本发明属于生物技术领域，特别涉及一种檀米发酵原浆及其制备方法与应用。
背景技术：
檀香为檀香科檀香属植物的心材，是名贵的中药。据《本草纲目》记载，噎膈吐食。又面生黑子，每夜以浆水洗拭令赤，磨汁涂之，甚良。
本草纲目由李时珍（明朝）著作，有中国百科全书之誉。本书不仅提出较科学的药类分类方法，阐明各药药性理论，附列方剂，并反映了极其丰富的临床实践。书中载有从脾脏到皮肤表观的辨治，列明方药及使用方法，对现代美容护肤方药的研发有重要的临床指导意义和参考价值。
本发明中的檀米配方使用的原料在化妆品原料标准名录，本发明运用现代生物技术手段改进传统配方，采用酿酒酵母对原料进行生物发酵制成檀米发酵原浆。檀香的主要活性成分有α及β-檀香萜醇，檀萜酮等。有效抗菌，抗炎，活血化淤，介导细胞通路，促进细胞生长，增强皮肤弹性。其中α-檀香萜醇为挥发油的主要成分之一，有文献报道称其对酪氨酸酶和胆碱酯酶有强效抑制作用。小米富含活性多糖，黄酮类，多种矿物质和维生素，具有清热解毒，抗氧化的作用。配合两者可制作成具有美白，延缓衰老作用的发酵原浆。
本发明中使用的发酵菌种主要为酿酒酵母，已有文献报道利用酿酒酵母的甲羟戊酸途径为萜类化合物提供直接前体，能有效生产单萜及脂肪醇等，代替植物提取物的化学合成，在化妆品和药业的应用前景十分理想。
随着人们生活水平不断提高，绿色无害且有美容保健功效的天然护肤产品越来越受到人们的青睐，中草药的天然活性成分，因药效更稳定，副作用低，被广泛用在现代化妆品中。
目前市场上流通的护肤品多是营养原料的简单复配，搅拌混合而成，并添加大量防腐剂，活性成分难以被皮肤吸收利用并刺激皮肤。本发明利用微生物在繁殖过程中分泌的多种酶对中草药中的活性成分进行提取和小分子转化，从而获得安全、纯天然的中药化妆产品。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种未添加任何防腐剂成分的含有檀米发酵成分的原浆。
本发明旨在提供檀米发酵原浆的制备方法。
本发明旨在提供了檀米原浆在美白保健护肤品中的制备方法。
本发明旨在提供了檀米原浆在延缓衰老保健护肤品中的制备方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
一种未添加任何防腐剂成分的含有檀米发酵成份的原浆，其原料由以下重量比的组分组成：檀香10-15重量份、小米5-6重量份，纯净水100-120重量份，酵母4-6重量份。
优选的，所述檀香取自印尼檀香。
优选的，所述檀香粉，小米粉颗粒直径为20-30目。
优选的，所述酵母为毕赤酵母和酿酒酵母。
所述未添加任何防腐剂成分的含有檀米发酵成份的原浆，采用以下制备方法制备，步骤如下：
（1）檀米干粉制备：檀香、小米烘干，粉碎后过筛，得到檀米干粉；
（2）发酵初始体系的制备：将纯净水、酵母和步骤（1）的檀米干粉混合均匀，温度保持25-30度，静置48-72小时；
（3）高压灭菌；
（4）离心取上清，弃渣。
进一步的，上述步骤（1）所述檀香为印尼檀香粉碎干燥后所得。
进一步的，上述步骤（1）中所述的檀米粉碎后过筛，目数20-30目。
进一步的，上述步骤（2）中所述的静置过程需加盖密封静止。
进一步的，上述步骤（2）所述静置时间为72小时。
进一步的，上述步骤（3）所述灭菌温度为110-130度，灭菌时间为60分钟。
进一步的，上述步骤（4）所述的离心，采用离心转速4000-6000rpm。
一种檀米发酵原浆的制备方法，该制备方法的步骤如下：
（1）檀米干粉制备：檀香、小米烘干，粉碎后过筛，得到檀米干粉；
（2）发酵初始体系的制备：将纯净水、酵母和步骤（1）的檀米干粉混合均匀，温度保持25-30度，静置48-72小时；
（3）高压灭菌；
（4）离心取上清，弃渣。
进一步的，上述步骤（1）所述檀香为印尼檀香粉碎干燥后所得。
进一步的，上述步骤（1）中所述的檀米粉碎后过筛，目数30目。
进一步的，上述步骤（2）中所述的静置过程需加盖密封静止。
进一步的，上述步骤（2）所述静置时间为72小时。
进一步的，上述步骤（3）所述灭菌温度为120度，灭菌时间为60分钟。
进一步的，上述步骤（4）所述的离心，采用离心转速6000rpm。
一种檀米原浆在美白保健护肤品中的应用，该檀米发酵原浆采用如下制备方法制备，步骤如下：
（1）檀米干粉制备：檀香、小米烘干，粉碎后过筛，得到檀米干粉；
（2）发酵初始体系的制备：将纯净水、酵母和步骤（1）的檀米干粉混合均匀，温度保持25-30度，静置48-72小时；
（3）高压灭菌；
（4）离心取上清，弃渣。
进一步的，上述步骤（1）所述檀香为印尼檀香粉碎干燥后所得。
进一步的，上述步骤（1）中所述的檀米粉碎后过筛，目数30目。
进一步的，上述步骤（2）中所述的静置过程需加盖密封静止。
进一步的，上述步骤（2）所述静置时间为72小时。
进一步的，上述步骤（3）所述灭菌温度为120度，灭菌时间为60分钟。
进一步的，上述步骤（4）所述的离心，采用离心转速6000rpm。
所述的檀米发酵原浆，其特征在于，采用化妆品常规的制备方法，将檀米发酵原浆制备成面膜、精华液或爽肤水。
本发明的有益效果：
（1）本发明提供的檀米发酵原浆未添加任何防腐剂，富含萜类，黄酮，多糖和维生素等易于皮肤吸收的活性小分子成分，对皮肤温和无刺激，改善皮肤血液血液循环，防止细胞氧化导致的皮肤皱纹，同时有效抑制黑色素在真皮层的形成与沉着，起到美白与防治色素斑块的作用；
（2）本发明提供的檀米发酵原浆的制备方法，未添加任何防腐剂成分，将酿酒酵母接种至檀香和小米原料中发酵，制备工艺可控，得到的产品质量稳定，适用于规模化生产，具有良好的市场前景；
（3）通过微生物作用制备的檀米发酵原浆，富含多糖，氨基酸，矿物质等易于被皮肤吸收的小分子活性成分，解决长期以来活性成分分子大难以被皮肤吸收作用的难题。
附图说明
图1为本发明檀米发酵原浆的斑贴试验结果分析。
图2为本发明标准物质的分子量与洗脱时间分析。
图3为本发明为测定样品美白功能的溶液配制列表。
图4为本发明檀米发酵原浆的hplc图谱。
图5为本发明檀米发酵提取物对dpph自由基清除作用曲线。
图6为本发明檀米发酵原浆对酪氨酸酶活性的抑制率分析。
具体实施例
为使本发明的目的，技术方案和优点更清楚理解，以下结合实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中使用到的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。
实施例1：一种檀米发酵原浆的制备方法，具体包括以下步骤：
檀米发酵原浆，其组成为：檀香15重量份，小米5重量份，纯净水120重量份，酿酒酵母2-3重量份，毕赤酵母2-3重量份。
选取印尼檀香和小米粉碎，粉碎后过30目筛，将檀香粉15重量份，小米粉5重量份，纯净水120重量份，酿酒酵母2重量份，毕赤酵母2重量份混合均匀。加盖密封静置72小时，温度保持30度；于72小时停止发酵，加热灭菌，灭菌温度为120度，灭菌时间为60分钟；离心转速6000rpm，弃渣；上清液留存备用。
上述檀香发酵原浆，其制备方法，包括以下步骤：
（1）檀米干粉制备：檀香、小米烘干，粉碎后过筛，得到檀米干粉；
（2）发酵初始体系的制备：将纯净水、酵母和步骤（1）的檀米干粉混合均匀，温度保持25-30度，静置48-72小时；
（3）高温灭菌；
（4）离心取上清，弃渣。
实施例2：檀密发酵原浆在作为护肤品中的应用。
一、檀米发酵原浆的性质
将实施例1所制备所得的发酵提取物外观为粘稠液体、颜色为淡白色。ph值5.2-6.3，粘度200-500cp，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50cfu/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准gb7916-87，化妆品细菌总数不高于1000cfu/ml，所以此发酵提取物符合化妆品质量要求。
对该檀米发酵原浆进行成分分析，蛋白质检测方法参照gb5009.5-2010；粗多糖检测方法参照gb/t5009.8-2008；黄酮检测方法参照gb/t5009.124-2003；总酚检测方法参照gb/t8313-2008所得结果如下：
本发明制得的檀米发酵原浆含蛋白质2.893g/kg、粗多糖9.521g/kg、总黄酮0.036g/kg、总酚0.058g/kg。
二、檀米发酵原浆的安全性分析
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1获得的檀米发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法
称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2ml到0.025ml滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
3、实验结果
斑贴试验结果如图1所示："-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；" "＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；" "＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；" "＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。
根据化妆品卫生规范2007，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。
从图1中可以看出：实施例1得到的檀米发酵原浆产生0例可疑反应，说明本发明提供的檀米发酵物具有安全性，不会给人体带来不良反应。
表1、获得的檀米发酵原浆的斑贴试验结果
三、檀米发酵原浆的分子量大小检测
分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(hplc)测定。
实施例1制备的檀米发酵原浆的分子量大小。具体步骤如下。
1、试验的试剂和溶液的制备
(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝30：70：0.1(v/v/v)；
(2)样品制备：以流动相为溶剂，以实施例1所得檀米发酵原浆为溶质，配制浓度
为5mg/ml的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样；
(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(mr67000)、b12(mr1335)、氧化型谷胱甘肽(mr614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/ml。
2、试验方法
将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(mw67000)，维生素b12(mw1335)和氧
化型谷胱甘肽(mw614)通过高效液相色谱仪进行hplc分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中制备的檀米发酵原浆进行hplc分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的檀米发酵原浆的分子量。
色谱条件：色谱柱：tskgel2000swxl300mm×7.8mm；检测波长：uv280nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。
3、试验结果
标准物质的分子量与洗脱时间的如图2所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图得到标准曲线：y＝-2.4738x 17.656，r2＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。
图2、标准物质的分子量与洗脱时间
实施例1制备的檀米发酵原浆的hplc图谱如图4所示：从图中可以看出，檀米发酵原浆的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为12.34min，将洗脱时间代入标准曲线：y
＝-2.4738x 17.656，计算出峰的分子量对数为2.15，并且根据峰面积计算檀米发酵原浆占99.03％。一般认为分子量500da左右活性肽成分更易被皮肤吸收，所以檀米发酵物中存在容易被吸收的活性多肽。
四、檀米发酵原浆的抗氧化性能检测
dpph是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，dpph的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对dpph自由基的清除效果。
以实施例1所得檀米发酵原浆作为待测物：
(1)取等体积(一般为3ml)的待测物与2×10-4mol/l的dpph溶液混匀(a1管)；
(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/l的dpph溶液混匀(a2
管)；
(3)取等体积的无水乙醇与待测物混匀(a3管)；
(4)反应30min后，在517nm下测a1、a2、a3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(a2 a3)-a1]/a2，做出檀米发酵提取物对dpph自由基清除作用曲线，见图5。
由图可知，实施例1所得檀米发酵原浆对dpph清除作用的ic50＝17.99％，说明檀米发酵原浆具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
五、檀米发酵原浆的美白功效分析
酪氨酸酶是黑素生成的关键酶,它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。
通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下。
图3、溶液配制列表
注：c1和t1加入1ml酪氨酸酶，酶活为100u/ml；
样品为实施例1所得檀米发酵原浆；
（1）c2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零；
（2）c1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测
定c1吸光度值；
（3）按(1)(2)同样方法，以t2调零测定t1吸光度值；
（4）计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率t(％)：t(％)＝(c1-t1)/c1×100％。
实验证明，本发明实施例1所得檀米发酵原浆对酪氨酸酶活性的抑制率为82.6％，1％的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率99.63％，见图6。即本发明提供的檀米发酵原浆具有较强的美白功效。
1.一种制备檀米发酵原浆，其特征在于，该檀米发酵原浆采用以下重量比的组分制备：檀香粉10-15重量份，小米粉5-6重量份，纯净水100-120重量份，酵母4-6重量份。
2.根据权利要求1所述檀米发酵原浆，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母和毕赤酵母。
3.根据权利要求2所述酵母为酿酒酵母和毕赤酵母，其特征在于，酿酒酵母2-3重量份，毕赤酵母2-3重量份。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述檀米发酵原浆的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）檀米干粉制备：檀香、小米烘干，粉碎后过筛，得到檀米干粉；
（2）发酵初始体系的制备：将纯净水、酵母和步骤（1）的檀米干粉混合均匀，温度保持25-30度，静置48-72小时；
（3）高温灭菌；
（4）离心取上清，弃渣。
5.根据权利要求4所述檀米发酵原浆的制备方法，其特征在于，上述步骤（1）中所述的檀香为印尼檀香粉碎后所得。
6.根据权利要求4所述檀米发酵原浆的制备方法，其特征在于，上述步骤（1）中所述的檀米粉碎后过筛，目数20-30目。
7.根据权利要求4所述檀米发酵原浆的制备方法，其特征在于，上述步骤（2）中所述的静止过程需加盖密封静止。
8.根据权利要求4所述檀米发酵原浆的制备方法，其特征在于，上述步骤（3）中所述的高温灭菌温度为110～130℃，灭菌时间为30-60min。
9.根据权利要求4所述檀米发酵原浆的制备方法，其特征在于，上述步骤（4）所述的离心，采用离心转速4000-6000rpm。
10.如权利要求1所述的檀米发酵原浆，其特征在于，采用化妆品常规的制备方法，将檀米发酵原浆制备成面膜、精华液或爽肤水。
技术总结