本发明涉及细胞生物工程技术及医美领域，具体是一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法和应用。
背景技术：
：外泌体是由多泡体外膜和质膜融合后释放到细胞外环境中的纳米级生物囊泡，直径约30～150nm，可运输蛋白质、脂质和核酸等，参与细胞间通讯、细胞迁移和免疫调节等过程，对机体的生理和病理过程发挥着重要的调节作用。人脐带间充质干细胞是一种从胎儿脐带华通氏胶中分离的干细胞，在再生医学中发挥着重要作用。与其他来源的干细胞相比，人脐带间充质干细胞具有无创采集、低免疫原性、易于体外扩增、伦理问题少等优点，在细胞治疗领域具有广阔的应用前景。人脐带间充质干细胞外泌体是近几年研究的热点，因携带了人脐带间充质干细胞的部分信息因子(主要是再生因子及多种生物活性因子)，并可介导细胞-细胞物质传递和信息传导，故人脐带间充质干细胞外泌体具有促进成纤维细胞增殖和迁移、促进ⅰ型胶原和弹性蛋白合成、促进细胞外基质重构、抑制细胞凋亡和细胞过氧化等受体细胞修复性功效，发挥抗衰老、防止肌肤暗沉以及抑制皱纹产生的作用。目前干细胞外泌体产品(即细胞相关的因子类产品等)基本上都是以冻干粉形式存在，由于干细胞外泌体冻干粉需要添加大量甘露醇等赋形剂，容易使细胞失水，故其存在活性物质含量较低、功效差等问题。技术实现要素：本发明实施例的目的在于提供一种含干细胞外泌体的冻干贴，以解决上述
背景技术：
中提出的问题。为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种含干细胞外泌体的冻干贴，包括以下按照重量份计的组分：脐带间充质干细胞外泌体0.0005～0.005份、海藻酸钠0.1～1.5份、海藻糖0.05～1份、水解透明质酸钠0.05～0.2份、去离子水97.295～99.7995份。作为本发明实施例的一个优选方案，所述冻干贴包括以下按照重量份计的组分：脐带间充质干细胞外泌体0.001～0.003份、海藻酸钠0.8～1.2份、海藻糖0.4～0.6份、水解透明质酸钠0.08～0.12份、去离子水98.077～98.719份。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：培养p2代脐带间充质干细胞，得到上清液；对上述培养上清液进行离心提取，得到沉淀物；对上述沉淀物进行洗涤后，再用生理盐水进行重悬，得到所述脐带间充质干细胞外泌体。本发明实施例的另一目的在于提供一种上述含干细胞外泌体的冻干贴的制备方法，其包括以下步骤：按照上述重量份称取脐带间充质干细胞外泌体、海藻酸钠、海藻糖、水解透明质酸钠、去离子水，备用；将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液；将上述混合液装入模具中，并将装有混合液的模具置于真空冷冻干燥机进行冻干处理后，再经脱模处理，得到所述的冻干贴。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将装有混合液的模具置于真空冷冻干燥机进行冻干处理的步骤，具体包括：将装有混合液的模具置于-20～-10℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-50～-30℃的温度下进行二次预冻处理；将上述二次预冻处理后的模具置于-5～5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10～30℃的温度下进行二次干燥处理。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述模具包括板底、模孔和板盖，所述板底和板盖之间进行吻合连接，所述模孔位于板底上，为圆筒形结构；模孔的直径为5～50mm，高为1～10mm；所述板底上设有1～100个模孔。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将装有混合液的模具置于-20～-10℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-50～-30℃的温度下进行二次预冻处理的步骤中，一次预冻处理的持续时间为20～50min，二次预冻处理的持续时间为50～80min。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将上述二次预冻处理后的模具置于-5～5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10～30℃的温度下进行二次干燥处理的步骤中，一次干燥处理的持续时间为400～700min，二次干燥处理的持续时间200～500min。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将上述二次预冻处理后的模具置于-5～5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10～30℃的温度下进行二次干燥处理的步骤中，一次干燥处理的真空度为0.2～0.3mbar，二次干燥处理的真空度小于0.01mbar。本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的冻干贴。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述冻干贴为圆柱形片剂，直径为5～50mm，高度为0.5～5mm。本发明实施例的另一目的在于提供一种上述冻干贴在制备养颜美容品中的应用。与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：本发明实施例提供了一种含人脐带间充质干细胞外泌体的冻干贴，具有淡化皱纹、改善肌肤光泽度以及提升皮肤柔润度的作用。另外，本发明实施例通过将脐带间充质干细胞外泌体制成方便使用和保存的冻干贴，辅料少，不需要添加甘露醇等赋形剂，具有活性物含量高、功效好等特点。附图说明图1为试验动物在刺激性试验前后的荧光素钠检查结果图。图2为志愿者例1和例2在使用本发明实施例6提供的冻干贴前后的皮肤状况对比图。图3为志愿者例3～例5在使用本发明实施例6提供的冻干贴前后的皮肤状况对比图。图4为本发明实施例6提供的冻干贴的安全性及功效性评价图。图5为本发明实施例6提供的冻干贴的对皮肤柔润度的改善评价图。图6为本发明实施例6提供的冻干贴的对皮肤光泽度的改善评价图。图7为本发明实施例6提供的冻干贴的对皮肤皱纹的改善评价图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1该实施例提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其包括以下步骤：(1)采集足月健康婴儿的脐带组织，放于装有磷酸缓冲盐溶液(含100u/ml的青链霉素)的无菌瓶中进行保存，备用(需4h内处理)；接着，剥离脐带组织的静脉和动脉，剥取华通氏胶，将其剪成2mm3大小，再置于培养瓶中均匀平铺，并添加少量完全培养基保持湿润，培养基可采用现有的dmem/f12培养基(含15％的胎牛血清)，24h后补充足够的培养基，之后每3天换液一次，细胞长至融合度90％左右传代，传代后培养基使用dmem/f12培养基(含10％的胎牛血清)进行培养；待第3～5代细胞长至80％左右密度后，更换为无血清dmem/f12培养基，继续培养24h后，收集培养上清，得到培养液。(2)将上述培养液于4℃，300g离心力的条件下离心10min，保留上清液a；取上清液a于4℃，2000g离心力的条件下离心10min，保留上清液b；取上清液b于4℃，10000g离心力的条件下离心30min，保留上清液c；取上清液c于4℃，100000g离心力的条件下离心70min，弃上清，收集沉淀物。(3)用磷酸缓冲盐溶液将收集得到的沉淀物进行离心洗涤一遍后，再使用生理盐水进行重悬，即可得到脐带间充质干细胞外泌体，可置于-80℃冰箱保存备用。实施例2该实施例提供了一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法，该冻干贴的制备方法包括以下步骤：(1)称取脐带间充质干细胞外泌体0.0005g、海藻酸钠0.1g、海藻糖0.05g、水解透明质酸钠0.05g、去离子水99.7995g，备用。(2)将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液。(3)用移液枪将上述混合液装入模具的模孔中，并将装有混合液的模具置于冷冻干燥机中进行冻干处理后，再经脱模处理，即可得到所述的冻干贴。其中，模具包括板底、模孔和板盖，板底和板盖之间进行吻合连接，模孔位于板底上，为圆筒形结构；模孔的直径为5mm，高为1mm；板底上设有100个模孔，其制得的冻干贴为圆柱形片剂，直径为5mm，高度为0.5mm。另外，冻干处理的步骤如下：将装有混合液的模具置于-10℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-30℃的温度下进行二次预冻处理；将上述二次预冻处理后的模具置于0℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10℃的温度下进行二次干燥处理，其具体的工艺参数设定如下表1：表1阶段温度/℃时间/min持续时间/min真空度/mbar一次预冻-104020-二次预冻-304050-一次干燥0404000.25二次干燥10402000.009实施例3该实施例提供了一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法，该冻干贴的制备方法包括以下步骤：(1)称取脐带间充质干细胞外泌体0.005g、海藻酸钠1.5g、海藻糖1g、水解透明质酸钠0.2g、去离子水97.295g，备用。(2)将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液。(3)用移液枪将上述混合液装入模具的模孔中，并将装有混合液的模具置于冷冻干燥机中进行冻干处理后，再经脱模处理，即可得到所述的冻干贴。其中，模具包括板底、模孔和板盖，板底和板盖之间进行吻合连接，模孔位于板底上，为圆筒形结构；模孔的直径为50mm，高为10mm；板底上设有1个模孔，其制得的冻干贴为圆柱形片剂，直径为50mm，高度为5mm。另外，冻干处理的步骤如下：将装有混合液的模具置于-20℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-50℃的温度下进行二次预冻处理；将上述二次预冻处理后的模具置于0℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于30℃的温度下进行二次干燥处理，其具体的工艺参数设定如下表2：表2阶段温度/℃时间/min持续时间/min真空度/mbar一次预冻-207050-二次预冻-507080-一次干燥0807000.25二次干燥30805000.007实施例4该实施例提供了一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法，该冻干贴的制备方法包括以下步骤：(1)称取脐带间充质干细胞外泌体0.001g、海藻酸钠0.8g、海藻糖0.4g、水解透明质酸钠0.08g、去离子水98.719g，备用。(2)将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液。(3)用移液枪将上述混合液装入模具的模孔中，并将装有混合液的模具置于冷冻干燥机中进行冻干处理后，再经脱模处理，即可得到所述的冻干贴。其中，模具包括板底、模孔和板盖，板底和板盖之间进行吻合连接，模孔位于板底上，为圆筒形结构；模孔的直径为50mm，高为10mm；板底上设有1个模孔，其制得的冻干贴为圆柱形片剂，直径为50mm，高度为5mm。另外，冻干处理的步骤如下：将装有混合液的模具置于-20℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-50℃的温度下进行二次预冻处理；将上述二次预冻处理后的模具置于-5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10℃的温度下进行二次干燥处理，其具体的工艺参数设定如下表3：表3阶段温度/℃时间/min持续时间/min真空度/mbar一次预冻-206040-二次预冻-506070-一次干燥-570600.2二次干燥10704000.005实施例5该实施例提供了一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法，该冻干贴的制备方法包括以下步骤：(1)称取脐带间充质干细胞外泌体0.003g、海藻酸钠1.2g、海藻糖0.6g、水解透明质酸钠0.12g、去离子水98.077g，备用。(2)将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液。(3)用移液枪将上述混合液装入模具的模孔中，并将装有混合液的模具置于冷冻干燥机中进行冻干处理后，再经脱模处理，即可得到所述的冻干贴。其中，模具包括板底、模孔和板盖，板底和板盖之间进行吻合连接，模孔位于板底上，为圆筒形结构；模孔的直径为50mm，高为10mm；板底上设有1个模孔，其制得的冻干贴为圆柱形片剂，直径为50mm，高度为5mm。另外，冻干处理的步骤如下：将装有混合液的模具置于-10℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-30℃的温度下进行二次预冻处理；将上述二次预冻处理后的模具置于5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于30℃的温度下进行二次干燥处理，其具体的工艺参数设定如下表4：表4阶段温度/℃时间/min持续时间/min真空度/mbar一次预冻-106030-二次预冻-306060-一次干燥5605000.3二次干燥30603000.005实施例6该实施例提供了一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法，该冻干贴的制备方法包括以下步骤：(1)称取脐带间充质干细胞外泌体0.002g、海藻酸钠1g、海藻糖0.5g、水解透明质酸钠0.1g、去离子水98.698g，备用。(2)将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液。(3)用移液枪将上述混合液装入模具的模孔中，并将装有混合液的模具置于冷冻干燥机中进行冻干处理后，再经脱模处理，即可得到所述的冻干贴。其中，模具包括板底、模孔和板盖，板底和板盖之间进行吻合连接，模孔位于板底上，为圆筒形结构；模孔的直径为25mm，高为5mm；板底上设有50个模孔，其制得的冻干贴为圆柱形片剂，直径为25mm，高度为2.5mm。另外，冻干处理的步骤如下：将装有混合液的模具置于-15℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-40℃的温度下进行二次预冻处理；将上述二次预冻处理后的模具置于0℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于20℃的温度下进行二次干燥处理，其具体的工艺参数设定如下表5：表5阶段温度/℃时间/min持续时间/min真空度/mbar一次预冻-156030-二次预冻-406060-一次干燥0606000.25二次干燥20604000.008实验例：一、将按照上述实施例6提供的制备方法制得的冻干贴依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)进行体外动物刺激性实验，具体的包括以下步骤：(1)筛选：试验动物为2.5kg～3.0kg健康成年新西兰大白兔，在实验室条件下饲养适应7d，全价营养颗粒饲料喂食，自由采食，自由饮水，于试验开始前的24h内对试验动物的双眼进行荧光素钠检查。淘汰具有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物。(2)分组：筛选出7只试验动物，并进行标号(9～15)，用于测试本发明冻干贴的刺激性。(3)操作：试验当天，固定试验兔，轻轻拉开实验兔左侧下眼睑，将0.1ml受试物(上述实施例6提供的冻干贴用无菌水溶解后，得到的受试物)滴入结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合1s，以防止受试物丢失。另一侧眼睛不处理作自身对照。其中，7只试验动物试验前后的荧光素钠检查结果如附图1所示。图1中的a为试验开始前24h内对试验动物的双眼进行荧光素钠检查的结果图，均无损伤；图1中的b～c为滴入上述受试物72h后的左眼(b)与未滴有上述受试物的右眼(c)的对比图，无肉眼可见性差异；图1中的d为滴入上述受试物72h后对试验动物左眼进行荧光素钠检查的结果图，试纸均未变色，证明左眼在滴入上述受试物后无损伤。(4)临床检查和评分：在滴入受试物后1h、24h、48h、72h以及第4d和第7d对试验动物眼睛进行检查。如果72h未出现刺激反应，即可终止试验，在72h观察和记录结束之后，滴加荧光素钠作进一步检查。如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用，7d内不恢复者，为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间，不超过21d，并提供第7d、14d、21d的观察报告。除了对角膜、虹膜、结膜进行观察外，其它损害效应均应当记录并报告。在每次检查中均应按表6眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分。表6眼损害积分角膜：无溃疡形成或混浊0角膜：散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1角膜：半透明区易分辨，虹膜模糊不清2角膜：出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见3角膜：混浊，虹膜无法辨认4虹膜：正常0虹膜：皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有中度充血瞳孔对光仍有反应1虹膜：出血、肉眼可见破坏，对光无反应(或出现其中之一反应)2虹膜：血管正常0虹膜：血管充血呈鲜红色1虹膜：血管充血呈深红色，血管不易分清2虹膜：弥漫性充血，呈紫红色3无水肿0轻微水肿(包括瞬膜)1明显水肿，伴有部分眼睑外翻2水肿至眼睑近半闭合3水肿至眼睑大半闭合4(5)结果评价：以给受试物后动物角膜、虹膜或结膜各自在24h、48h及72h观察点的刺激反应的最高积分均值和恢复时间评价，按表7眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度。表7上述刺激性实验的结果如下表8所示，表8为兔子角膜、虹膜或结膜各自在24h、48h及72h观察时间点的刺激反应的最高积分均值和恢复时间评价结果，其中，角膜、虹膜、结膜积分均为0，证明本发明的冻干贴无刺激性。表8测试项目24h48h72h角膜000虹膜000结膜000二、将按照上述实施例6提供的制备方法制得的冻干贴进行人体安全性及功效性实验，具体的包括以下步骤：(1)招募志愿者共38名，每人分发28片本发明实施例6提供的冻干贴(受试品)及28份激活液(用作为冻干贴的溶剂，无任何功效成分)，每天洁面后使用1片，每天只使用1次，共使用28天，其他护肤习惯不变。(2)发放受试品时，要求志愿者当场使用受试品，并在使用前和使用后0.5h用德国ck多功能皮肤测试仪进行水分含量、黑色素数据采集，并拍照。使用前数据均值记为d0，使用0.5h后数据均值记为d1。(3)于使用受试品28天后用德国ck多功能皮肤测试仪进行皮肤纹理数据采集，并拍照，如附图2所示，图2中的a和b为志愿者例1在使用本发明冻干贴前(图2a)以及使用受试品28天后(图2b)的皮肤状况图；图2中的c和d为志愿者例2在使用本发明冻干贴前(图2c)以及使用受试品28天后(图2d)的皮肤状况图；如附图3所示，a、b为志愿者例3使用本发明冻干贴前(图3a)与使用28天后(图3b)效果对比图；c、d为志愿者例4使用本发明冻干贴前(图3c)与使用28天后(图3d)效果对比图；e、f为志愿者例5使用本发明冻干贴前(图3e)与使用28天后(图3f)效果对比图。使用28天后数据均值记为d2。(4)志愿者使用受试品期间，分别于一周、两周、三周、四周对每位志愿者进行电话回访，针对使用产品的安全性、舒适度等进行咨询。(5)计算使用0.5h后与使用前各项数据均值的差值(d1-d0)，计算使用28天后与使用前各项数据均值的差值(d2-d0)，当数据差值为正，视为改善，计算改善程度和改善人数比例。改善程度＝数据差值/d0×100％，改善人数比例＝各改善程度人数/总人数×100％。实验结果如下：(1)总体评价结果：包括安全性和功效性评价结果，如附图4以及下表9所示。表9测试项目测试有效人数改善人数改善人数比例安全性3838100％舒适感3838100％柔润度383489.5％光泽度383694.8％皱纹变化383078.9％由表9可知：本发明实施例提供的冻干贴在有效测试人群的试用过程中无刺激性，涂抹舒适，说明本发明冻干贴具有良好的安全性和舒适感；89.5％的志愿者使用本发明冻干贴后皮肤的水分含量增加，柔润度得到及时性提升；94.7％的志愿者使用本发明冻干贴后皮肤的黑色素降低，光泽度得到及时性提升；78.9％志愿者使用本发明冻干贴后，有不同程度地去除干纹细纹，淡化真性纹的功效。(2)皮肤柔润度评价结果(即时效果)，如附图5和下表10所示。表10由表10可知：89.5％的志愿者使用本发明的冻干贴后，皮肤水分含量值都有不同程度的提高，63.2％的志愿者皮肤水分改善程度大于20％，说明本发明的冻干贴具有提高皮肤水分含量，改善肌肤柔润度的功效。(3)皮肤光泽度评价结果(即时效果)，如附图6和下表11所示。表11由表11可知：在使用本发明的冻干贴后，94.8％的志愿者皮肤黑色素值有不同程度的降低，皮肤光泽度有明显改善，且63.2％的志愿者皮肤黑色素值降低程度大于10％，说明本发明的冻干贴具有明显降低皮肤黑色素、提亮肤色、改善皮肤光泽度的功效。(4)皮肤皱纹评价结果(长期效果)，如附图7和下表12所示。表12由表12可知：在使用本发明的冻干贴28天后，78.9％的志愿者皮肤皱纹有不同程度的淡化，60.5％的志愿者细纹有明显淡化，18.4％的志愿者深度皱纹变浅，说明本发明的冻干贴在改善肌肤皱纹方面有较好的功效作用。综上所述，本发明实施例提供的冻干贴，具有淡化皱纹、改善肌肤光泽度以及提升皮肤柔润度的作用。以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。当前第1页1 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技术特征：1.一种含干细胞外泌体的冻干贴，其特征在于，包括以下按照重量份计的组分：脐带间充质干细胞外泌体0.0005～0.005份、海藻酸钠0.1～1.5份、海藻糖0.05～1份、水解透明质酸钠0.05～0.2份、去离子水97.295～99.7995份。
2.根据权利要求1所述的一种含干细胞外泌体的冻干贴，其特征在于，所述冻干贴包括以下按照重量份计的组分：脐带间充质干细胞外泌体0.001～0.003份、海藻酸钠0.8～1.2份、海藻糖0.4～0.6份、水解透明质酸钠0.08～0.12份、去离子水98.077～98.719份。
3.根据权利要求1或2所述的一种含干细胞外泌体的冻干贴，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
培养p2代脐带间充质干细胞，得到上清液；
对上述培养上清液进行离心提取，得到沉淀物；
对上述沉淀物进行洗涤后，再用生理盐水进行重悬，得到所述脐带间充质干细胞外泌体。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述含干细胞外泌体的冻干贴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按照上述重量份称取脐带间充质干细胞外泌体、海藻酸钠、海藻糖、水解透明质酸钠、去离子水，备用；
将上述海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液；
将上述混合液装入模具中，并将装有混合液的模具置于真空冷冻干燥机进行冻干处理后，再经脱模处理，得到所述的冻干贴。
5.根据权利要求4所述的一种含干细胞外泌体的冻干贴的制备方法，其特征在于，所述将装有混合液的模具置于真空冷冻干燥机进行冻干处理的步骤，具体包括：
将装有混合液的模具置于-20～-10℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-50～-30℃的温度下进行二次预冻处理；
将上述二次预冻处理后的模具置于-5～5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10～30℃的温度下进行二次干燥处理。
6.根据权利要求5所述的一种含干细胞外泌体的冻干贴的制备方法，其特征在于，所述将装有混合液的模具置于-20～-10℃的温度下进行一次预冻处理后，再置于-50～-30℃的温度下进行二次预冻处理的步骤中，一次预冻处理的持续时间为20～50min，二次预冻处理的持续时间50～80min。
7.根据权利要求5所述的一种含干细胞外泌体的冻干贴的制备方法，其特征在于，所述将上述二次预冻处理后的模具置于-5～5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10～30℃的温度下进行二次干燥处理的步骤中，一次干燥处理的持续时间为400～700min，二次干燥处理的持续时间200～500min。
8.根据权利要求5或7所述的一种含干细胞外泌体的冻干贴的制备方法，其特征在于，所述将上述二次预冻处理后的模具置于-5～5℃的温度下进行一次干燥处理后，再置于10～30℃的温度下进行二次干燥处理的步骤中，一次干燥处理的真空度为0.2～0.3mbar，二次干燥处理的真空度小于0.01mbar。
9.一种如权利要求4～8中任一项所述制备方法制得的冻干贴。
10.一种如权利要求1～3和权利要求9中任一项所述冻干贴在制备养颜美容品中的应用。
技术总结本发明公开了一种含干细胞外泌体的冻干贴及其制备方法和应用，属于细胞生物工程技术及医美领域。该含干细胞外泌体的冻干贴包括以下组分：脐带间充质干细胞外泌体、海藻酸钠、海藻糖、水解透明质酸钠、去离子水。该冻干贴的制备方法包括以下步骤：将海藻酸钠、海藻糖和水解透明质酸钠用部分的去离子水进行浸泡溶胀后，再与剩余的去离子水和脐带间充质干细胞外泌体进行搅拌混合，得到混合液；将混合液装入模具中，并将装有混合液的模具置于真空冷冻干燥机进行冻干处理后，再经脱模处理，得到冻干贴。本发明通过添加脐带间充质干细胞外泌体制得的冻干贴，活性物含量高、使用方便，且具有淡化皱纹、改善肌肤光泽度以及提升皮肤柔润度的作用。
技术研发人员：戴博;田丽军;刘莹;何婷婷;李敏;刘炜琳;聂苏秦
受保护的技术使用者：西安九州再生医学集团有限公司
技术研发日：2020.01.18
技术公布日：2020.06.09
