1.本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法。
背景技术：2.苝(perylene)是一种具有平面芳香结构，由五个苯环稠合而成的有机染料分子，具有优良的荧光量子效率和光热稳定性。苝分子容易在溶液中聚集而使荧光淬灭，而当其解聚集成单体后荧光强度增强。
3.凝血酶是参与凝血级联反应的关键丝氨酸蛋白酶，可催化可溶性纤维蛋白转化为不溶性纤维蛋白，活化血小板，在血液凝固的最后一步发挥着重要的作用。故而，凝血酶水平的定量检测具有重要意义。
4.石墨烯是由安德烈
·
海姆等人于2004年首次制备得到的，它是由一层密集的、处于蜂巢晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接形成的单原子层二维原子晶体。氧化石墨烯(graphene oxide，go)由于表面拥有丰富的含氧官能团(如羧基、羟基和环氧基)，所以在水溶液和其他溶剂中表现出好的分散性和溶解性，能有效猝灭荧光基团，在分析检测方法的构建中常作为荧光猝灭剂而被广泛应用。氧化石墨烯因其良好的吸附能力和猝灭效果，在荧光传感方面有着巨大的应用前景，尤其是氧化石墨烯对单链dna具有较强的吸附性能力，而对双链吸附能力较弱。
5.核酸适配体，也被称为“化学抗体”，它是一类通过筛选得到的寡聚核苷酸，能选择性地识别金属离子、小分子、多肽、蛋白质、细胞表面抗原甚至整个细胞等多种靶标。与抗体相比，核酸适配体具有尺寸小(一般在18-30nt左右)，容易合成，价格低廉，在高温下更为稳定，更快速的体外选择，无细胞化学合成，低毒性，低免疫原性和更强的组织穿透性，设计灵活，通过物理吸附或形成化学键来固定在传感器上等优异特质，这些优异性质都表明其在某些方面比抗体具有更强的亲和力和适用性。核酸适配体已经在凝血酶的相关定量检测中有所研究。
6.现有技术中，常用的检测凝血酶的手段有许多种，例如荧光法、免疫荧光、电化学、化学发光、比色法等。其中，基于荧光法的检测方法由其简便、灵敏、快速的优势而受到人们的日益关注。2018年yun xiang等人构建了用适配体识别凝血酶的荧光检测方法，实现了在血清样品中凝血酶的检测(anal.chim.acta,2018,1038:126-131.)。2021年yu等人构建了一种基于苝衍生物探针自组装食物的用于蛋白质区分的荧光传感阵列，成功地对9种蛋白进行区分(talanta,2021,224:121897.)。但是，目前已见报道的检测酶活性的方法，大多存在着需要荧光标记、稳定性差、步骤繁琐、或成本高等缺点。
技术实现要素：7.本发明的目的是针对现有技术中检测凝血酶活性的方法，大多存在着需要荧光标记、稳定性差、步骤繁琐、成本高等缺点问题，提供一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血
酶的方法。
8.本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
9.本发明的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，步骤如下：
10.将待测物加入检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度获得凝血酶的浓度；
11.所述检测体系由氧化石墨烯、苝衍生物探针、凝血酶核酸适配体(ssdna)、溶剂和缓冲液组成；
12.所述苝衍生物探针的结构式如下：
[0013][0014]
优选的是，所述待测物为水溶液、血清、唾液或细胞裂解液。
[0015]
优选的是，所述检测体系中，氧化石墨烯的浓度为5～60μg/ml，更优选的是5～50μg/ml。
[0016]
优选的是，所述检测体系中，苝衍生物探针的浓度为5nm～5μm，更优选的是20～1000nm。
[0017]
优选的是，所述检测体系中，凝血酶核酸适配体的浓度为5～50nm，更优选的是10～50nm，尤其优选的是15～40nm。
[0018]
优选的是，所述检测体系中，凝血酶核酸适配体的碱基数为5～80mer，更优选的是，凝血酶核酸适配体的碱基数为24mer。
[0019]
优选的是，所述凝血酶核酸适配体的序列为：ggttggtgtggttgg、agtccgtggtagggcaggttggggtgact、ataggttggtgtgggttgg、ctatcagtccgtggtagggcaggttggggtgact或ggttggtgtggttggtgtggttgg。
[0020]
优选的是，所述溶剂为水或有机溶剂，更优选的，所述有机溶剂为乙醇。
[0021]
优选的是，所述缓冲液为tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、mops缓冲液或hepes缓冲液；更优选的是，所述缓冲液为tris-hcl缓冲液，检测体系中，tris的浓度为10～100mm，nacl的浓度为50～200mm，ph 6.6～9.4，尤其优选的是，ph 7.0～7.8。
[0022]
本发明的发明原理为：如图5所示，带有负电荷的苝衍生物探针在溶剂中以单体形式存在，在激发光照射下能发出强烈的荧光，当加入氧化石墨烯后，二者之间存在π-π相互作用、疏水作用、氢键作用等促使二者相互靠近的作用，以及带有负电荷的苝衍生物探针和带有负电荷的氧化石墨烯之间相互排斥的静电作用等，促使二者相互靠近的作用远大于二者之间相互排斥的作用，因此导致苝衍生物探针在氧化石墨烯上吸附而发生荧光猝灭，此时在体系中加入能够与凝血酶特异性识别的ssdna后，氧化石墨烯对ssdna的强大吸附能力强于氧化石墨烯对苝衍生物探针的吸附能力，导致ssdna占用苝衍生物探针的位置，从而使苝探针脱离氧化石墨烯，苝探针重新恢复为游离的单体状态，荧光恢复。而当体系内再加入凝血酶后，ssdna与凝血酶特异性结合后，脱离氧化石墨烯，空出的氧化石墨烯表面将吸附游离的苝衍生物探针到氧化石墨烯上，荧光重新猝灭。简而言之，有凝血酶则荧光强度较
低，没有凝血酶荧光强度较高，本发明通过荧光强度的变化能够检测凝血酶的浓度。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0024]
本发明的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法能够采用免标记的方法定量检测凝血酶，所需材料成本低，无需大型仪器，便捷高效，构建方法简单，无需复杂程序，反应迅速，基本无毒害，反应条件温和，选择性好，且稳定性好，灵敏度高，在0～6mu/ml范围内有很好的线性响应，检测限低至0.082mu/ml。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0026]
图1为本发明实施例1中在苝衍生物探针中加入不同浓度的氧化石墨烯的响应曲线。
[0027]
图2为本发明实施例2中在苝衍生物探针、氧化石墨烯和凝血酶核酸适配器中加入不同ph值的缓冲液后，检测体系荧光强度的变化。
[0028]
图3为本发明实施例3中在检测体系中加入不同浓度的凝血酶的响应曲线。
[0029]
图4为本发明实施例4中检测体系对凝血酶的特异性。
[0030]
图5为本发明基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法的原理图。
[0031]
具体实施方法
[0032]
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0033]
本发明的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，步骤如下：
[0034]
将待测物加入检测体系中，用荧光光谱仪检测其荧光强度，通过荧光强度获得凝血酶的浓度；
[0035]
其中，检测体系由氧化石墨烯、苝衍生物探针、凝血酶核酸适配体、溶剂和缓冲液组成；
[0036]
苝衍生物探针的结构式如下：
[0037][0038]
上述技术方案，待测物优选为水溶液、血清、唾液或细胞裂解液。
[0039]
上述技术方案，检测体系中，优选氧化石墨烯的浓度为5～60μg/ml，更优选的是5～50μg/ml。
[0040]
上述技术方案，检测体系中，优选苝衍生物探针的浓度为5nm～5μm，更优选的是20～1000nm。
[0041]
上述技术方案，检测体系中，优选凝血酶核酸适配体的浓度为5～50nm，更优选的
是10～50nm，尤其优选的是15～40nm。
[0042]
上述技术方案，检测体系中，优选凝血酶核酸适配体(ssdna)的碱基数为5～80mer，更优选的是5～24mer。
[0043]
上述技术方案，凝血酶核酸适配体(ssdna)的序列为ggttggtgtggttgg、agtccgtggtagggcaggttggggtgact、ataggttggtgtgggttgg、ctatcagtccgtggtagggcaggttggggtgact或ggttggtgtggttggtgtggttgg。
[0044]
上述技术方案，检测体系中，优选缓冲液为tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、mops缓冲液或hepes缓冲液；更优选的是，tris-hcl缓冲液，检测体系中，tris的浓度为10～100mm，nacl的浓度为50～200mm，ph 6.6～9.4，尤其优选的是，ph 7.0～7.8。
[0045]
上述技术方案中，溶剂为水或有机溶剂，水优选为超纯水，有机溶剂优选为乙醇。
[0046]
上述技术方案中，氧化石墨烯、苝衍生物探针、凝血酶核酸适配体、溶剂和缓冲液均可通过商购获得，没有特殊要求。
[0047]
上述技术方案中，检测体系的配制过程，优选步骤如下：
[0048]
步骤一、将苝衍生物探针、氧化石墨烯、溶剂和缓冲液混合均匀，得到第一混合液；
[0049]
步骤二、向第一混合液中加入凝血酶核酸适配体，形成检测体系。
[0050]
上述技术方案中，优选氧化石墨烯和苝衍生物探针溶于部分溶剂中，再将苝衍生物探针溶液、氧化石墨烯溶液、溶剂和缓冲液混合，保证最终浓度即可。
[0051]
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
[0052]
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0053]
以下结合实施例进一步说明本发明。
[0054]
实施例1
[0055]
将苝衍生物探针溶液(溶剂为水)、氧化石墨烯溶液(溶剂为水)、水和tris-hcl缓冲液(50mmtris，100mmnacl，ph 7.8)混合，得到苝衍生物探针终浓度20nm，氧化石墨烯终浓度0～60μg/ml的检测体系，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0056]
图1为本发明实施例1中在苝衍生物探针中加入不同浓度的氧化石墨烯的响应曲线，从图1可以看出，随着氧化石墨烯加入浓度从0增加到60μg/ml，苝衍生物探针的荧光强度逐渐降低，随后达到平台期，氧化石墨烯的浓度优选为25μg/ml。
[0057]
实施例2
[0058]
将苝衍生物探针溶液(溶剂为水)、氧化石墨烯溶液(溶剂为水)、水和tris-hcl(50mmtris，100mm nacl，ph分别为7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.4)缓冲液混合，得到苝衍生物探针终浓度20nm，氧化石墨烯终浓度25μg/ml的检测体系，加入终浓度为20nm的凝血酶核酸适配体(ggttggtgtggttggtgtggttgg)后，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0059]
图2为本发明实施例2的检测体系中加入不同ph值的缓冲液后的检测体系荧光强度的变化，从图2可以看出，ph 7.8的缓冲液为最佳。
[0060]
实施例3
[0061]
将苝衍生物探针溶液(溶剂为水)、氧化石墨烯溶液(溶剂为水)、水和tris-hcl
(50mmtris-hcl，100mmnacl，ph 7.8)缓冲液混合，得到苝衍生物探针终浓度20nm，氧化石墨烯终浓度25μg/ml的检测体系，加入终浓度为20nm的凝血酶核酸适配体(ggttggtgtggttggtgtggttgg)后，再向检测体系中加入不同浓度的凝血酶(0mu/ml，0.6mu/ml，1.2mu/ml，2.4mu/ml，3.6mu/ml，6.0mu/ml)，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0062]
图3为本发明实施例3中在检测体系中加入不同浓度的凝血酶的响应曲线。从图3可以看出，检测体系的荧光随凝血酶的浓度从0～6mu/ml升高而降低，在检测体系在0～6mu/ml范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，说明本发明的传感器阵列在检测凝血酶方面具有较高的重现性和稳定性。
[0063]
实施例4
[0064]
将苝衍生物探针溶液(溶剂为水)、氧化石墨烯溶液(溶剂为水)、水和tris-hcl(50mmtris，100mm nacl，ph分别为7.8)缓冲液混合，得到苝衍生物探针终浓度20nm，氧化石墨烯终浓度25μg/ml的检测体系，加入终浓度为20nm的凝血酶核酸适配体(ggttggtgtggttggtgtggttgg)后，分别加入蛋白thrombin(凝血酶)、trypsin(木瓜蛋白酶)、bsa(牛血清蛋白)和lysozyme(溶菌酶)，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0065]
图4为本发明的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的传感器阵列对凝血酶的特异性检测，从图4可以看出，只有凝血酶组相对于空白组来说荧光减弱了32倍，在其他组和对照组相比没有显著差异，这说明检测体系中干扰蛋白的存在不影响凝血酶的检测。
[0066]
显然，上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
技术特征：1.基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤如下：将待测物加入检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度获得凝血酶的浓度；所述检测体系由氧化石墨烯、苝衍生物探针、凝血酶核酸适配体、溶剂和缓冲液组成；所述苝衍生物探针的结构式如下：2.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述待测物为水溶液、血清、唾液或细胞裂解液。3.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述检测体系中，氧化石墨烯的浓度为5～60μg/ml。4.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述检测体系中，苝衍生物探针的浓度为5nm～5μm。5.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述检测体系中，凝血酶核酸适配体的浓度为5～50nm。6.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述检测体系中，凝血酶核酸适配体的碱基数为5～80mer。7.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述凝血酶核酸适配体的序列为：ggttggtgtggttgg、agtccgtggtagggcaggttggggtgact、ataggttggtgtgggttgg、ctatcagtccgtggtagggcaggttggggtgact或ggttggtgtggttggtgtggttgg。8.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述溶剂为水或有机溶剂。9.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述缓冲液为tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、mops缓冲液或hepes缓冲液。10.根据权利要求1所述的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，所述检测体系中，氧化石墨烯的浓度为5～50μg/ml，苝衍生物探针的浓度为20～1000nm，凝血酶核酸适配体的浓度为10～50nm，凝血酶核酸适配体的碱基数为24mer，溶剂为水或有机溶剂，缓冲液为tris-hcl缓冲液，检测体系中，tris的浓度为10～100mm，nacl的浓度为50～200mm，ph 6.6～9.4。
技术总结本发明涉及一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，属于生物分析技术领域。解决了现有技术中检测凝血酶活性的方法，大多存在着需要荧光标记、稳定性差、步骤繁琐、成本高等缺点的问题。本发明的方法，步骤如下：将待测物加入检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度获得凝血酶的浓度；其中，检测体系由氧化石墨烯、苝衍生物探针、凝血酶核酸适配体、溶剂和缓冲液组成。该方法，所需材料成本低，无需大型仪器，便捷高效，构建方法简单，无需复杂程序，反应迅速，基本无毒害，反应条件温和，选择性好，且稳定性好、灵敏度高，在0～6mU/mL范围内有很好的线性响应，检测限低至0.082mU/mL。0.082mU/mL。0.082mU/mL。
技术研发人员：王方远 张娜 叶敏 白青 丁亚莉 王苗 钱声艳 段晓雷 刘建国
受保护的技术使用者：遵义医科大学
技术研发日：2022.09.16
技术公布日：2022/12/5
