本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株特基拉芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
大豆是一种营养价值较高的草本植物，适应性较强，是全世界最重要的农作物，也是全球的五大作物之一，在农业生产中和社会发展中发挥着十分重要的作用。大豆病害是影响大豆种植和产量的主要因素之一。近些年来，气候条件、土壤条件对大豆病害的发生和蔓延十分有利，大豆种植时存在重茬更会增加大豆病害的发病几率。有效的大豆病害防治方法对于提高大豆产量和农业生产效益具有重要意义。
在植物病害中，70％～80％是由病原真菌侵染所致，植物真菌病害不仅直接造成农作物产量与品质降低，而且部分病原真菌在侵染农作物过程中，还可分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢物，对农产品的安全性构成极大威胁。大豆真菌病害种类多、分布广、危害大，各种病害从症状上难以区分，并且常常是几种病害同时发生或混合发生，导致防治困难。大豆常见的病害主要有大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)引起的炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病、灰斑病等地上部病害，以及尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)中的一种或两种与其它不同种类镰刀菌复合侵染引起的根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病等土传病害。
大豆炭疽病是世界上各大豆产区的重要病害之一，其病原菌主要危害豆荚、豆秆和幼苗，造成幼苗死亡、莲秆枯死以及豆荚干枯不结粒。使用化学药剂是目前防治大豆炭疽病的主要途径和常规措施。大豆叶部斑点病的病原菌主要是作为蠕形分生孢子真菌之一的嘴突凸脐蠕孢，该菌引起的病害的研究报道的并不多。从不同寄主植物上分离到的嘴突凸脐蠕孢因生长环境的不同而存在生物学上的某些差异。嘴突凸脐蠕孢病菌侵染大豆的叶片，影响其光合作用，降低产量。大豆黑斑病主要危害叶片和豆荚。叶片染病，病斑不规则形，直径5～10mm，褐色，具同心轮纹，上生黑霉，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。荚上生圆形或不规则形黑斑，其上密生黑色霉菌，荚皮破裂后侵染豆粒。大豆灰斑病又称斑点病，是世界性病害，该病主要危害叶片，严重发病时几乎所有叶片长满病斑，造成叶片过早脱落，受害减产20％～30％。近年来由于大豆重茬、迎茬面积增加，使灰斑病愈来愈重。大豆灰斑病在冷凉或湿度较大的环境下易发病，它也侵染大豆的茎、荚和种子。感病的大豆种子蛋白质含量降低1.2％，脂肪含量降低2.9％，出苗率也降低。
大豆黑点病危害大豆的荚、茎秆。茎部染病，初为褐色，最后变为灰白色，后期病部生纵行排列小黑点，田间易于识别；豆荚染病，初生近圆形褐色斑，后变灰白色干枯而死，其上也生小黑点(载孢子)，剥开病荚，里层生白色菌丝，豆粒表面密生灰白色菌丝，豆粒呈苍白色萎缩，失去发芽能力。
根部病害是危害豆类较多的重要病害之一，普遍发生，尤其在早期发生严重。其对豆类作物的生长及其不利，会造成大面积的减产(一般会造成10％～30％减产，严重时可达50％以上)，更严重时甚至会导致绝产。豆类作物的根部病害主要由多种病原真菌引起，其危害重、分布广、病原种类较多，并且难于防治，是一种世界性的病害。
镰刀菌属(fusariumspp.)是大豆植株土传病害的主要病原菌之一，可分成不同镰刀菌种类。一种或多种镰刀菌种类复合侵染常常导致不同种类的土传病害，以根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病为代表。大豆苗期开始发病，影响幼苗生长甚至造成死苗。这类病害预防的关键时期在播种期和苗期，苗期抵抗力弱，病菌容易侵染。不同种类的镰刀菌常常混合侵染。镰刀菌不但引起根部病害，在大豆整个生育期均可致病，并引发不同程度的发病症状。苗期适合大豆萌发生长，环境条件也适合病菌萌发生长，如果不尽早预防，病害一旦发展蔓延将造成缺苗断垄。患病植株往往根茎萎缩，上部叶片皱缩呈烧焦状，中下部叶片边缘或全部黄化，严重时叶片干枯，过早凋落。结荚期为发病高峰期，由于地下部分养分供应困难，结荚减少，籽粒干瘪，严重影响经济效益。镰刀菌也可侵染人类、动物并引发人畜病害。镰刀菌的次生代谢产物(如毒性很强的镰刀菌毒素)，可污染人类食品及畜禽饲料。此外，有些菌株产生的单端孢霉烯和聚酮类的伏马毒素萜类次生代谢产物，对人畜的健康威胁极大，甚至引起死亡。
大豆根腐病分布广、危害重，是防治较为困难的世界性病害。根腐病在大豆整个生育期均可发生并造成危害，主要症状是茎基部出现黑褐色病斑，并向上不同程度扩散至下部侧枝，使病茎髓部变褐，叶柄基部缢缩，叶片下垂，但不脱落。病重时根系开裂，植株的地上部叶片由下而上逐渐发黄，感病植株矮化，比正常植株矮；花期和荚期为发病高峰期，根系腐烂，田间出现大量黄叶，病株矮化，结荚少，籽粒小，产量低。症状在大豆整个生育期均可发病，田间发生往往呈锅底坑状分布。其造成的产量损失一般在10％～30％，严重的可达50％～60％，甚至绝产，严重威胁大豆生产和品质。引起大豆根腐病的病原菌种类繁多，包括种群复杂的镰孢菌(fusariumsp.)等。
大豆立枯病俗称“死棵”、“猝倒”、“黑根病”，仅在苗期发生，幼苗和幼株主根及近地面茎基部出现红褐色稍凹陷的病斑，皮层开裂呈溃疡状，病菌的菌丝最初无色，以后逐渐变为褐色。病害严重时，外形矮小，生育迟缓，靠地面的茎赤褐色，皮层开裂，呈溃疡状。该病害发生时，轻病田死株率在5％～10％，重病田死株率达30％以上，个别田块甚至全部死光，造成绝产。
大豆茎腐病是大豆的主要病害之一，主要危害大豆的茎部。染病植株茎基部缢缩，变褐，导致上部萎蔫。潮湿时病部表面生有稀疏的白色霉状物，引起腐烂。天气干燥时，病斑变为褐色，叶片干枯，表面有小黑点，造成大豆产量降低。
大豆枯萎病又称萎蔫病、黄叶病，是一种分布较广、危害较重、防治困难的世界性土传病害。近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆枯萎病的发生呈扩大蔓延、危害加重。大豆枯萎病在整个生育期均可侵染大豆，该病害的典型症状是引起植株萎蔫。大豆被侵染后从根尖幵始发病，初呈水浸状，后变褐色，导致病株根及茎基部产生椭圆形褐色长条形至不规则形四陷斑，后扩展成环绕主根的大斑块，有的危害侧根。有时根中下部维管束变为淡褐色，然后逐渐扩大，使根部表皮或皮层变黑腐烂，严重时导致主根下半部全部变褐腐烂。在潮湿环境下，病部表面也常出现白色或粉红色的霉层。大豆发病之后，病株表现为叶片从下向上逐渐萎蔫，似缺水状。该症状中午最为明显，早晚均能恢复正常。数日后，整株叶片枯萎下垂，不再恢复常态，植株萎蔫，田间出现大量黄叶，病株矮化，轻者可继续生长，发病早或严重时，常使植株矮化，结荚少。
目前，为了对豆类作物病害进行有效的防治，常常使用化学农药。虽然化学农药的使用能够有效防治致病菌对作物的危害，但是其毒力大、残留严重、会使病菌产生抗性，对人的身体健康产生危害，对周围环境造成破坏。生物防治避免了化学农药带来的一系列环境问题，而且安全、有效和持久，已经发展成为植物防治中十分重要且日益得到重视的有效措施。生物防治是利用自然界中一些微生物对病原菌的抗生作用、营养和空间竞争、重寄生作用以及微生物诱导植物产生系统抗性等作用，降低病原菌数量或减弱病原菌致病活力，减少病原菌所致病害的发生。自然界中微生物种类繁多，寻找和探索可用于生物防治的有益微生物具有实用价值和重要意义。
在农业生产上常用的生防菌种类有真菌、细菌和放线菌，其中生防真菌包括木霉菌等，生防细菌包括芽孢杆菌等，生防放线菌包括链霉菌属和小单孢菌属。目前已商品化的生防菌包括“百抗”、、“蔬得康”、“宁盾”、“使命”＇mb1600、fzb24、qst713、gbo3等，其中gbo3和mb1600主要用于曲霉、镰刀菌和丝核菌引起的豆类、麦类和棉花的根部病害。枯草芽孢杆菌菌株b29对黄瓜枯萎病拮抗效果明显，防效为54.7％～80.6％。番茄植株根部获得的特基拉芽孢杆菌wm031，防治西瓜枯萎病防效为76.7％。芽孢杆菌(bacillusspp.)菌株7a1以及多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)菌株7f1可有效抑制禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)的生长。从大豆根际土壤中分离获得的芽孢杆菌菌株bh1对病原尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)引起的大豆根腐病防效为56.1％。芽孢杆菌bh1对尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的田间防效为56.1％，温室条件下，采用108cfu/ml培养液对种子进行包衣处理，as818和as929菌株对由尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的防效分别为77.0％和81.4％。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)8-32对于由尖孢镰刀菌引起的根腐病的防效为20.63％～32.08％。
目前，现有生防菌仍存在抗菌谱较窄、防效较低、定殖和增殖能力低的问题，筛选有效的生防菌对于防治种类繁多并不断进化的植物病菌具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一株具有高效和广谱的抗植物病菌作用的特基拉芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一株特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a，该菌株于2020年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为特基拉芽孢杆菌bacillustequilensis，保藏编号为cgmccno.19446。
本发明提供的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，显微镜下观察呈淡绿色，无鞭毛，两端钝圆，产生椭圆形芽孢；其菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干燥有褶皱。
特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a的16srdna基因序列如seqidno.1所示。特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a的gyrb基因序列如seqidno.6所示。
本发明提供一种发酵产物，其由所述特基拉芽孢杆菌2_2a经发酵培养产生。所述发酵产物能够具有抗植物病菌的作用。
本发明所述发酵产物包含特基拉芽孢杆菌2_2a的胞外代谢产物。所述发酵产物可采用本领域常规技术手段制备得到，例如：将特基拉芽孢杆菌2_2a进行发酵培养，将发酵液离心后收集上清液可得。
本发明提供一种菌剂，其包含所述特基拉芽孢杆菌2_2a、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种。
本发明所述菌剂的活性成分可包含所述特基拉芽孢杆菌2_2a、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种，还可包含其他具有抗植物病菌作用的微生物或活性成分；或者，本发明所述菌剂的活性成分由选自特基拉芽孢杆菌2_2a、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种组成。
本发明所述菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂(例如：粉剂)，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
特基拉芽孢杆菌2_2a可在含有酵母粉、蛋白胨等常用的碳氮源的培养基(例如：lb培养基)中生长，其适宜的培养温度为25～35℃、ph为7.0～7.2。
本发明提供所述发酵产物或所述菌剂的制备方法，包括：将所述特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a在25～35℃、ph为7.0～7.2、通气条件下进行发酵培养。
作为本发明的一种实施方式，所述发酵产物或所述菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：将特基拉芽孢杆菌2_2a接种至lb固体培养基上，30℃连续划线培养，挑取单菌落于lb液体培养基中，于25～35℃，180～220rpm摇床振荡培养12～48h；
(2)种子培养：向含有种子培养基的发酵罐中，按照体积比1:9的接种量接种步骤(1)得到的活化菌液，于25～35℃，振荡培养16～24h，得到液体种子；
(3)发酵培养：按体积比10～20％的接种量向种子培养基中接种步骤(2)得到的液体种子，于30～35℃，180～220rpm摇床振荡下培养20～24h，得到活菌体培养物。
采用离心或过滤等方法去除上述步骤(3)得到的活菌体培养物的菌体得到所述发酵产物。
将上述步骤(3)得到活菌体培养物调节至菌含量为109～1010cfu/ml得到液体菌剂，或加入辅料得到液体菌剂。
将上述步骤(3)得到活菌体培养物用碳酸钙吸附，得到含有特基拉芽孢杆菌2_2a的粉剂。
本发明通过实验证明，特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a对于大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)等植物病菌具有高效的抑制作用，对于大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)引起的炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病、灰斑病等地上部病害以及尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和/或木贼镰刀菌(fusariumequiseti)与其它不同种类镰刀菌复合侵染引起的根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病等地下土传病害均具有较高的防效。
本发明提供特基拉芽孢杆菌2_2a或其发酵产物或包含特基拉芽孢杆菌2_2a的菌剂在植物病害防治中的应用。
本发明提供特基拉芽孢杆菌2_2a在选育用于防治植物病害的微生物中的应用。
上述应用可为将特基拉芽孢杆菌2_2a通过诱变、遗传改造等选育用于防治植物病害的微生物。
本发明所述植物病害具体为地下土传病害或地上病害。
优选地，所述地上病害为选自炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病和灰斑病中的一种或多种；所述地下土传病害为选自根腐病、立枯病、茎腐病和枯萎病中的一种或多种。
本发明提供特基拉芽孢杆菌2_2a或其发酵产物或包含特基拉芽孢杆菌2_2a的菌剂在抗植物病菌中的应用。
优选地，所述植物病菌为选自大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和木贼镰刀菌(fusariumequiseti)中的一种或多种。
本发明提供一种防治植物病害的方法，包括：将特基拉芽孢杆菌2_2a或其发酵产物或包含特基拉芽孢杆菌2_2a的菌剂施用于所述植物。
优选地，灌根施用时，所述特基拉芽孢杆菌2_2a的用量为每株1.0×107cfu～2.0×109cfu；喷雾施用时，所述特基拉芽孢杆菌2_2a的的用量为每亩1.5×109cfu～3.0×1011cfu。
具体地，用于防治地上病害时，在植株地上部病害零星发病时，以浓度为105～107cfu/ml的特基拉芽孢杆菌2_2a菌液喷雾，15～30l/亩。用于防治地下土传病害时，在植物苗长至4～7叶时，以浓度为105～107cfu/ml的特基拉芽孢杆菌2_2a菌液灌根，100～200mlml/株。
本发明所述植物为双子叶植物或单子叶植物，包括但不限于大豆、水稻、小麦、玉米、棉花、大麦、燕麦、黑麦、谷子、高粱、烟草、青稞、向日葵、油菜、苜蓿、粟、甘蔗、番茄、木薯、马铃薯、白菜、甘蓝、黄瓜、拟南芥等。优选为大豆。
本发明的有益效果在于：本发明从大豆叶片中筛选分离获得特基拉芽孢杆菌2_2a，该菌株具有如下优势：
(1)对于植物病菌的抑菌谱广：特基拉芽孢杆菌2_2a对大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)等病原菌均有很好的抑制作用，抑菌率高达80.25％～91.25％；
(2)特基拉芽孢杆菌2_2a可快速、稳定地定殖于植物植株中，在植物植株中的繁殖速度快、增殖能力强；
(3)对于多种植物病害具有兼治作用且防效高：特基拉芽孢杆菌2_2a对大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)引起的炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病、灰斑病等地上部病害的防效高，平均防效在90.0％以上；对尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)中的一种或两种与其它不同种类镰刀菌复合侵染引起的根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病等土传病害也具有较高的防效，平均防效也在90.0％以上。
(4)利用特基拉芽孢杆菌2_2a防治植物病害不易产生抗药性，药效持久性好；
(5)利用特基拉芽孢杆菌2_2a防治植物病害对人、畜安全，不会造成环境污染；
(6)特基拉芽孢杆菌2_2a菌剂的制备方法简单、成本低、使用简便。
特基拉芽孢杆菌2_2a及其菌剂在植物病害防治中具有很好的应用前景，为开发高效广谱的生防制剂奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中液体培养状态下特基拉芽孢杆菌2_2a现制切片在10×40倍油镜下的菌体形态观察结果图。
图2为本发明实施例1中根据16srdna序列获得的特基拉芽孢杆菌2_2a菌株的系统发育树。
图3为本发明实施例1中根据gyrb基因序列获得的特基拉芽孢杆菌2_2a菌株的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
下述实施例涉及的培养基配方具体如下：
lb固体培养基(菌种保藏培养基)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水至1l，ph7.0-7.5。
lb培养液(菌种活化培养基)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1l，ph7.0-7.5。
种子培养基(液体，1l)：k2hpo44.8g，kh2po43.5g，(nh4)2so42g，mgcl20.16g，cacl20.02g，na2moo4·2h2o0.0024g，fecl30.0018g，mncl2·2h2o0.0015g，ph＝7.0。
以上培养基均在121℃灭菌15～30min。
lb平板：配制100ml上述lb固体培养基，高压灭菌后，将融化的lb固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时倒板，10mllb固体培养基倒入一个灭菌培养皿中，打开盖子，紫外灯下照10～15分钟，冷却后用封口膜密封并倒置放于4℃冰箱中，备用。
绿豆汤培养基：300g绿豆于水中煮沸10分钟，用4层纱布过滤去渣后，定容至1000ml，高压121℃灭菌20min。
pda平板：马铃薯去皮200g切成小块放入锅中，加入1000ml水，加热煮沸持续20-30min，4层纱布趁热过滤去渣，加入20g琼脂粉，待琼脂融化，加入20g葡萄糖，加水补足1000ml，在121℃灭菌15～30min后，取出冷却至55℃，每10ml培养基倒入一个灭菌培养皿中，打开盖子，在紫外灯下照10-15分钟，冷却后用封口膜密封并倒置放于4℃冰箱中备用。
下述实施例中使用的病原菌菌株分别为：链格孢(alternariaalternata)(cgmccno.3.15526)、草茎点霉(phomaherbarum)(cgmccno.3.15379)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)(cgmccno.3.15353)，均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；灰斑病菌(cercosporasojina)(bnccno.111395)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)(bnccno.228128)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)(bnccno.299173)，均购于北京北纳创联生物技术研究院；大豆炭疽菌(colletotrichumchlorophyti)(大豆炭疽病菌colletotrichumchlorophyti的鉴定，李海云等，植物保护，2017，43(2):163-166.)，由河北出入境检验检疫京唐港办事处提供。
下述实施例中使用的大豆种子为黑农53(土传病害易感)、豫豆2号(炭疽病易感)、东豆339(灰斑病易感)、陇中黄601(黑斑病易感)、合丰25(叶部斑点病易感)、冀豆16(大豆黑点病中感)，均购于河北省保定市种苗科技有限公司。
实施例1特基拉芽孢杆菌2_2a的获得及鉴定
1、特基拉芽孢杆菌2_2a菌株的筛选及分离
(1)样品采集：采集河北省沧州市农业科学院基地大豆植株的新鲜叶片，用无菌水将其表面附带灰尘冲洗干净，然后将植株叶片进行表面消毒(依次用75％酒精浸泡1min和8％naclo浸泡4min进行表面消毒处理)，无菌水洗4次；
(2)分离筛选：将叶片切成1cm×1cm碎片，加水磨至糊状，静置10min后涂布lb平板，均放置于30℃培养48h；
(3)纯化：待有培养物长出后，采用平板划线分离法纯化，挑取在最高浓度下生长的菌落在富集培养基上划线，直到分离获得纯培养物。
以大豆主要地上和土传病害为靶标，通过平板对峙法、田间小区试验法进行生防菌的筛选。最终筛选出一株对大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)引起的炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、大豆黑点病、灰斑病等地上部病害以及尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)中的一种或两种与其它不同种类镰刀菌复合侵染引起的根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病等土传病害均具有良好防治效果的菌株，命名为2_2a。
2、菌株2_2a的分类鉴定
(1)形态特征鉴定
在lb培养基上培养菌体为杆状，革兰氏阳性，显微观察呈淡绿色，无鞭毛，两端钝圆，产生椭圆形芽孢(图1)；其菌落呈乳白色，边缘不规则，表面干燥有褶皱。在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形。在液体培养基中静止培养，液体不透明乳白。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断2_2a菌株属于芽孢杆菌。
(2)利用16srdna序列鉴定分类
以2_2a的基因组dna为模板，以通用引物f27和r1492为引物进行pcr扩增，得pcr扩增产物，引物f27和r1492序列如下：
27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.2)；
r1492:5’-ggttaccttgttacgactt-3’(seqidno.3)。
16srdna的pcr反应体系(20μl)为：10×extaqbuffer2.0μl；5uextaq0.2μl；2.5mmdntpmix1.6μl；27f1μl；1492r1μl；2_2a基因组dna0.5μl；ddh2o补足至20μl。
pcr的反应条件为95℃、5min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、1.5min，25个循环；72℃、10min。将所得pcr扩增产物进行凝胶电泳，送交上海美吉生物工程有限公司测序，得2_2a的16srdna序列(如seqidno.1所示)。
菌株2_2a的16srdna序列利用mega软件(molecularevolutionarygeneticsanalysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树系统发育分析图如图2所示，在genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16srdna基因序列进行比较，结果表明，该菌株的16srdna与特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)的相似性最高，可以达到97.5％以上。
(3)根据gyrb基因序列鉴定分类
以菌株2_2a基因组dna为模板，利用芽孢杆菌gyrb基因兼并引物gyrb-f和gyrb-r为引物进行pcr扩增，得pcr扩增产物，gyrb-f和gyrb-r引物的序列如下：
gyrb-f:5’-ttgrcgghrgygghtataaagt-3’(seqidno.4)；
gyrb-r:5’-tccdccstcagartcwccctc-3’(seqidno.5)。
以上y代表c/t，r代表a/g，h代表a/t/c，w代表a/t，d代表g/a/t，s代表g/c。
gyrb的pcr扩增反应体系(50μl)为：10×pcrbuffer(mg2 )5μl；dntp混合液(2.5mm)5μl；taq(5u/μl)1μl；gyrb-f(10μmol/l)1μl；gyrb-r(10μmol/l)1μl；2_2a基因组dna50ng；ddh2o补足至50μl。
pcr的反应条件为95℃、5min；95℃、30s，55℃、45s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得2_2a菌株的gyrb基因序列(如seqidno.6所示)。将获得的2_2a菌株的gyrb基因序列在genbank中进行同源性比较，结果发现2_2a与特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)的gyrb基因序列同源性最高，达到95.5％。同时利用mega软件(molecularevolutionarygeneticsanalysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(图3)，结果表明，2_2a菌株与特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)聚合到一起，说明2_2a为特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)。
综合以上形态特征、16srdna和gyrb基因序列同源性对比分析的结果，可知2_2a属于特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)，并且与现有的特基拉芽孢杆菌菌株均不同，是一株新的特基拉芽孢杆菌菌株。
特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a于2020年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为特基拉芽孢杆菌bacillustequilensis，保藏编号为cgmccno.19446。
实施例2特基拉芽孢杆菌2_2a菌液和菌剂的制备
(1)菌种活化：挑取特基拉芽孢杆菌2_2a菌株至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，180r/min摇床振荡培养24h；
(2)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照10％(v/v)的接种量接种步骤(1)得到的2_2a活化菌液，于30℃，通空气培养18h，得到液体种子；
(3)液态发酵：向装有高温灭菌的种子培养基中，按照体积分数10％的接种量接种液体种子，于30℃，180r/min下培养24h(对数生长期)，得到活菌体培养物；
(4)菌剂制备：取活菌体培养物于4℃、5000r/min离心15min，取菌体沉淀用0.85％的无菌生理盐水冲洗3次，加入适量种子培养基调节菌含量至109cfu/ml，即得2_2a菌液；加入甘油(体积分数50％)，灌装保藏。
实施例3特基拉芽孢杆菌2_2a的抑菌作用
本实施例分析特基拉芽孢杆菌2_2a对大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和木贼镰刀菌(fusariumequiseti)的抑制作用，具体方法如下：
(1)将大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和木贼镰刀菌(fusariumequiseti)病菌分别接种于pda平板上，25℃分别培养长满平板后，用直径5mm的打孔器制成菌饼，将菌饼接种于pda平板中央，同时在距中心30mm左右的四个角点上点接2_2a菌液(浓度108cfu/ml，20μl)，以实施例2制备的2_2a菌液作为实验组，同时以仅接种病原真菌的平板作为对照组，每个处理设置3个重复；
(2)将步骤(1)接种后的pda平板置于25℃环境中培养，大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)培养7d，尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)培养3d。对照组病原真菌菌落接近长满平板，测量病原真菌菌落直径，并按如下公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝[(a-b)/(a-5)]×100％，其中，a为对照组病原真菌菌落直径，b为实验组病原真菌菌落直径。
(3)抑菌结果：结果如表1所示，菌株2_2a对大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)的抑制作用的抑菌率为80.25％～91.25％，表明特基拉芽孢杆菌2_2a对大豆的以上主要病原菌均具有很好的抑制作用。
表1菌株2_2a对大豆炭疽病菌、嘴突凸脐蠕孢、链格孢、草茎点霉、灰斑病菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌的抑菌作用
注：表1的实验结果为3个重复的平均值。
实施例4特基拉芽孢杆菌2_2a防治大豆地上病害的小区田间试验本实施例提供特基拉芽孢杆菌2_2a防治大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)引起的大豆炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、大豆黑点病、灰斑病的小区田间试验，具体方法如下：
(1)于2019年5月18日将大豆按不同品种分区播种，不同药剂处理随机排列，各设置3次重复。每小区面积2×3米，行距1.2尺，株距0.8尺。每小区采用喷雾法接病菌分别接种大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)，接菌量为1×106cfu/ml菌液500毫升，接病菌后1小时喷药。药剂处理：(1)微生物菌剂组(2_2a)：将实施例2制备的特基拉芽孢杆菌2_2a液体菌剂用水稀释500倍至菌体浓度为2×106cfu/ml；(2)化学杀菌剂组(苯醚甲环唑)10％苯醚甲环唑水分散粒剂(世高)用水稀释1000倍；(3)空白对照组：清水。分别于7月16日和26日喷药两次，使用药液量20l/亩，喷药后20天调查发病情况。每一小区调查20-30株，计算各处理病情指数和防治效果。
(2)地上主要病害防治结果：结果如表2所示，特基拉芽孢杆菌2_2a对大豆炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病、灰斑病的防效为91.61％～95.95％，其防治效果高于化学杀菌剂苯醚甲环唑或与其相当。表明特基拉芽孢杆菌2_2a及其微生物菌剂对大豆地上主要病原害具很好的防治效果。
表2菌株2_2a防治大豆炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病、灰斑病的小区田间试验结果
注：表2的实验结果为3个重复的平均值；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。
实施例5特基拉芽孢杆菌2_2a防治大豆土传病害的小区田间试验
本实施例提供特基拉芽孢杆菌2_2a防治尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、木贼镰刀菌(fusariumequiseti)中的一种或两种与其它不同种类镰刀菌复合侵染引起的大豆根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病的小区田间试验，具体方法如下：
(1)将大豆种子按照间距30-50cm的距离分别播种到常年有土传病害大豆根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病发生的不同病害重茬地块，田间小区试验在河北省农林科学院植物保护研究所农场试验区进行。每种病害地块试验设3个处理，各处理组的处理剂如下：化学杀菌剂组(多菌灵)：多菌灵(50％多菌灵可湿性粉剂用水稀释800倍液)；微生物菌剂组(2_2a)：实施例2制备的2_2a液体菌剂(用水稀释500倍至菌体浓度为2×106cfu/ml)；对照组(空白对照)：空白培养液(即灭菌后的种子培养基)。每个处理30株大豆苗，设置3次重复。待大豆苗长出4-7片叶子时，每个处理分别在大豆苗根部浇灌200ml处理剂。20d后调查发病情况(叶片或茎蔓萎蔫面积超过整株的1/4时)，计算发病率和防效。
(2)地下主要土传病害防治结果：结果如表3所示，特基拉芽孢杆菌2_2a对大豆根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病的防效为90.91％～100.00％，其防治效果高于化学杀菌剂多菌灵或与其相当，表明特基拉芽孢杆菌2_2a及其微生物菌剂对大豆主要土传病原害具有很好的防治效果。
表3菌株2_2a防治大豆根腐病、立枯病、茎腐病、枯萎病的小区田间试验结果
注：表3的实验结果为3个重复的平均值；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。
实施例6特基拉芽孢杆菌2_2a在大豆中的定殖和增殖能力检测
本实施例对特基拉芽孢杆菌2_2a以灌根和喷施方式施用时在大豆根部和叶片定殖的速度和增殖数量进行检测，具体方法如下：
随机选取实施例4的喷雾施用试验中所用大豆品种2个以及实施例5的灌根施用试验中所用大豆品种1个，分别于施用特基拉芽孢杆菌2_2a后的24h～168h内不同时间点取样。
对叶片及根部进行表面消毒处理，用75％酒精漂洗1min后，用1％次氯酸钠浸泡2min，再用无菌水清洗4次，将最后1次无菌水冲洗液100μl涂布于lb培养基上，30℃培养24h，检验消毒效果，显微观测是否产生杂菌。然后吸干表面水后用2ml无菌水研磨至浆糊状，静置15min使组织内细菌充分释放出来，稀释1000倍后，取100μl涂布于含利福平的lb培养基上，30℃培养24h。根据每皿中的菌落数量，计算每克鲜叶片及根部中所含的菌量。
特基拉芽孢杆菌2_2a定殖速度和数量的检测结果如表4所示：特基拉芽孢杆菌2_2a的定殖和增殖能力均较强，能够在24h较快定殖占据大豆叶片和根部，叶内最高增殖量可达3694.18×106cfu/g，根内最高增殖量可达3965.14×107cfu/g；2_2a的快速定殖和增殖减少了病原菌在叶片和根部的占位空间，从而充分发挥了特基拉芽孢杆菌2_2a的空间竞争作用。
表4特基拉芽孢杆菌2_2a在叶内和根内的定殖
注：表4的实验结果为3个重复的平均值；±为3个重复的标准偏差；肩标为不同字母的数据存在显著性差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>河北省农林科学院植物保护研究所
<120>一株特基拉芽孢杆菌及其应用
<130>khp201110731.6
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1465
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ccacaggcatctctgctcaccttcggcggctggctcctaaaggttacctcaccgacttcg60
ggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcac120
gcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctt180
cgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagact240
tgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgt300
catccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgct360
ggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacga420
gctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctag480
gattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccaca540
tgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtac600
tccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaaca660
cttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccac720
gctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctc780
cacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaag840
ttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagg900
aaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtatta960
ccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccgc1020
cctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttca1080
tcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctg1140
cctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtc1200
ggctacgcatcgttgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatgcgccgcgggt1260
atccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgt1320
ccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtttgaaccatgcggttcaaacaagc1380
gttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgactgc1440
atgtatagcacgccgaatcgcgctt1465
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
agagtttgatcctggctcag20
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ggttaccttgttacgactt19
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ttgrcgghrgygghtataaagt22
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tccdccstcagartcwccctc21
<210>6
<211>1452
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggga60
agcagtcgcgtgctatacatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtta120
cggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcac180
aaccggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggctt240
caaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300
gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360
gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaaga420
acaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480
ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcg540
taaagggctcgcaggcggttccttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggag600
ggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcg660
gtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaac720
tgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgc780
cgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgca840
ttaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggg900
cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960
cttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggt1020
ggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080
aacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140
accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacac1200
ctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaa1260
gtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaat1320
ccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaa1380
tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca1440
ggtgacaaaggg1452
1.特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.19446。
2.一种发酵产物，其特征在于，其由权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a经发酵培养产生。
3.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a、其发酵培养物、其发酵产物中的一种或多种。
4.权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括：将所述特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a在25～35℃、ph为7.0～7.2、通气条件下进行发酵培养。
5.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在植物病害防治中的应用。
6.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a在选育用于防治植物病害的微生物中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物病害为地下土传病害或地上病害；
优选地，所述地上病害为选自炭疽病、叶部斑点病、黑斑病、黑点病和灰斑病中的一种或多种；所述地下土传病害为选自根腐病、立枯病、茎腐病和枯萎病中的一种或多种。
8.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂在抗植物病菌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物病菌为选自大豆炭疽病菌(colletotrichumchlorophyti)、嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)、链格孢(alternariaalternata)、草茎点霉(phomaherbarum)、灰斑病菌(cercosporasojina)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和木贼镰刀菌(fusariumequiseti)中的一种或多种。
10.一种防治植物病害的方法，其特征在于，将权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a或权利要求2所述的发酵产物或权利要求3所述的菌剂施用于所述植物；
优选地，灌根施用时，所述特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a的用量为每株1.0×107cfu～2.0×109cfu；
喷雾施用时，所述特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)2_2a的的用量为每亩1.5×109cfu～3.0×1011cfu。
技术总结