。
[0133]
当然，取决于用于测量微生物相对丰度的技术(例如，定量pcr、微阵列杂交或测序)、患者的具体病症、使用待施用的活微生物进行的gi微生物群补充(例如fmt)的性质、所用样品的性质、患者的饮食习惯和其他可能的因素，熟练的技术人员可以调整或改进这些阈值。更一般地，进行上述方法时要考虑的参考值是通过测量具有给定病症的个体的代表性群组中所列举的细菌分类群的相对丰度来预先确定的，并且所述个体对通过gi微生物群补充的给定治疗的应答是已知的。技术人员还可以调整一个或多个参考值以有利于测试的敏感性和/或特异性。
[0134]
根据本发明的特定实施方式，步骤a和/或b中使用的生物样品是直肠拭子或粪便样品。
[0135]
本发明的另一方面涉及某些宿主参数(即，不同于微生物群组成的参数)用于评估需要用活微生物补充他/她的胃肠微生物群的受试者是否能从所述补充中受益的预后价值。该方面得到下文实例4中披露的结果的支持，其示出粪便连蛋白浓度以及瓜氨酸、前白蛋白、胆固醇和硫酸吲哚酚的血液浓度的预后相关性。先前描述了两种生物标志物，致瘤性抑制因子2(st2)和再生胰岛衍生蛋白3-α(reg3α)(也称为magic生物标志物)用于预测类固醇抗性gvhd的长期结果(非复发死亡率和总生存期)(major-monfried等人,2018)。诸位发明人的使用st2的初步结果示出，在基线处这些标志物也可预测患者对fmt的应答(数据未示出)。
[0136]
因此，本发明还涉及一种方法，其用于评估需要用活微生物补充他/她的胃肠微生物群的受试者是否能从所述补充中受益，所述方法包括：
[0137]
a.测量来自受试者的至少一个生物样品的选自下组的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个预后标志物，该组由以下组成：胆固醇浓度、硫酸吲哚酚浓度、连蛋白浓度、瓜氨酸浓度、前白蛋白浓度、致瘤性抑制因子2(st2)浓度和再生胰岛衍生蛋白3-α(reg3α)浓度；这些标志物在图1中称为“circe标志物”。
[0138]
b.将在步骤a中得到的值与参考值进行比较，其中：
[0139]-粪便连蛋白浓度高于参考值；
[0140]-瓜氨酸浓度高于参考值；
[0141]-前白蛋白浓度高于参考值；
[0142]-胆固醇浓度高于参考值；和/或
[0143]-3-硫酸吲哚酚浓度低于参考值；
[0144]-st2浓度低于参考值；和/或
[0145]-reg3α浓度低于参考值；
[0146]
是良好预后的指标。
[0147]
如下文实例7所示，诸位发明人还鉴定了il-6、il-1β、ifnγ、ccl28、il-8、il-2、ccl25和mcp_1作为与fmt成功相关的额外生物标志物。特别地，在fmt之前，il-6、il-1β、ifnγ、ccl28和il-2水平与所述fmt的成功相关。
[0148]
因此，本发明还涉及一种方法，其用于评估需要用活微生物补充他/她的胃肠微生物群的受试者是否能从所述补充中受益，所述方法包括：
[0149]
a.测量来自受试者的至少一个生物样品中的选自下组的一个或几个预后标志物，该组由以下组成：胆固醇浓度、3-硫酸吲哚酚浓度、粪便连蛋白浓度、瓜氨酸浓度、前白蛋白浓度、致瘤性抑制因子2(st2)浓度、再生胰岛衍生蛋白3-α(reg3α)浓度、il-6浓度、il-1β浓度、ifnγ浓度、ccl28浓度和il-2浓度；
[0150]
b.将在步骤a中得到的值与参考值进行比较，其中：
[0151]-粪便连蛋白浓度高于参考值；
[0152]-瓜氨酸浓度高于参考值；
[0153]-前白蛋白浓度高于参考值；
[0154]-胆固醇浓度高于参考值；
[0155]-3-硫酸吲哚酚浓度低于参考值；
[0156]-st2浓度低于参考值；
[0157]-reg3α浓度低于参考值；
[0158]-il-6浓度低于参考值；
[0159]-il-1β浓度低于参考值；
[0160]-ifnγ浓度低于参考值；
[0161]-ccl28浓度高于参考值；和/或
[0162]-il-2浓度低于参考值；
[0163]
是良好预后的指标。
[0164]
可以在任何适当的样品中测量连蛋白的浓度。根据本方法的特定实施方式，在直肠拭子或粪便样品中测量粪便连蛋白浓度。
[0165]
在上述方法中，可以从来自患者的任何适当的生物样品中测量瓜氨酸、前白蛋白、胆固醇、硫酸吲哚酚、st2、reg3α、il-6、il-2、il-1β、ifnγ和/或ccl28。合适的生物样品的非限制性实例包括血液、血清和血浆。
[0166]
当然，技术人员可以分别基于对受试者的微生物群的分析和对某些宿主参数的分析，有利地结合上述方法，以提高测试的表现。结合这两个方面的方法当然是本发明的一部分。
[0167]
本发明还涉及活微生物组合物(优选fmt产品)用于治疗受试者的gvhd的用途，基于临床患者特征和/或如上所述的预测测试结果，对于所述受试者来说，fmt可能会成功。
[0168]
预测测试优选地用于至少sr-agvhd患者。另外，预测测试可有利地应用于sd agvhd患者、具有重叠综合征的agvhd患者或慢性gvhd患者，这些患者已经接受了至少一次fmt并且基于临床症状和对fmt疗效生物标志物(血液硫酸吲哚酚、以及下文实验部分定义的butycore核心微生物组指数和健康指数)的评价，对于这些患者来说，fmt疗效并不令人满意。
[0169]
如本文所使用的，术语“治疗”是指gvhd症状(尤其是gi症状)的进展、严重程度、复发风险和/或持续时间的任何减少或改善。
[0170]
本文中的“fmt产品”意指从粪便样品(直接或间接)得到的任何粪便微生物组合物，所述粪便样品来自(i)在导致同种异基因造血干细胞移植的治疗之前的患者(他/她)自
己，(ii)一个或多个健康个体，(iii)表现出最有可能有效地改善患者的状态的微生物群特征的一个或多个个体，以及富集了一种或几种微生物菌株的任何这样的粪便微生物组合物。已经描述并正在开发几种调节粪便微生物材料和进行fmt的方法，并且熟练的技术人员可以自由选择适当的技术，用于制备根据本发明使用的粪便微生物组合物，其可以是新鲜制备的液体、冻干材料或任何其他调节剂。可根据本发明使用的fmt产品的非限制性实例包括例如在wo 2016/170285或wo 2019/171012中描述的fmt产品，或基于含有至少2种细菌物种的全部或部分生态系统的微生物培养物的产品。它们可以通过灌肠剂或通过便于食用的胶囊的方式施用(如在例如wo 2019/097030中所述)，其中所述产品已经冻干并成为粉末状(如在例如wo 2017/103550中所述)。
[0171]
根据特定实施方式，通过根据本发明的fmt治疗的受试者患有sr-agvhd。
[0172]
根据另一特定实施方式，通过根据本发明的fmt治疗的受试者具有胃肠症状。
[0173]
上述fmt预测测试可以包括在用于gvhd患者的更广泛的临床途径(如图1所示)中，所述途径利用了fmt治疗这样的疾病的潜力。根据gvhd子类别，患者要么直接接受fmt疗法，要么测试fmt的潜在作用。这是使用“fmt表现预测测试”构建的“分层”组。如果通过上述预测性测试将患者鉴定为不太可能从fmt中受益，他/她将接受治疗(例如，抗生素疗法、peg等)，目的是在fmt前使他/她的微生物群生态系统做好准备。该gvhd临床途径(图1)也是本发明的一部分。
[0174]
该gvhd临床途径还可以包括监测对fmt应答的额外步骤。事实上，如下文实验部分(图4)所示，与fmt产品的otu braycurtis相似性增加了超过5个百分点，这明确了一组具有良好gi应答的患者。不断增加的butycore指数或健康指数(图5)也可用于监测目的。在血液中作为瓜氨酸(图9)浓度和吲哚酚-3-硫酸酯(图10)浓度测量的参数在fmt发生后立即具有良好的gi应答的患者中增加(就诊2)，代表着两个可替代的或额外的监测对fmt应答的方式。
[0175]
可以通过调节性预治疗显著地改善人的状态，这些人通过上述预测性测试鉴定为可能不会对用活微生物补充他们的胃肠微生物群应答。事实上，为使被鉴定为“不符合”fmt条件的患者符合fmt的条件，可以在这些患者中诱导微生物群修饰或宿主修饰。例如，可以针对特定患者病症调整使用以下项进行的fmt预治疗：靶向特定细菌群的不可吸收的abt、使用渗透性泻药以减少肠中的病原微生物负担、使用免疫抑制剂以减少肠的炎性状态、或使用益生元来诱导微生物群落的改变、或任何其他解决生态修饰需要的方法。基于上述标志物，技术人员可以鉴定哪种生态制剂对于改善产品可接受性是最好的并随后增加应答的可能性。此制剂优选设计为至少消除属于拟杆菌门或变形菌门的细菌。
[0176]
fmt预治疗的非限制性实例包括：
[0177]-靶向特定细菌群的不可吸收的抗生素(例如，万古霉素、庆大霉素、可利迈仙(colimycin)、利福昔明、甲硝唑、青霉素g及其混合物)，
[0178]-使用渗透性泻药来减少肠中的病原微生物负担
[0179]-使用益生元来诱导微生物群落的改变
[0180]-使用免疫抑制剂以减少肠的炎性状态，以及
[0181]-任何其他解决生态修饰需要的方法。
[0182]
根据特定实施方式，本发明涉及一种或几种不可吸收的抗生素用于治疗鉴定为可
能不会对fmt应答的gvhd患者(具有或不具有胃肠症状)的用途，所述抗生素选自由万古霉素、利福昔明、甲硝唑、青霉素g及其混合物组成的组。更特别地，患者患有sr-agvhd。根据本发明的此方面，在fmt(或者其他使用活微生物的治疗)之前施用抗生素。
[0183]
根据本发明的另一特定方面，除了靶向特定细菌群的不可吸收的抗生素之外，或者代替靶向特定细菌群的不可吸收的抗生素，患者接受渗透性泻药。当同时施用渗透性泻药和抗生素时，优选地在泻药治疗之前，施用抗生素。
[0184]
如已经提到的，本发明还涉及专门设计用于进行上述诊断/预后方法的材料，例如引物组和核酸微阵列。因此，包含此类材料的用于伴随诊断测定的试剂盒也是本发明的一部分。
[0185]
在生物测定后的描述过程中，本发明的其他特征也将变得明显，所述生物测定在本发明框架内进行并且为其提供所需的实验支持，而不限制其范围。
[0186]
实例
[0187]
本发明得到了两个项目的结果的支持，这两个项目是为研究fmt在gvhd群体中的潜在益处而建立的：
[0188]
1)由玛阿特制药公司(maat pharma)组织的正在进行的2期研究(heracles)，其研究了合并的fmt生物治疗剂maat013的疗效(描述于wo2019/171012)。我们现在预期，使用maat013生物治疗剂恢复完整的生态系统肠微生物群可能是治疗胃肠为主的sr-agvhd的有效方法，并且从而降低了同种异基因hsct后危及生命的并发症风险。
[0189]
2)早期使用项目(early access program，eap)，其允许对任何gvhd状况(慢性/急性，sd/sr)进行治疗。
[0190]
下文进一步描述这些程序，以及用于得到本文所述结果的材料和方法。
[0191]
heracles研究
[0192]
研究的人群由以下组成：首次发作iii级或iv级agvhd(＝胃肠2至4期)的患者，如果涉及其他器官，则以肠为主，对类固醇的一线疗法有抗性，年龄超过18岁。
[0193]
本研究的主要目的是通过完全应答(cr)和非常好的部分应答(vgpr)评估接受了同种异基因粪便微生物群转移(fmt)治疗的类固醇难治性(sr)胃肠(gi)急性移植物抗宿主病(agvhd)患者在28天(d28)的胃肠应答。
[0194]
本研究期间使用的fmt产品是玛阿特制药公司制造的maat013微生物群生物治疗剂。如wo 2019/171012中所述获得该产品。它在附图中被称为“imp”，代表“研究性药物产品”。
[0195]
图2示出了研究设计。
[0196]
15名患者的群组
[0197]
6名应答者＝r
[0198]
8名无应答者＝nr
[0199]
1患者在v2之前死亡(在分析中未考虑)
[0200]
在以下4次就诊时分别收集血液和粪便样品
[0201]
v1：未接受fmt
[0202]
v2：接受fmt 1次之后
[0203]
v3：接受fmt 2次之后
[0204]
v4：接受fmt 3之后28天(d28)
[0205]
一些对fmt治疗无应答的患者只接受了1次或2次fmt，而不是按计划接受3次。
[0206]
第一次就诊(v1)进行粪便收集(即在接受fmt治疗之前)对患者进行微生物群分析作为基线。在以下分析中，根据接受fmt后28天(d28)的胃肠(gi)应答，将患者进行区分。
[0207]
基于医生在v4(第28天)进行的gvhd分级和分期，根据以下逻辑自动计算治疗应答的评价。计算与基线(v1)的gvhd评价相比的应答。
[0208]
在以下情况下，认为实现了gi应答：
[0209]-完全应答(cr)：gi agvhd表现完全消退，即gi分期从任意期改善到0
[0210]-非常好的部分应答(vgpr)：gi agvhd的严重程度改善至少2期，或gi分期从2改善到1，但改善到0期除外
[0211]-部分应答(pr)：gi agvhd严重程度改善一期，但改善到0期或gi分期从2改善到1除外
[0212]
在以下情况下，患者被认为是无应答者：
[0213]-稳定性疾病(sd)：保持在gi agvhd的同一期
[0214]-进展性疾病(pd)：gi agvhd加重至少1期
[0215]-如果患者在d28(v4)之前接受了额外的全身性gvhd疗法
[0216]-如果患者在d28(v4)之前死亡
[0217]
早期使用项目(eap)
[0218]
发起eap是为了满足医生对使用fmt来治疗gvhd患者的日益增长的需求。
[0219]
根据医生对医疗需求的判断，所有类型的gvhd(急性/慢性/重叠综合征；sr或sd)都可以包含在eap项目中，这些类型的gvhd使用与全身性治疗的其他线相关的类固醇进行治疗。
[0220]
27名患者用maat013进行了治疗。
[0221]-19名患者患有sr-agvhd
[0222]-8名患者中：
[0223]
·
1名患者患有sr-cgvhd
[0224]
·
4名患者患有sd-agvhd
[0225]
·
2名患者患有具有重叠综合征的sd-agvhd
[0226]
·
1名患者患有具有重叠综合征的sr-agvhd
[0227]
所有这些患者的唯一可用数据是临床gvhd应答。
[0228]
对于4名患者(1名sr-cgvhd、2名sd-agvhd和1名具有重叠综合征的sd-agvhd)，我们得到了每次fmt治疗之前和在d28的粪便样品。
[0229]
第一次maat013施用后28天，在以下情况下，认为实现了gi应答：
[0230]-完全应答(cr)：gi agvhd表现完全消退，即gi分期从任意期改善到0
[0231]-非常好的部分应答(vgpr)：gi agvhd的严重程度改善至少2期，或gi分期从2改善到1，但改善到0期除外
[0232]-部分应答(pr)：gi agvhd严重程度改善一期，但改善到0期或gi分期从2改善到1除外
[0233]
在以下情况下，患者被认为是无应答者：
[0234]-稳定性疾病(sd)：保持在gi agvhd的同一期
[0235]-进展性疾病(pd)：gi agvhd加重至少1期
[0236]-如果患者在d28之前接受了额外的全身性gvhd疗法
[0237]-如果患者在d28之前死亡
[0238]
材料和方法
[0239]
粪便微生物群的16s rdna测序和生物信息学分析
[0240]
由欧陆基因组学公司(eurofins genomics)(德国埃伯斯贝格)进行了16s rdna测序。使用nucleospin土壤试剂盒(马歇雷纳格尔公司(machery nagel))提取基因组dna。根据制造商的说明，使用mytaq hs-mix 2x(比奥立公司(bioline))，为每个样品构建了靶向16s rrna基因的v3-v4区的测序文库。然后将文库合并在等摩尔混合物中并在miseq v3(依诺米那公司(illumina))中进行配对末端测序(2x300bp)。
[0241]
在使用flash(等人,2011)进行扩增子合并和使用trimmomatic(bolger等人,2014)进行质量过滤后，使用bowtie2(langmead、ben和salzberg,2013)进行宿主序列净化。使用vsearch(rognes等人,2016)以97％的同一性阈值进行操作分类单元(otu)序列聚类，并且然后使用silva ssu数据库版本128进行分类分析。为了公平比较，每个样品的序列数目随机归一化为相同的测序深度，即每个样品60000个扩增子。使用r统计软件(版本3.4.4)进行分类分析和多样性分析。
[0242]
宿主参数(血液的、粪便的)
[0243]
分别使用来自罗氏诊断公司(roche diagnostics)的cobas integra 400+/试剂盒albt2、prea、chol2在血浆上进行白蛋白、前白蛋白、总胆固醇评估。
[0244]
通过液相色谱-质谱在血浆上进行吲哚酚-3-硫酸酯和瓜氨酸评估。
[0245]
使用来自免疫诊断公司(immundiagnostik ag)的elisa试剂盒(elx800读数器/idk连蛋白ref k5600)在粪便上清液上进行粪便连蛋白评估。
[0246]
实例1：患有不同的gvhd的患者的fmt疗效(eap项目)
[0247]
在患有sr-agvhd的19名患者中：
[0248]-10名患者被认为是对maat013的无应答者
[0249]-9名患者被认为是对maat013的应答者。
[0250]
在患有除sr-agvhd外的各种gvhd的8名患者中，所有患者都实现了对maat013的gvhd应答(6名完全应答，2名非常好的部分应答)，这支持了这些患者可以直接接受maat013 fmt。
[0251]
实例2：fmt治疗的定植表现与gi应答之间的关系(heracles研究)
[0252]
图3描绘了患者的微生物群与施用的fmt产品(称为imp)的组成的相似性。bray curtis值越高，与产品越相似。
[0253]
在v1时，如所预料地，此相似性很低，因为还没有施用fmt。我们还观察到了r和nr微生物群之间的差异。这可能与nr患者微生物群的更高多样性有关，其增加了偶然地与产品具有共同otu的几率。
[0254]
在v2、v3(分别地在1次fmt和2次fmt后)时，与产品组合物的相似性仅在d28被认为是应答者的患者中增加。
[0255]
在v4(也就是d28，最后一次fmt后)时，这一差异最明显(t检验，p《0.05)。
[0256]
这些数据表明，患者的肠微生物群对fmt的反应并不相同。他们中的一些(即应答者)在fmt之后微生物群组成被修饰，并且这些修饰导致组成更接近施用的产品；其他的一些(这些大部分是无应答者)则不会获得更多与产品的相似性。
[0257]
图4展示了v2、v3、v4就诊中每一个和v1就诊之间的与产品(如图3所述)的相似性百分比的差异。进化值的范围可以分为3组：(1)进化是阴性的组，(2)进化较低的组[接近0，小于5]，以及(3)差异高于10的组。在v4时，所有应答者都属于该第三组，其还包括了一名无应答者(该组中的最低值)。
[0258]
根据这些进化结果，与产品的相似性增加最少5个百分点是定义产品的定植对患者微生物群产生影响的较好候选值。
[0259]
结论：肠微生物群和产品微生物群之间的相似性代表着fmt接受性，而fmt的接受性至少是影响患者应答的因素之一。
[0260]
maat指数
[0261]
基于公开的和内部数据的组合，玛阿特制药公司定义了3个指数：
[0262]-核心微生物组：在健康受试者的公共数据和maat数据中，定义了一个常见的微生物组，称为核心微生物组。所选择的属在群组中具有》80％的流行率，并且每个群组的中位丰度》0,1％。属的列表是：瘤胃球菌属、粪杆菌属、多尔氏菌属、粪球菌属、布劳特氏菌属、另枝菌属、拟杆菌属、罕见小球菌属、罗氏菌属、副拟杆菌属、毛螺菌属。
[0263]-健康指数：健康微生物组(含有通常与良好健康相关的细菌科)的指数。此指数是通过将这些细菌科的相对丰度求和而建立的：毛螺菌科、瘤胃球菌科、梭菌科、普雷沃氏菌科、丹毒丝菌科。
[0264]-butycore：15个产生丁酸盐的属的相对丰度和：布劳特氏菌属、粪杆菌属、另枝菌属、真杆菌属(eubacterium)、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属、臭味杆菌属(odoribacter)、罗氏菌属、霍尔德曼氏菌属(holdemanella)、厌氧棒状菌属(anaerostipes)、颤杆菌属(oscillibacter)、罕见小球菌属和丁酸弧菌属(butyrivibrio)。butycore可以解释为一种潜在的抗炎微生物群标志物。
[0265]
如图5所示，maat定义的3个指数在所有应答者患者中在v1和v4之间都增加了。对于所有应答者来说，butycore(在v1时接近0)在v4时大于5％，而对于所有无应答者来说，该值低于5％。该度量标准是用于评估定植表现的质量的另一个很好的候选值。
[0266]
实例3：fmt治疗的定植表现与gi应答之间的关系(eap项目)
[0267]
对于具有粪便样品的eap患者(1名患有sr-cgvhd、2名患有sd-agvhd以及1名患有具有重叠综合征的sd-agvhd-所有都是应答者)，根据在eap项目期间得到的数据，定植表现度量标准支持针对sr-agvhd数据概述的模式。
[0268]
图6描绘了在v1时和fmt3后患者的微生物群与施用的imp的组成的相似性。bray curtis值越高，与产品越相似。这证明了imp的微生物群的植入。
[0269]
图7描绘了对于在v1时和v3后的患者，针对imp测量的butycore。butycore具有从v1至v3后的增加模式，说明了定植表现的质量和fmt在微生物群重建中的效率。
[0270]
图8展示了针对在v1时和v3后的患者测量的健康指数。健康指数具有从v1至v3后的增加模式，说明了定植表现的质量和fmt在微生物群重建中的效率。
[0271]
结论：这些数据表明，患者的肠微生物群对fmt的反应并不相同。他们的微生物群
组成在fmt后被修饰，这些修饰导致了更多样化的组成，更接近于对均为应答者的那些患者施用的产品。
[0272]
实例4：宿主参数标志物的证据(heracles研究)
[0273]
瓜氨酸
[0274]
瓜氨酸是一种仅在小肠肠上皮细胞中产生的氨基酸。
[0275]
因为瓜氨酸不被肝脏代谢，故其血清浓度与总功能性肠上皮细胞质量密切相关。它还与年龄相关。值会受到肾功能的影响。瓜氨酸的正常范围是
[0276]
30-50umol/l。
[0277]
在gi-agvhd患者中瓜氨酸血症减轻(vokurka等人,med sci monit[医学科学监测]2013)。
[0278]
如图9所示，在maat013给药后，瓜氨酸水平在r患者中更高(在v2和v3时显著)。
[0279]
瓜氨酸的基线值也是预测性生物标志物，瓜氨酸》20μmol/l表明患者可能对治疗应答。
[0280]
硫酸吲哚酚
[0281]
硫酸吲哚酚是l-色氨酸的代谢物：
[0282]
l-色氨酸
→
吲哚
→
吲哚酚
→
硫酸吲哚酚(is)
[0283]
吲哚是由人体肠道中的l-色氨酸经由表达色氨酸酶的胃肠细菌产生的。吲哚酚是由吲哚经由肝脏中酶介导的羟基化产生的。随后，在肝脏中的磺基转移酶将吲哚酚转化为硫酸吲哚酚。
[0284]
尿3-is水平预测hsct后的结果，并与抗生素相关。hsct后前10天内低3-is水平与移植相关的死亡率显著升高和hsct后1年总生存期下降相关。不仅微生物组的多样性，连其特定组成都表明尿3-is。与高尿3-is水平相关的大部分otu属于毛螺菌科(直肠真杆菌)和瘤胃球菌科。低3is与芽孢杆菌纲的成员相关(weber等人,blood[血液]2015)。
[0285]
与3is相关的因素：与接受利福昔明的患者相比，接受环丙沙星/甲硝唑的患者的is浓度更低。早期全身性抗生素治疗也与低3is水平相关。
[0286]
降低的3-硫酸吲哚酚(3-is)尿排泄是肠微生物群破坏和更高的患胃肠(gi)移植物抗宿主病风险的标志物(weber等人,同上)。
[0287]
无法在heracles患者的尿液中评估3-is(未收集尿液)，但我们决定在血液样品中对其进行测试。可用的血液相关数据很少。
[0288]
如图10所示，在v2、v3和v4时，is水平在r患者中略高。在maat013给药后is水平似乎增加，这表明maat013的有益影响并且可能是植入的替代标志物。
[0289]
粪便连蛋白
[0290]
人连蛋白是一种通过可逆地调节细胞间紧密连接来增加小肠的上皮层通透性的蛋白质。
[0291]
在可以触发连蛋白释放的几种潜在肠道刺激中，小肠暴露于细菌和谷蛋白是迄今为止已确定的两种触发因素。肠道感染通过导致肠道屏障受损与几种病理状况的发病机制有关，包括过敏性疾病、自身免疫性疾病和炎性疾病。暴露于肠道细菌的小肠分泌连蛋白。这种分泌与所测试微生物的毒力无关，仅发生在暴露于细菌的小肠黏膜的管腔面，随后肠道通透性增加，同时伴随着蛋白质胞质紧密粘连蛋白(zo)-1从紧密连接复合体的脱离。这
种由连蛋白驱动的细胞旁途径打开可能代表了一种防御机制，它可以清除微生物，从而促进宿主对小肠细菌定植的先天免疫应答(fasano,clin gastroenterol hepatol[临床胃肠病学和肝病学]2012)。
[0292]
在克罗恩病中，粪便连蛋白水平升高。正常范围是61
±
46ng/ml(等人,pract lab med[应用实验室医学]2017)。
[0293]
如图11中所说明，3/4的应答者在v2时测量比在v1时具有略高的连蛋白水平。在群组水平上，对于所有就诊，粪便连蛋白在应答者中高于在无应答者中。
[0294]
前白蛋白
[0295]
图12展示了相比于无应答者，前白蛋白测量值在应答者中更高，在v2和v3时更显著。
[0296]
总胆固醇
[0297]
如图13中所示，在应答者中，胆固醇更高(所有就诊)。受试者250-012-002是例外，在所有就诊中具有最低值。
[0298]
实例5：预测fmt应答的微生物群标志物的证据
[0299]
图14和16示出了一系列微生物群生物标志物，这些标志物能够将有应答(gi d28)的群体与没有应答的群体区分开来。属于厚壁菌门的细菌的相对丰度是应答者(以深灰色表示)和无应答者(以浅灰色表示)之间的分层度量标准，应答者具有更高的厚壁菌门相对丰度(超过80％)，而无应答者具有低于30％的厚壁菌门相对丰度，只有一名受试者除外，从没对其进行fmt(v1)。在大多数应答者中，放线菌纲也倾向于更高(除了由一个无应答者达到的最高值7％)。拟杆菌门(对于r，小于15％；对于大多数nr，超过25％)和变形菌门(对于r，小于10％；对于大多数nr，超过25％)具有相反的模式：应答者具有更低的值。
[0300]
我们还评价了良好预后门相比于不良预后门的比率：(1)f_相比于_b_比率_log，其是厚壁菌门相比于拟杆菌门的比率的log10变换，以及(2)fa_相比于_bp_比率_log，其是(厚壁菌门+放线菌纲)相比于(拟杆菌门+变形菌门)的比率的log10变换。对于这两个比率，所有r的值都大于0，除1/8之外的所有nr都具有较低的值(图14)。
[0301]
同样地，高α多样性指数(此处表示为otu水平上的辛普森(simpson)指数)可能是不良预后生物标志物。所有r具有低于19％的辛普森指数，对于6/8的nr来说不是这样(图14)。
[0302]
图15描绘了选择重要特征并测量它们的定量作用的分析结果，所述特征在几个组(此处为2个组：应答者组和无应答者组)的分离中提供了丰富的信息。图15a展示了具有显著的分层作用的每个预选择的分类群的效应量。这些分类群呈现于图15b中，按照分类水平(p：门，c：纲，o：目，f：科，g：属)进行分组。有色的分类群对患者分层有用，而其他所示的分类群对分层没有影响。
[0303]
在fmt之前，针对给定患者以深灰色突出的分类群的更高的相对丰度预测了患者应答，而以浅灰色突出的那些或如图14中所展示的健康指数或核心微生物群或多样性的更高水平预测了无应答。
[0304]
图16和下文表1示出了在进行本发明时可以使用的公式的非限制性实例。
[0305][0306][0307]
表1：用于在具有gi症状的sr-agvhd患者中进行fmt表现预测测试的公式和相关阈值(#r截止值)的实例，其中通过16s测序测量了所列举的分类群的丰度。
[0308]
实例6：使用qpcr进行相对丰度评估
[0309]
例如使用下述方案和引物，定量pcr(qpcr或实时pcr)将有利地用于进行根据本发明的fmt表现预测测试。
[0310]
a.qpcr技术的选择
[0311]
定量pcr(qpcr或实时pcr)具有几个优点：只需要少量模板dna，具有高灵敏度、高通量处理、可承受的成本，并且所需的是实验室中通常可见的负担得起的设备(bacchetti de gregoris等人,2011)。
[0312]
b.方案实例
[0313]
注意：该方案可以根据新的引物设计及更新的16s rna基因序列数据库进行演变。
[0314]
根据制造商的说明，使用适于从粪便材料中提取dna的制造试剂盒提取dna。
[0315]
qpcr使用包括sybr的预混液一式两份进行并且在多孔(例如，96孔板)实时pcr检测系统上运行。
[0316]
使用对细菌分类群的16s rrna区具有特异性的引物。
[0317]
每个靶向分类群的qpcr(即每对引物)必须独立进行。
[0318]
可以使用的引物的实例在下表2中描述。
[0319][0320]
表2：在进行fmt表现预测测试时，可用于通过qpcr测量所列举的分类群的丰度的引物的实例。核苷酸符号：r＝a或g；y＝c或t；w＝a或t；和s＝c或g。
[0321]
pcr循环参数应针对该特定测定以及每个引物对效率进行优化。一个实例(yang等人,2015)提供了这些值：
[0322]
材料：使用2xfaststart sybr green预混液(诺唯赞公司(vazyme)，中国南京)的pcr系统测序仪。qpcr混合物含有10μl的具有染料1(dye1)的2xfast-start sybr green、0.5μl的每种正向和反向引物(最终浓度，0.4μm)、以及9μl的dna模板(平衡至10ng)。
[0323]
细菌引物的退火温度：60℃。
[0324]
变性的循环条件：95℃持续10min，随后是95℃持续15s和60℃持续1min的40个循环。
[0325]
应使用阳性和阴性对照。
[0326]
c.细菌分类群的相对丰度值
[0327]
可以相对于总细菌如下计算细菌分类群的相对丰度值(yang等人,2015)：
[0328][0329]
其中eff.bact(值在1和2之间)是细菌引物的计算的效率(2＝100％并且1＝0％)，并且eff.spec是指分类群特异性(厚壁菌门、拟杆菌门)引物的效率。ct
bact
和ct
spec
是热循环仪记录的ct值。“x”代表样品中存在的16s分类群特异性(例如厚壁菌门)拷贝数的百分比。
[0330]
实例7：预测fmt应答的额外标志物的鉴定
[0331]
材料和方法
[0332]
总共对24名患者进行了实验。最终的heracles群组包括9名额外的患者，这些患者在之前的实例中没有介绍过。
[0333]
使用luminex测定，测量了heracles研究中包括的患者在v1、v2、v3和v4时的血浆样品中的以下分子的浓度：
[0334]-ccl25-c-c基序趋化因子配体25
[0335]-ccl28-c-c基序趋化因子配体28
[0336]-cd14-分化簇14
[0337]-cd30-分化簇30
[0338]-ifn_γ-干扰素γ
[0339]-il_10-白细胞介素10
[0340]-il_17a-白细胞介素17a
[0341]-il_18-白细胞介素18
[0342]-il_1β-白细胞介素1β
[0343]-il_2-白细胞介素-2
[0344]-il_2ra-白细胞介素-2受体α链
[0345]-il_6-白细胞介素6
[0346]-il_8-白细胞介素-8
[0347]-ip_10-干扰素γ诱导蛋白10
[0348]-mcp_1-单核细胞趋化蛋白1
[0349]-reg3a-再生胰岛衍生蛋白3α
[0350]-tgfb_1-转化生长因子β1
[0351]-tgfb_2-转化生长因子β2
[0352]-tgfb_3-转化生长因子β3
[0353]-tnfα-肿瘤坏死因子
[0354]
luminex测定使用系统和以下luminex试剂盒进行：来自默克密理博公司(merck millipore)的tgfb1.2.3和scd14、以及来自biotechne公司的针对il-1b、il-2、sil-2ra、il-6、il-8、il-10、il-17a、il-18、ifng、tnfa、mcp1、ccl25、ccl28、scd30、cxcl10和regiiia的16通路(plex)luminex。
[0355]
使用相关方法，测量了heracles研究中包括的患者在v1、v2、v3和v4时的血清样品中的以下参数的浓度：
[0356]-zonu-血清连蛋白，通过elisa，使用elx800读数器/试剂盒idk连蛋白elisa ref.k 5601/免疫诊断公司(赛维尔公司(servibio))
[0357]-tas-总抗氧化状态，通过酶学方法，使用hitachi 912/试剂盒总抗氧化状态(tas)-ref nx2332/朗道公司(randox)
[0358]-alat-sgpt，通过ifcc(国际临床化学和检验医学联合会(international federation of clinical chemistry))，在来自罗氏诊断公司的cobas integra 400+/试剂盒altl上，在37℃，使用磷酸吡哆醛
[0359]-chog-总胆固醇，在来自罗氏诊断公司的cobas integra 400+/试剂盒chol2上，通过酶比色法
[0360]-ldh-乳酸脱氢酶，在来自罗氏诊断公司的cobas integra 400+/试剂盒ldhi2上，通过uv测试
[0361]-prealb-前白蛋白，在来自罗氏诊断公司的cobas integra 400
§
/试剂盒prea上，通过免疫测定
[0362]-nmo-单核细胞，通过流式细胞术(yumizen h500 ot)
[0363]-npba-多核嗜碱粒细胞，通过流式细胞术(yumizen h500 ot)
[0364]
pn-多核中性粒细胞(％)，通过流式细胞术(yumizen h500 ot)
[0365]
使用相关方法，测量了heracles研究中包括的患者在v1、v2、v3和v4时的血浆样品
中的以下参数：
[0366]-neopt-血液新蝶呤，通过elisa，使用elx800读数器/试剂盒新蝶呤elisa ref re9321/ibl国际有限公司(ibl international gmbh)
[0367]-citru-瓜氨酸，通过与串联质谱偶联的液相色谱
[0368]-indox-3-硫酸吲哚酚，通过与串联质谱偶联的液相色谱
[0369]-st2-：致瘤性抑制因子2，通过elisa，使用elx800读数器/试剂盒人st2/il-33r免疫测定quantikine elisa ref dst200/r&d系统公司(r&d systems)
[0370]
使用相关方法，测量了heracles研究中包括的患者在v1、v2、v3和v4时的粪便样品中的以下参数：
[0371]
·
短链脂肪酸，通过气相色谱-质谱
[0372]-aceta_s-乙酸盐butyr_s-丁酸盐
[0373]-isobut_s-异丁酸盐
[0374]-prop_s-丙酸盐
[0375]-valera_s-戊酸盐
[0376]
·
胆汁酸，通过与串联质谱偶联的液相色谱
[0377]-ca-胆酸
[0378]-cdca-鹅去氧胆酸
[0379]-dca-去氧胆酸
[0380]-lca-石胆酸
[0381]
·
calturbo-钙卫蛋白，通过免疫比浊法，使用cobas integra 400
§
/试剂盒fcal turbo钙卫蛋白ref b kcal-rest/公司
[0382]
·
zonu_s-粪便连蛋白，通过elisa测定，使用elx800读数器/idk连蛋白elisa ref k5600/免疫诊断公司
[0383]
·
neopt_s-粪便新蝶呤，通过elisa测定，使用elx800读数器/试剂盒新蝶呤elisa ref re59321/ibl国际有限公司
[0384]
使用完整的宿主参数列表，我们使用机器学习方法从这些特征中提取在每个时间点处在患者r相比于nr分层中权重最大的那些特征。如上文所表明的，进行r相比于nr分层(heracles研究)。
[0385]
机器学习建模
[0386]
训练期间使用的算法是带有用于确定正则化强度的内部交叉验证的岭逻辑回归。我们选择逻辑回归作为一个易于解释的模型：当一个特征与应答状态相关时，它返回每个特征的正权重，当特征与应答状态反相关时，它返回负权重。
[0387]
结果
[0388]
总体结果以auc(roc曲线下面积)表示，其可在图17中观察到。
[0389]
该图表明对于每个时间点的置信区间(浅灰色带)包围的平均auc(灰色线)。还提到了每次就诊时包括的患者人数。根据该图，总体预测是令人满意的，尤其是在v1(基线)和v3(第二次产品施用后)时，其中最小置信区间不超过0.5auc(虚线)，这可以解释为显著的。
[0390]
图18示出了最能推动预测结果的测量参数。
[0391]
对于每个点，当nr患者的相应参数值较大时，条形向左，当r患者的值较大时，条形
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技术特征：
1.一种方法，其用于评估需要用活微生物补充他/她的胃肠微生物群的一个受试者是否能从所述补充中受益，所述方法包括：a1.测量来自所述受试者的一个胃肠生物样品中的与良好预后相关的细菌的丰度，其中所述细菌属于选自下组的至少一个类别，该组由以下组成：-厚壁菌门；-芽孢杆菌纲和放线菌纲；-芽孢杆菌目、乳杆菌目和微球菌目；-葡萄球菌科、乳杆菌科和微球菌科；以及-葡萄球菌属、乳杆菌属、蜜蜂球菌属和节杆菌属；以及a2.确定一个第一值(#g)，其对应于在步骤a1中测量的丰度的一个加权和；和/或b1.测量来自所述受试者的一个胃肠生物样品中的与不良预后相关的细菌的丰度，其中所述细菌属于选自下组的至少一个类别，该组由以下组成：-拟杆菌门和变形菌门；-拟杆菌纲；-拟杆菌目和肠杆菌目；-拟杆菌科、紫单胞菌科、氨基酸球菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、梭菌科、普雷沃氏菌科和丹毒丝菌科；以及-拟杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属、多尔氏菌属、粪球菌属、布劳特氏菌属、另枝菌属、罕见小球菌属、罗氏菌属、副拟杆菌属和毛螺菌属；以及b2.确定一个第二值(#b)，其对应于在步骤b1中测量的丰度的一个加权和；以及c.使用在步骤a和/或步骤b中得到的结果，计算出至少一个得分(#r)，所述得分选自由#r1＝#g、#r2＝1:#b和/或#r3＝#g:#b组成的组；以及d.将在步骤c中得到的每个得分与一个或几个参考值进行比较，其中如果#r1、#r2和/或#r3优于所述一个或几个参考值，则所述受试者可能从活微生物的补充中受益，并且如果#r1、#r2和/或#r3低于所述一个或几个参考值，则在所述补充活微生物之前，所述受试者需要治疗以使所述微生物成功植入所述受试者的肠道。2.如权利要求1所述的方法，其中所述补充活微生物是粪菌移植(fmt)。3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述受试者在同种异基因造血干细胞移植(allo-hsct)后患有移植物抗宿主病(gvhd)。4.如权利要求3所述的方法，其中所述受试者在同种异基因造血干细胞移植(allo-hsct)后患有急性类固醇难治性移植物抗宿主病(sr-agvhd)。5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述受试者患有胃肠gvhd(gi gvhd)。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中(i)#g＝厚壁菌门，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(ii)#g＝厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或
(iii)#g＝厚壁菌门+放线菌纲，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(iv)#g＝放线菌纲+厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(v)#g＝厚壁菌门，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(vi)#g＝厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(vii)#g＝厚壁菌门+放线菌纲，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(viii)#g＝放线菌纲+厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝#g:#b；和/或(ix)#g＝厚壁菌门并且#r＝#g；和/或(x)#g＝厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，并且#r＝#g；和/或(xi)#g＝厚壁菌门+放线菌纲，并且#r＝#g；和/或(xii)#g＝放线菌纲+厚壁菌门，排除氨基酸球菌科和毛螺菌科，并且#r＝#g；和/或(xiii)#b＝拟杆菌门，并且#r＝1:#b；和/或(xiv)#b＝拟杆菌门+变形菌门，并且#r＝1:#b；和/或(xv)#g＝芽孢杆菌纲+任选地放线菌纲，#b＝拟杆菌纲+任选地γ变形菌纲+任选地反壁菌纲+任选地梭菌纲，并且#r＝#g:#b；和/或(xvi)#g＝芽孢杆菌目+乳杆菌目+微球菌目，#b＝拟杆菌目+肠杆菌目+任选地月形单胞菌目+任选地梭菌目，并且#r＝#g:#b；和/或(xvii)#g＝葡萄球菌科+乳杆菌科+微球菌科+任选地肠球菌科，#b＝拟杆菌科+紫单胞菌科+氨基酸球菌科+毛螺菌科+任选地肠杆菌科，并且#r＝#g:#b；和/或(xviii)#g＝葡萄球菌属+乳杆菌属+蜜蜂球菌属+节杆菌属，#b＝拟杆菌属+埃希氏菌属+志贺氏菌属，并且#r＝#g:#b；和/或(xix)#g＝芽孢杆菌纲+微球菌目，#b＝拟杆菌纲+肠杆菌目+氨基酸球菌科+毛螺菌科，并且#r＝#g:#b；和/或(xx)#b＝毛螺菌科+瘤胃球菌科+梭菌科，普雷沃氏菌科+丹毒丝菌科，并且#r＝1:#b；和/或(xxi)#b＝拟杆菌属+瘤胃球菌属+粪杆菌属+多尔氏菌属+粪球菌属+布劳特氏菌属+另枝菌属+罕见小球菌属+罗氏菌属+副拟杆菌属+毛螺菌属，并且#r＝1:#b。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述胃肠生物样品是直肠拭子或粪便样品。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过qpcr、16s测序、全宏基因组测序或通过微阵列对细菌进行量化。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中#b＝毛螺菌科+瘤胃球菌科+梭菌科+普雷沃氏菌科+丹毒丝菌科，并且#r＝1:#b>100表明所述受试者可能从所述活微生物的补充中受益。10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中#b＝拟杆菌属+瘤胃球菌属+粪杆菌属+多尔氏菌属+粪球菌属+布劳特氏菌属+另枝菌属+罕见小球菌属+罗氏菌属+副拟杆菌属+毛螺菌属，并且#r＝1:#b>50表明所述受试者可能从所述活微生物的补充中受益。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其进一步包括：a.测量来自所述受试者的至少一个生物样品中的选自下组的一个或几个预后标志物，该组由以下组成：胆固醇浓度、硫酸吲哚酚浓度、粪便连蛋白浓度、瓜氨酸浓度、前白蛋白浓度、致瘤性抑制因子2(st2)浓度、再生胰岛衍生蛋白3-α(reg3α)浓度、il-6浓度、il-1β浓度、ifnγ浓度、ccl28浓度和il-2浓度；b.将在步骤a中得到的值与参考值进行比较，其中：-粪便连蛋白浓度高于参考值；-瓜氨酸浓度高于参考值；-前白蛋白浓度高于参考值；-胆固醇浓度高于参考值；-硫酸吲哚酚浓度低于参考值；-st2浓度低于参考值；-reg3α浓度低于参考值的；-il-6浓度低于参考值；-il-2浓度低于参考值；-il-1β浓度低于参考值；-ifnγ浓度低于参考值；和/或-ccl28浓度高于参考值；是良好预后的另外指标。12.如权利要求11所述的方法，其中：-在直肠拭子或粪便样品中测量粪便连蛋白浓度；并且-在血液、血浆或血清中测量其他的预后标志物。13.一种fmt产品在治疗受试者的gvhd中的应用，所述受试者通过如权利要求1至11中任一项所述的方法测试表明可能从活微生物的补充中受益。14.一种试剂盒，其用于执行如权利要求1至12中任一项所述的方法，所述试剂盒包含对于测量丰度的细菌分类群具有特异性的引物。

技术总结
本披露涉及一种方法，其用于通过分析GVHD受试者的微生物群和/或宿主参数来评估需要补充活微生物的受试者是否能够从所述补充中受益。还提供了用于改善被鉴定为微生物疗法的不良应答者的患者状态的治疗方法，以及用于执行根据本发明的方法的材料和试剂盒。根据本发明的方法的材料和试剂盒。


技术研发人员：H
受保护的技术使用者：玛阿特制药公司
技术研发日：2021.04.16
技术公布日：2022/12/2