1.本发明涉及基因工程和生物工程技术领域，特别涉及蟛蜞菊内酯在制备炎症小体活化抑制剂或治疗痛风性关节炎的药物中的应用。
背景技术：2.痛风性关节炎主要是由机体内嘌呤代谢异常导致血液尿酸增多，沉积在关节的尿酸钠(monosodium urate,msu)晶体可以诱发红、肿、热、痛，严重时致关节畸形和功能障碍。临床常用的抗痛风药物包括止痛药如秋水仙碱、非甾体抗炎药、糖皮质激素，降尿酸药如别嘌呤醇、非布司他、苯溴马隆等，碱化尿液药如碳酸氢钠等。虽然这些药物有一定的疗效，但长期使用会引起肝肾损伤和胃肠道反应等副作用。
3.痛风性关节炎属中医“痹证”范畴，是中医骨伤科治疗的优势病种。中医药治疗痛风性关节炎主要以疏风通络，消炎止痛为主，适当调补肝肾以强筋健骨。据清代著名医家汪昂撰写的《医方集解》记载，中药二至丸能补腰膝、壮筋骨、强肾阴和乌髭发。二至丸是由墨旱莲和女贞子制成的药丸。其中墨旱莲性味甘、酸、寒，归肾、肝二经，具有滋补肝肾、凉血止血的功效，适用于肝肾阴虚所致的眩晕耳鸣，腰膝酸软，阴虚血热、吐血、衄血、尿血，血痢，崩漏下血，外伤出血。
4.蟛蜞菊内酯(wedelolactone)是从墨旱莲(herbaecliptae)的地上部分分离提取的主要活性成分之一，墨旱莲又名旱莲草、猪牙草，为菊科植物鳢肠(eclipta prostrate l.)的干燥地上部分，其作为常用中药收载于中国药典。
5.蟛蜞菊内酯属于香豆草醚类物质，白色结晶粉末，可溶于甲醇、dmso等溶剂，不溶于水、石油醚、二氯甲烷、氯仿。它的分子式是c
16h10
o7，分子量为314.25，英文别名为5,11,12-trihydroxy-7-methoxycoumestan，其化学结构如下所示。
[0006][0007]
nlrp3炎症小体活化与许多非感染性的炎症(如痛风性关节炎)相关，当巨噬细胞吞噬病理性人体成分后，如体内的msu晶体等，可以活化nlrp3炎症小体，并引起il-1β等炎症因子释放到细胞外，从而募集免疫细胞浸润到关节内，引起关节软骨炎症性损伤，导致关节肿胀和疼痛。
[0008]
然而，目前尚未有蟛蜞菊内酯通过抑制nlrp3炎症小体活化治疗痛风性关节炎的相关报道。
技术实现要素：[0009]
发明人在研究中发现蟛蜞菊内酯可以抑制炎症小体活化，本发明的首要目的在于提供蟛蜞菊内酯在制备炎症小体活化抑制剂中的应用。
[0010]
本发明的另一目的在于提供蟛蜞菊内酯在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。
[0011]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0012]
蟛蜞菊内酯在制备炎症小体活化抑制剂中的应用。
[0013]
所述的蟛蜞菊内酯的cas号为524-12-9，其结构式如下所示：
[0014][0015]
优选地，所述的炎症小体为nlrp3炎症小体；更优选地，所述炎症小体为巨噬细胞的nlrp3炎症小体；最优选地，所述巨噬细胞为骨髓来源的巨噬细胞(bmdms)。
[0016]
优选地，所述的炎症小体活化由三磷酸腺苷(atp)、尼日利亚菌素(nigericin)和尿酸钠(msu)晶体中的至少一种激活。
[0017]
蟛蜞菊内酯在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用，是基于发明人发现蟛蜞菊内酯抑制骨髓来源的巨噬细胞(bmdms)的nlrp3炎症小体活化，从而减少炎症因子表达、减少炎症细胞浸润，因而治疗痛风性关节炎所作出的发明创造。
[0018]
优选地，所述炎症因子为il-1β和tnf-α中的至少一种。
[0019]
所述的治疗痛风性关节炎的药物的组分包括药学上可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分。
[0020]
所述的治疗痛风性关节炎的药物的剂型包括但不限于剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液和注射剂。
[0021]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022]
蟛蜞菊内酯可明显抑制三磷酸腺苷(atp)、尼日利亚菌素(nigericin)和尿酸钠(msu)晶体刺激巨噬细胞引起的炎性小体活化。蟛蜞菊内酯主要是通过抑制炎症因子il-1β和tnf-α的分泌，防止炎症细胞浸润引起的关节组织损伤，可用广谱抗nlrp3活化的抑制剂，在相关药物尤其是治疗痛风性关节炎的药物的开发具有很好的应用前景。
附图说明
[0023]
图1是用流式细胞仪检测诱导分化的小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmdms)cd11b
+
f4/80
+
阳性细胞百分比图。
[0024]
图2是蟛蜞菊内酯对lps联合atp或nigericin分别刺激的bmdms细胞内炎症小体组分蛋白caspase-1、nlrp3和凋亡相关斑点样蛋白(asc)表达的影响图；其中，(a)是脂多糖(lps)和atp刺激后的细胞培养基浓缩液和细胞裂解液的免疫印迹分析图，(b)是lps和
nigericin刺激后的细胞培养基浓缩液和细胞裂解液的免疫印迹分析图，(c)是elisa法检测细胞培养基中il-1β的浓度直方图。
[0025]
图3是蟛蜞菊内酯对lps联合msu刺激的bmdms细胞内炎症小体组分蛋白caspase-1、nlrp3和asc表达的影响图；其中，(a)是细胞培养基浓缩液和细胞裂解液的免疫印迹分析图，(b)是elisa法检测细胞培养基中il-1β的浓度直方图。
[0026]
图4是蟛蜞菊内酯对lps联合atp、nigericin或msu分别刺激的bmdms细胞内asc蛋白聚集形成斑点的影响图；其中(a)和(b)是asc斑点形成的代表性细胞免疫荧光图，(c)是含asc斑点的细胞占总细胞数量的百分比直方图。
[0027]
图5是蟛蜞菊内酯对msu晶体诱导的小鼠膝关节炎的影响；其中(a)是在不同时间测量关节肿胀，(b)是关节组织切片h&e染色图。
[0028]
图6是蟛蜞菊内酯对msu晶体诱导的小鼠膝关节炎症小体活化的影响；其中(a)是免疫组化法检测关节组织内il-1β和caspase-1p20的表达情况，(b)是elisa法检测关节组织分泌的il-1β和tnf-α浓度直方图。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例和附图说明对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
[0030]
实施例1
[0031]
(1)小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmdms)的细胞培养：颈椎脱臼处死c57bl/6雄性小鼠(来源：广州中医药大学动物实验中心，许可证号：scxk2018-0034)，分离小鼠股骨与胫骨，用5ml注射器吸取dmem培养基将骨髓冲出到细胞培养皿内。并用注射器吹打培养基使聚集的骨髓细胞散开。用孔径为40μm的细胞过滤网过滤含骨髓的dmem培养基，过滤后的含骨髓dmem培养基转至15ml离心管，1500rpm离心5～7min，弃上清液，加入bmdms诱导培养基(其由以下组分组成：10％胎牛血清(fbs)，20％的l929细胞培养上清，1％双抗，余量为高糖dmem培养基)重悬细胞沉淀呈单个悬浮状态，细胞计数，取1
×
107个骨髓细胞分别种在2个新的无菌培养皿中，补齐bmdms诱导培养基至10ml，摇匀，置于37℃，5％二氧化碳恒温培养箱中培养。
[0032]
(2)bmdms的诱导：取材得到的细胞在第3天用胶头滴管吸弃5ml原有的bmdms诱导培养基，并沿皿侧壁加入新的10ml bmdms诱导培养基。在第5天弃去全部原有的bmdms诱导培养基加入新的10ml bmdms诱导培养基。至第7天，bmdms细胞诱导完成。收集细胞后用抗小鼠的抗体cd11b-fitc(购自bd biosciences公司，型号：557396)和f4/80-pe(购自bd biosciences公司，型号：565410)孵育细胞，用流式细胞仪检测巨噬细胞(cd11b
+
f4/80
+
)比例。
[0033]
实施例2
[0034]
(1)bmdms细胞刺激方法：取诱导7天的bmdms细胞，将细胞接种到6孔板，每孔2
×
106个细胞。atp刺激分6组：正常组，lps组，lps+atp，lps+蟛蜞菊内酯(10μmol/l)+atp，lps+蟛蜞菊内酯(20μmol/l)+atp，lps+蟛蜞菊内酯(40μmol/l)+atp。nigericin刺激分6组：正常组，lps组，lps+nigericin，lps+蟛蜞菊内酯(10μmol/l)+nigericin，lps+蟛蜞菊内酯(20μ
mol/l)+nigericin，lps+蟛蜞菊内酯(40μmol/l)+nigericin。具体步骤为：用500ng/ml脂多糖(lps)刺激细胞4h，再分别加入10、20和40μmol/l蟛蜞菊内酯处理30min，最后分别加nlrp3炎症小体的激活剂3mmol/l atp或10μmol/l nigericin刺激1h(正常组加等体积的含1％fbs的高糖dmem培养基)。
[0035]
(2)免疫印迹实验检测细胞培养基浓缩液：收集刺激后的细胞培养上清液，取培养上清800μl至2ml ep管内，加入等体积(800μl)甲醇和1/4体积(200μl)氯仿震荡混匀，而后以13000rpm的转速4℃离心10min，用移液枪小心吸弃上层液体(注意枪尖勿碰到沉淀物)。再次加入等体积(800μl)甲醇，震荡混匀后4℃13000rpm离心5min，吸弃上清，保留沉淀在ep管底。置开盖的ep管于55℃金属浴加热7min至沉淀干燥，每管沉淀加入35μl的2
×
蛋白上样缓冲液溶解，使用涡旋震荡器剧烈震荡ep管使蛋白充分溶解。沸水浴加热约7min使蛋白变性。免疫印迹法检测上述处理的蛋白，以检测caspase-1p20和il-1β蛋白。
[0036]
(3)elisa试剂盒检测il-1β浓度：吸取100μl细胞培养基上清液到2ml ep管内，采用elisa试剂盒(购自欣博盛生物，型号：emc001b)测定il-1β含量，其操作步骤按照试剂盒说明书进行。最后用酶标仪上机检测，绘制标准曲线后分析计算细胞因子浓度。
[0037]
(4)免疫印迹实验检测细胞裂解液：细胞刺激完成后，吸走培养基后，往6孔板内加入150μl/孔的裂解液(购自碧云天生物科技有限公司，western及ip细胞裂解液型号:p0013)，置于冰上裂解细胞15min。裂解完成后收集细胞到1.5ml ep管内，超声裂解5min，而后4℃13000rpm离心15min，收集上层清液，即为细胞蛋白样品。用bca蛋白定量法测定细胞裂解液中蛋白的浓度，并用超纯水和5
×
蛋白上样缓冲液调整蛋白浓度，使各样品蛋白质浓度一致。-20℃保存蛋白样品，用免疫印迹法(western blot实验)进行检测。
[0038]
(5)结果：炎症小体激活程度以活化的caspase-1p20和il-1β释放水平反映，蟛蜞菊内酯能剂量依赖性地抑制caspase-1p20和成熟的il-1β释放(图2(a)和图2(b))，elisa结果也显示蟛蜞菊内酯能抑制il-1β的分泌(图2(c))，这些结果表明蟛蜞菊内酯可阻止atp或nigericin诱导的bmdms内nlrp3炎症小体的激活。图2(a)和图2(b)中gapdh是电泳上样的内参蛋白，说明各泳道上样蛋白总量相等。
[0039]
实施例3
[0040]
(1)bmdms细胞刺激方法：取诱导7天的bmdms细胞，将细胞接种到6孔板，每孔2
×
106个细胞。实验分6组：正常组，lps组，lps+msu，lps+蟛蜞菊内酯(10μmol/l)+msu，lps+蟛蜞菊内酯(20μmol/l)+msu，lps+蟛蜞菊内酯(40μmol/l)+msu。具体步骤为：用lps(500ng/ml)刺激细胞4h，再分别加10、20和40μmol/l蟛蜞菊内酯处理30min，最后加msu(300μg/ml)刺激6h(正常组加等体积含1％fbs的高糖dmem培养基)。
[0041]
(2)免疫印迹实验检测细胞培养基浓缩液：取刺激后的800μl细胞培养上清至2ml ep管内，加入等体积甲醇和1/4体积氯仿震荡混匀，而后以13000rpm的转速4℃离心10min，吸弃上层液体。再次加入等体积甲醇，震荡混匀后4℃13000rpm离心5min，吸弃上清，保留沉淀在ep管底。置开盖的ep管于55℃金属浴加热7min至沉淀干燥，每管沉淀加入35μl的2
×
蛋白上样缓冲液溶解，使用涡旋震荡器剧烈震荡ep管使蛋白充分溶解。沸水浴加热约7min使蛋白变性。经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测，以检测caspase-1p20和il-1β蛋白。
[0042]
(3)elisa法检测上清液中il-1β释放量：将各孔内收集的培养基上清液吸100μl到2ml ep管内，依据elisa试剂盒(购自欣博盛生物，型号：emc001b)说明书进行操作。最后用
酶标仪检测od值，绘制标准曲线后计算细胞因子浓度。
[0043]
(4)免疫印迹实验检测细胞裂解液：细胞刺激完成后，吸取培养基后，往6孔板内加入150μl/孔的裂解液(购自碧云天生物科技有限公司，western及ip细胞裂解液型号:p0013)，置于冰上裂解细胞15min。裂解完成后收集细胞到1.5ml ep管内，超声裂解5min，而后4℃13000rpm离心15min，收集上层清液，即为细胞蛋白样品。用bca试剂盒测定细胞裂解液中蛋白的浓度，并用超纯水和5
×
蛋白上样缓冲液调整蛋白质浓度，使每个样品蛋白质浓度一致，并计算上样量。-20℃保存蛋白样品，用免疫印迹法(western blot实验)进行检测。
[0044]
(5)结果：蟛蜞菊内酯剂量依赖性地抑制caspase-1p20和成熟的il-1β的表达(图3(a))，elisa的结果也显示蟛蜞菊内酯抑制il-1β的分泌(图3(b))，说明蟛蜞菊内酯能抑制msu晶体诱导的nlrp3炎症小体活化和il-1β的分泌。
[0045]
实施例4
[0046]
(1)asc斑点的检测：将bmdms细胞以4
×
105/孔的密度种植于24孔板中，lps刺激细胞4h，然后加40μmol/l蟛蜞菊内酯预刺激30min，接着分别加atp、nigericin刺激1h或msu刺激6h。用4％多聚甲醛固定细胞15min，吸弃固定液，pbs洗涤3次，加入预冷的甲醇-20℃透膜10min，吸弃甲醇液，pbs洗涤3次，加入封闭液室温孵育1h。吸弃封闭液，pbs洗1次后，每孔加入300μl的asc一抗(1:300)，4℃孵育过夜。pbs洗涤3次，每孔加入300μl体积的alexa488标记的山羊抗兔igg的二抗(1：750)，避光孵育1h。pbs洗涤3次，每孔加入300μl细胞核标记物hoechst 33342(终浓度5μg/ml)室温避光染色10min，吸弃染液后，用pbs洗涤1次，最后添加0.5ml的pbs。采用蔡司倒置荧光显微镜采集荧光图像。
[0047]
(2)结果：蟛蜞菊内酯抑制lps联合atp、nigericin或msu晶体刺激诱导的asc斑点的形成(图4)，进一步说明蟛蜞菊内酯通过阻碍细胞内asc蛋白聚集形成nlrp3复合物，干扰炎症小体的组装和激活。
[0048]
实施例5
[0049]
(1)msu晶体诱导关节炎：18只8周龄的雄性c57bl/6小鼠(购自广州中医药大学动物实验中心，许可证号：scxk2018-0034)，随机分为三组：溶剂pbs对照组、msu晶体诱导关节炎组和msu晶体+蟛蜞菊内酯组，每组6只小鼠。
[0050]
(2)msu晶体诱导小鼠关节炎：在实验开始前测量每只小鼠的膝关节直径，并做好记录。蟛蜞菊内酯+msu组小鼠进行腹腔注射蟛蜞菊内酯(20mg/kg)，pbs溶剂组和msu晶体组的小鼠腹腔注射相同体积的溶剂对照(90％pbs+10％dmso)。药物注射1h后开始进行造模。首先对小鼠进行麻醉，先用75％酒精棉球对小鼠左侧膝关节附近的皮毛进行消毒，用手固定小鼠膝关节并调整方向，然后用微量注射器往蟛蜞菊内酯+msu组和msu晶体组小鼠左侧膝关节腔内注射msu(0.5mg晶体重悬在50μl无菌pbs中)。pbs溶剂组小鼠左侧膝关节内注射相同体积的pbs作为阴性对照组。在注射msu晶体后的1、6、12h和24h分别测量各小鼠关节的肿胀程度。msu注射24小时后处死小鼠，立即分离左侧膝关节组织，并在含1％青霉素链霉素的opti-mem培养基中培养1h。收集小鼠关节培养上清并用elisa试剂盒检测il-1β(欣博盛生物，型号：emc001b)和tnf-α(欣博盛生物，型号：emc102a)细胞因子含量。4％多聚甲醛固定膝关节。
[0051]
(3)结果：蟛蜞菊内酯能缓解关节肿胀(图5(a))，组织切片he染色结果显示蟛蜞菊内酯能减少炎症细胞浸润(图5(b))，免疫组化结果显示蟛蜞菊内酯降低msu诱导的
caspase-1p20和il-1β的表达(图6(a))，elisa结果也说明蟛蜞菊内酯能抑制关节分泌炎症因子il-1β和tnf-α(图6(b))。
[0052]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.蟛蜞菊内酯在制备炎症小体活化抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的炎症小体为nlrp3炎症小体。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的炎症小体为巨噬细胞的nlrp3炎症小体。4.蟛蜞菊内酯在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的蟛蜞菊内酯抑制炎症因子il-1β和tnf-α的表达，减少炎症细胞浸润。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的治疗痛风性关节炎的药物的组分包括药学上可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的治疗痛风性关节炎的药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液或注射剂。
技术总结本发明公开了蟛蜞菊内酯在制备炎症小体活化抑制剂或治疗痛风性关节炎的药物中的应用。本发明发现蟛蜞菊内酯是抑制NLRP3炎症小体活化的抑制剂，且蟛蜞菊内酯可有效缓解尿酸钠晶体诱导的痛风性关节炎。目前临床上常用的抗炎镇痛药物秋水仙碱对预防急性痛风性关节炎有一定作用，但是其对肾、肝和胃肠道有一定的毒副作用。蟛蜞菊内酯作为传统中药墨旱莲的活性成分之一，毒副作用较小。蟛蜞菊内酯用于制备应用于治疗MSU晶体激活NLRP3炎症小体活化引起的痛风性关节炎，抑制炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，在相关药物尤其是治疗痛风性关节炎的药物的开发具有很好的应用前景。节炎的药物的开发具有很好的应用前景。节炎的药物的开发具有很好的应用前景。
技术研发人员：潘浩 林雨晴 罗甜裕 周小艺 秦敏燕
受保护的技术使用者：东莞广州中医药大学研究院
技术研发日：2022.09.15
技术公布日：2022/12/5
