本发明涉及化妆品
技术领域：
，特别是涉及一种具有美白、保湿功能的无刺激组合物及其制备方法。
背景技术：
：白子菜(gynuradivaricatadc)为菊科土三七属植物，又名白背三七、降糖草等，被广泛地用于治疗高血脂、糖尿病，例如可参见中国发明专利申请cn102631391a、cn104644734a和cn110279873a。目前应用最多的是白子菜的地上部分，白子菜的地上部分提取物含有许多组分，已知的白子菜的地上部分提取物的化学组分主要含有生物碱类、黄酮类、三萜类、甾醇类、核苷类、酚酸类和酯类等。有学者对白子菜不同药用部位挥发油含量进行了分析，鉴别出多种化学成分，其中根、茎和叶部位的挥发油中石竹烯、大叶香烯d等的含量最高。目前，有发明人尝试将白子菜的醇提物与牡丹花蕊黄酮、枇杷叶黄酮、珍珠粉、鳄梨树油和淘米水形成一种防衰老面膜(cn108703936a)，然而，该抗衰老功能是各组分协同达到的效果，白子菜醇提取物在其中代表着怎样的生物活性无法确定，目前，亦未见将白子菜相关提取物用于美白的用途。绞股蓝为多年生落叶草质藤本绞股蓝属植物，现代药理证明，绞股蓝的主要药效成分为绞股蓝皂苷，其具有防衰老、降血脂、抑制肿瘤、增强免疫、降血糖及抗炎等药理作用，目前在治疗气管炎、传染性肝炎、劳肌虚损及防治内分泌、消耗系统疾病等方面得到了广泛的应用。在本领域，绞股蓝提取物被应用于制备抗光老化化妆品(cn103191172a)，被应用于作为舒敏活性成分(cn105963188a)，但是作为美白、保湿用途，至今未有报道。技术实现要素：基于此，本发明的目的是提供一种具有美白、保湿功能的无刺激组合物及其制备方法，通过抑制酪氨酸酶活性达到美白的功效。本发明的发明人在开发新的美白活性成分的过程中，意外发现白子菜水提物和醇提物均表现出较佳的美白活性(0.1mg/ml的提取物酪氨酸酶抑制率均达到50％以上)，尤其是醇提物(0.1mg/ml80％醇提物酪氨酸抑制率为64.48％)。但同时在皮肤刺激性试验中也发现，无论是醇提物和水提物，均对皮肤产生了较大的刺激(醇提物＞水提物)，多次皮肤刺激实验显示，两种提取物刺激强度为中刺激性，且刺激性随着乙醇溶液的增加而增大。因此，白子菜提取物类美白产品开发的难点主要在于如何降低白子菜提取物对皮肤的刺激性。本发明发明人通过大量的试验研究发现，白子菜提取物存在的刺激性可能是因为其中存在的石竹烯，由于石竹烯氧化后对皮肤有较大的刺激性，容易导致过敏，因此对皮肤产生了较大的刺激性。而醇提物中含有比水提物更多的石竹烯，因此刺激性更大。进一步研究发现，石竹烯之所以容易过敏可能是因为石竹烯的双键容易被氧化，而形成的过氧化物性质很不稳定，形成了对皮肤的刺激。针对上述问题，为了降低白子菜醇提物的刺激性，本发明采用黑柄炭角菌对其进行发酵，黑柄炭角菌[xylarianigripes(ki)sacc.]属于囊菌亚门、炭角菌目，炭角菌科，炭角菌属。在发酵中，众所周知菌种的选择至关重要，而黑柄炭角菌相比其他菌种的优势在于：白子菜醇提物经发酵后，刺激性大幅度降低(刺激强度从中刺激性降低到无刺激性)，且赋予了活性物较好的保湿性，这是其他菌种没有的优势。而进一步推测认为，白子菜醇提物刺激性降低的原因可能在于具有增敏性质的石竹烯在发酵过程中，最终形成了性质更加稳定、低致敏性的氧化产物，或者是黑柄炭角菌在复杂的发酵过程中产生了对抗白子菜提物刺激性的物质，最终使得活性物对皮肤的刺激性大大降低，而由于实验发现采用裂褶菌发酵并无较大降低刺激的作用，推测这种降低作用大概率与菌种种类有关，因此黑柄炭角菌降低白子菜醇提物刺激性的缘由更大概率是后者。目前未见采用黑柄炭角菌进行发酵白子菜醇提物的例子。本发明就是在上述背景下作出的，具体技术方案如下：一种具有美白、保湿功能的无刺激组合物，作为有效成分，该组合物含有白子菜活性物。进一步地，所述白子菜活性物的制备方法为：s1、白子菜醇提物制备：取白子菜的根或茎为原料，洗净，粉碎，以65～85％浓度的乙醇溶液为提取溶剂，料液比为1:5～10，经加热回流法，除去乙醇后经浓缩制备得醇提物；s2、发酵：以接种量为10％将经二级培养的黑柄炭角菌接种到30l发酵罐中，往发酵罐中添加上述醇提物，在25℃～30℃下发酵40～80h，得发酵滤液；s3、取所述发酵滤液，经超滤膜过滤，即得所述无刺激性的活性物。进一步地，所述步骤s1中，所述乙醇溶液的浓度为80％；和/或所述料液比为1:8；和/或所述提取温度为60～85℃；和/或所述粉碎是指将白子菜的根或茎粉碎成粒度为30～60目的粉末。进一步地，所述步骤s1中，所述提取温度为70℃；和/或将白子菜的根或茎粉碎成粒度为40目的粉末。进一步地，所述步骤s2发酵过程中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖60～80g/l、蛋白胨5～10g/l、柠檬酸1～3g/l、硫酸镁1～3mg/l和硫酸锌1～2mg/l，ph为5.0～6.0。进一步地，所述步骤s2中白子菜醇提物的加入量为1～15％。进一步地，所述步骤s2中发酵温度为25℃，发酵时间为60h，搅拌速度为100～200rpm，通气量为1～4vvm，罐压为0.03～0.05mpa。虽然经黑柄炭角菌发酵后白子菜的刺激性得到了较大程度的解决，该活性物对皮肤的刺激性大幅降低，但是其美白活性仍有提升的空间(0.1mg/ml活性物a对酪氨酸酶的抑制率为69.27％)。为了进一步提高白子菜活性物的美白活性，本发明的发明人尝试加入常规美白功能的成分配合，如维生素c、熊果苷等，但是发现存着以下情况：加入某些常规美白成分可以提高总体组合物的美白活性，但是效果不显著；而有些虽然可以较大幅度提高组合物的美白活性，但是同时发现，增加了组合物的刺激性(如烟酰胺)。因此，如何在提高白子菜活性物的美白活性的同时不增加组合物的刺激性是比较难的。而经试验发现，绞股蓝皂苷相比其他成分有着比较明显的优势，其能够与活性物发生美白协同作用的同时进一步降低活性物的刺激性(该组合物每天每只动物积分均值从0.36降低至0.04)，这是比较令人意外的。进一步地，作为有效成分，还含有绞股蓝皂苷，所述白子菜活性物与所述绞股蓝皂苷的重量比为1:0.01～1。进一步地，所述白子菜活性物与所述绞股蓝皂苷的重量比为1:0.6。本发明还提供了一种具有美白、保湿功能的无刺激化妆品和/或护肤品，其含有所述的无刺激组合物。因此，本发明具有以下有益效果：1)本发明采用黑柄炭角菌发酵白子菜醇提物显著降低了其对皮肤的刺激性，其刺激强度从中刺激性降低至无刺激性，且经过黑柄炭角菌发酵后赋予了活性物较好的保湿性能。2)本发明发现了将绞股蓝皂苷与上述活性物联用存在协同的可能性，当两者组合作用时，不仅显著提高了组合物的美白活性，且进一步降低了组合物的刺激性，可应用于制备无刺激的美白产品。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一、白子菜醇提物的制备取白子菜的根为原料，洗净，粉碎成粒度为40目的粉末，加入粉末总量8倍量的80％浓度的乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1.5h，提取温度为70℃，过滤，合并滤液，减压除去乙醇，浓缩即得。按照上述方法，采用75％和65％浓度的乙醇溶液提取，分别得到75％乙醇提取物和65％乙醇提取物。实施例二、白子菜水提物制备取白子菜的根为原料，洗净，粉碎成粒度为40目的粉末，加入粗粉总量8倍量的温度为80℃的热水浸提2次，每次6h，过滤，合并滤液，浓缩，即得。实施例三、白子菜醇提物和水提物的美白活性及刺激性比较3.1美白活性比较各组样品用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph6.8，0.05mol/l)稀释为多级浓度样品，取各浓度样品于玻璃试管中，分别加入酪氨酸酶溶液；于30℃水浴反应10min，依次往各组玻璃试管中加入左旋多巴溶液，然后于30℃水浴反应10min，475nm下测其od值，实验体系如表1。式中：t为样品管吸光值，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；t0为样品本底吸光值；c为酶反应管吸光值3次平均值，即未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值；c0为溶剂本底吸光值。表1实验体系设计t-样品管t0-样品本底c-dpph管c0-溶剂本底样品液(ml)1.01.0--缓冲液(ml)-0.51.01.5酪氨酸酶酶溶液(ml)0.5-0.5-左旋多巴溶液(ml)2.02.02.02.0表2各样品产生的酪氨酸酶活性抑制结果注：与白子菜80％醇提物组对应浓度相比，*p≤0.05，**p≤0.01。由上表可知，各提取物中白子菜80％醇提物产生的酪氨酸酶抑制作用最强，0.1mg/ml浓度的白子菜80％醇提物酪氨酸酶抑制率为64.48％，显示其具有较好的抑制酪氨酸酶活性的作用，提示白子菜醇提物具有一定的美白功能。而与醇提物相比，水提物对酪氨酸酶的活性抑制能力较弱。3.2皮肤刺激性比较试验动物及环境：新西兰种大白兔，体重2.0～3.0kg，单笼喂养。试验方法：每组取2ml受试样品(浓度为100μg/ml)，保证受试物与皮肤有良好的接触，试验前24h将试验动物背部脊柱两侧背毛剪掉，不损伤表皮，去毛范围3cm×3cm，涂抹面积为2.5×2.5cm，一侧涂受试物，一侧做对照，每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第2天开始，每次涂抹前剪毛，用温水清除残留受试物，1h后观察结果。试验评分：按《化妆品卫生规范》(2007年版)中的多次皮肤刺激性试验方法中的反应评分标准对试验结果进行评分(表3)，按照下列公式结算每天每只动物平均积分，按表4判断皮肤刺激强度，试验结果如下表5所示。表3皮肤刺激反应评分表4皮肤刺激强度分级积分均值强度0～＜0.5无刺激性0.5～＜2.0轻刺激性2.0～＜6.0中刺激性6.0～8.0强刺激性表5多次皮肤刺激性试验结果由上表5可知，白子菜80％醇提物、65％醇提物、75％醇提物和水提物在多次皮肤刺激实验中，每天每只动物积分均值分别为3.88、3.59、3.25和2.18，刺激强度评价为中刺激性，且从结果发现白子菜醇提物对皮肤的刺激性可能随着乙醇浓度的增加而增大。实施例四、菌种类型对活性物美白、刺激性和保湿性能的影响4.1发酵参数确定考察发酵过程中各个参数对活性物相关性能的影响，具体参数设定如下表6所示，按照下表6所示的参数制备发酵活性物。表6发酵参数黑柄炭角菌发酵中采用的培养基组成为：葡萄糖70g/l、蛋白胨6g/l、柠檬酸1.5g/l、硫酸镁1.5mg/l和硫酸锌1.5mg/l，ph为5.5。裂褶菌发酵中采用的培养基组成为：葡萄糖2％，牛肉膏0.3％、nh4cl0.1％、kh2po40.05、mgso40.05％及剩余的蒸馏水。4.2刺激性测试按3.2皮肤刺激实验对活性物a～d的刺激性进行比较，计算14天每只动物积分均值和每天每只动物积分均值，结果如下表7所示。表7各活性物刺激性降低程度结果比较由表7可知，加入两种微生物进行发酵均能降低每天每只动物积分均值，起到降低皮肤刺激的作用；其中加入裂褶菌发酵虽然使得每天每只动物积分均值对比未发酵前有所降低(3.88降至2.54)，但是刺激强度仍属于中刺激性；很明显加入黑柄炭角菌进行发酵对降低皮肤刺激具有更直接的作用，每天每只动物积分均值为0.36～0.48。4.3美白和保湿性能测试按试验3.1试验方法对活性物a～d的美白活性进行测试，结果如下表8所示(只显示浓度为100μg/ml的数据)；采用courage khazakaelectronicgmbh公司的corneometercm825测定活性物a～d的保湿效果进行测试，并设置阳性对照组，按照下式计算皮肤水分含量增长率，结果如下表9所示，考察微生物的类型是否对活性物的美白和保湿性能存在潜在的影响。式中，mmv0为涂抹前皮肤mmv；mmvt为涂抹后t时段皮肤mmv。表8不同微生物发酵后对活性物美白活性的影响结果组别质量浓度(μg/ml)酪氨酸酶抑制率(％)活性物a10069.27±8.13活性物b10063.82±5.30活性物c10062.16±3.52活性物d10064.33±6.94白子菜80％醇提物10064.48±5.42注：与白子菜80％醇提物组相比，*p≤0.05，**p≤0.01。表9不同微生物发酵后对活性物保湿性能的影响注：与白子菜80％醇提物组同时间段相比，*p≤0.05，**p≤0.01。由上表7可看出，黑柄炭角菌发酵白子菜醇提物在降低其刺激性方面具有非常明显的优势，活性物对皮肤的刺激强度从中度刺激变为无刺激，与裂褶菌相比，黑柄炭角菌更利于降低白子菜醇提物对皮肤的刺激。此外，从表8～9可知，经黑柄炭角菌发酵后美白活性均有极小幅度的上升，但是效果不显著，可知发酵对活性物的美白活性贡献不大，主要在降低刺激方面起到较大的作用；同时发现，经黑柄炭角菌发酵后得到的活性物a与白子菜80％醇提物组相比保湿性能显著提升，且存在极显著的差异(**p≤0.01)，这说明，经黑柄炭角菌发酵后赋予了活性物较好的保湿性能。另外，裂褶菌发酵后的活性物保湿性能相比未发酵前亦有显著的上升，这大概是由于裂褶菌发酵会产生裂褶多糖起到了一定的保湿作用。实施例五、配合物筛选试验按试验3.1试验方法和3.2皮肤刺激实验方法分别对下述表10中的组合物h1～h7的美白活性和皮肤刺激性进行检测，考察绞股蓝皂苷是否存在潜在的提高活性物a的美白性能，并且进一步降低其刺激性的能力，检测结果如表11～12所示。表10组合物h1～h7组成及配比组合物组成及配比组合物h1活性物a：绞股蓝皂苷＝1:0.6组合物h2活性物a：绞股蓝皂苷＝1:1组合物h3活性物a：绞股蓝皂苷＝1:0.3组合物h4活性物a：绞股蓝皂苷＝1:0.1组合物h5活性物a：烟酰胺＝1:0.6组合物h6活性物a：熊果苷＝1:0.6组合物h7活性物a：维生素c＝1:0.6表11酪氨酸酶活性抑制结果组别质量浓度(μg/ml)酪氨酸酶抑制率(％)组合物h110096.38±8.62组合物h210093.75±5.24组合物h310095.64±5.51组合物h410090.49±6.13组合物h510091.33±6.77组合物h610074.46±3.80**组合物h710081.82±4.92*活性物a10069.27±8.11**绞股蓝皂苷10030.12±3.46**曲酸100102.41±8.37注：与组合物h1组相比，*p≤0.05，**p≤0.01。表12多次皮肤刺激实验结果受试物每天每只动物积分均值刺激强度组合物h10.04无刺激性组合物h20.07无刺激性组合物h30.05无刺激性组合物h40.11无刺激性组合物h50.86轻刺激性组合物h60.34无刺激性组合物h70.39无刺激性由上表11～12可看出，熊果苷、烟酰胺、维生素c和绞股蓝皂苷作为活性物a的配合物，均能提高活性物a抑制酪氨酸酶的活性，其中，绞股蓝皂苷提高作用最明显，与单一组分相比作用存在极显著的差异，与0.1mg/ml曲酸相比，无显著差异，这说明，该组合物具备优异的美白活性。此外，经分析发现，绞股蓝皂苷除了对美白活性有贡献外，还能进一步降低活性物a的刺激性，而这是其他美白活性成分不具有的优势。甚至发现与烟酰胺联用时，组合物对皮肤的刺激性进一步增大。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所述
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种具有美白、保湿功能的无刺激组合物，其特征在于，作为有效成分，该组合物含有白子菜活性物。
2.如权利要求1所述的无刺激组合物，其特征在于，所述白子菜活性物的制备方法为：
s1、白子菜醇提物制备：取白子菜的根或茎为原料，洗净，粉碎，以65～85％浓度的乙醇溶液为提取溶剂，料液比为1:5～10，经加热回流法，除去乙醇后经浓缩制备得醇提物；
s2、发酵：以接种量为10％将经二级培养的黑柄炭角菌接种到30l发酵罐中，往发酵罐中添加上述醇提物，在25℃～30℃下发酵40～80h，得发酵滤液；
s3、取所述发酵滤液，经超滤膜过滤，即得所述无刺激性的活性物。
3.如权利要求2所述的无刺激组合物，其特征在于，所述步骤s1中，所述乙醇溶液的浓度为80％；和/或所述料液比为1:8；和/或所述提取温度为60～85℃；和/或所述粉碎是指将白子菜的根或茎粉碎成粒度为30～60目的粉末。
4.如权利要求3所述的无刺激组合物，其特征在于，所述步骤s1中，所述提取温度为70℃；和/或将白子菜的根或茎粉碎成粒度为40目的粉末。
5.如权利要求2所述的无刺激组合物，其特征在于，所述步骤s2发酵过程中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖60～80g/l、蛋白胨5～10g/l、柠檬酸1～3g/l、硫酸镁1～3mg/l和硫酸锌1～2mg/l，ph为5.0～6.0。
6.如权利要求2所述的无刺激组合物，其特征在于，所述步骤s2中白子菜醇提物的加入量为1～15％。
7.如权利要求2所述的无刺激组合物，其特征在于，所述步骤s2中发酵温度为25℃，发酵时间为60h，搅拌速度为100～200rpm，通气量为1～4vvm，罐压为0.03～0.05mpa。
8.如权利要求1所述的无刺激组合物，其特征在于，作为有效成分，还含有绞股蓝皂苷，所述白子菜活性物与所述绞股蓝皂苷的重量比为1:0.01～1。
9.如权利要求8所述的无刺激组合物，其特征在于，所述白子菜活性物与所述绞股蓝皂苷的重量比为1:0.6。
10.一种具有美白、保湿功能的无刺激化妆品和/或护肤品，其特征在于，含有如权利要求1～9任一项所述的无刺激组合物。
技术总结本发明涉及一种具有美白、保湿功能的无刺激组合物及其制备方法，所述组合物含有白子菜活性物和绞股蓝皂苷作为有效组分。本发明采用黑柄炭角菌发酵白子菜醇提物获得了对酪氨酸酶具有较高抑制作用的活性物，同时解决了白子菜醇提物引起的皮肤刺激的问题，可作为一种美白活性成分应用于化妆品的制备中。此外，本发明发现了将绞股蓝皂苷与上述活性物联用存在协同的可能性，当两者组合作用时，不仅提高了组合物的美白活性，且进一步降低了组合物的刺激性，可应用于制备无刺激的美白产品。
技术研发人员：陈广文
受保护的技术使用者：广州清淞泉生物科技有限公司
技术研发日：2020.02.18
技术公布日：2020.06.09
