本发明涉及医药领域，特别是一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法及其应用。
背景技术：
婴儿双歧杆菌（bi）是目前研究较多的厌氧菌载体，能够选择性在肿瘤组织内定植和生长，具有较好的靶向性；亚慢性安全检测实验证实，作为载体的婴儿双歧杆菌毒性极低，能与宿主和谐相处。此外，双歧杆菌具有抗肿瘤作用，其表面活性物质可通过调控肿瘤细胞凋亡相关基因的表达，诱导肿瘤细胞自然凋亡；还可直接或间接地清除致癌物质，以降低肿瘤的发生率。婴儿双歧杆菌作为肿瘤基因治疗载体，既可充分发挥其本身的抗肿瘤作用，又具有基因载体厌氧靶向作用，为恶性肿瘤的治疗提供了新的契机。
内皮抑素（es）是一种内源性血管生成抑制剂，与血管内皮生长因子(vegf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)等血管生成刺激因子竞争,结合生长因子信号转导系统中的硫酸肝素蛋白聚糖受体,从而抑制内皮细胞的增殖。国内外许多学者利用重组内皮抑素蛋白或通过内皮抑素基因治疗实验表明,内皮抑素对多种实体瘤的生长和转移都能产生抑制作用。同时在细胞水平,也有实验证明内皮抑素能抑制肿瘤细胞在人工基底膜凝胶中的迁移。与传统的肿瘤治疗方法相比,内皮抑素并非直接作用于肿瘤细胞,而是通过作用于遗传性状比较稳定、突变率较低的新生血管内皮细胞,即通过阻断肿瘤血管形成抑制肿瘤的生长和转移,使肿瘤长期处于“休眠”状态。
阿霉素(dox)又称多柔比星，属于高效的广谱抗癌药物。在临床应用时，dox主要通过插入细胞dna，引发拓扑异构酶ii破坏dna的三级结构来发挥药效的。迄今为止，dox单独或与其他抗肿瘤药物联合用药，均被认为是治疗实体肿瘤(如:乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等)的一种强有力的化疗药物，但如何制备成由细菌驱动的新型生物马达联合递药系统及实现在制备抗肿瘤药物中的应用，至今未见有公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的在于提供一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法及其应用，可有效解决制备由细菌驱动的新型生物马达联合递药系统及实现在制备抗肿瘤药物中的应用问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案是，一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1-2μg内皮抑素质粒（pgex-4t-1-es）加入预冷的含有80-150μl感受态婴儿双歧杆菌悬液（bi）中，冰浴5-10分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至1-5ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2-3h，在5000-6000r/min离心3-5min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠（alg）0.9-1.8mg，溶解于9-18ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将4.8-9.6mgfecl3·6h2o溶解于6-12ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠（alg）溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入3-5mg阿霉素（dox），磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3000-4000r/min离心3-5min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
上述方法制备的由细菌驱动的生物马达联合递药系统具有抗肿瘤活性，实现在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明制备方法简单，利用婴儿双歧杆菌的乏氧趋向性，将其作为靶向乏氧实体瘤的生物载体，同步负载内皮抑素基因和阿霉素，通过自靶向蓄积于肿瘤，实现基因与化药协同抗肿瘤的目的，技术方案包括以下步骤：将合成的内皮抑素质粒电转化入婴儿双歧杆菌，磁力搅拌条件下，将工程菌加入海藻酸钠溶液中，混匀后加入阿霉素，再逐滴加入交联剂fe3 ，继续进行磁力搅拌，反应结束后离心收集沉淀，即得。体内外效果良好，为实体瘤的治疗提供了技术支持，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，由以下实施例给出。
实施例1
一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1.55μg内皮抑素质粒加入预冷的含有125μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴7.5分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至2.5ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2.6h，在5800r/min离心4.3min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠1.4mg，溶解于14ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将7.2mgfecl3·6h2o溶解于9ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入4mgdox，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3500r/min离心4.3min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
实施例2
一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1μg内皮抑素质粒加入预冷的含有80μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴5分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至1ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2h，在5000r/min离心5min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠0.9mg，溶解于9ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将4.8mgfecl3·6h2o溶解于6ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入3mgdox，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3000r/min离心5min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
实施例3
一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1.5μg内皮抑素质粒加入预冷的含有100μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴8分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至2ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2.5h，在5500r/min离心4min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠1.8mg，溶解于18ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将4.8mgfecl3·6h2o溶解于6ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入4mgdox，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3500r/min离心4min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
实施例4
一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将2μg内皮抑素质粒加入预冷的含有150μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴10分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至5ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏3h，在6000r/min离心3min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠1.8mg，溶解于18ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将9.6mgfecl3·6h2o溶解于12ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入5mgdox，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，4000r/min离心3min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
实施例1-4所制备的由细菌驱动的生物马达联合递药系统具有具有抗肿瘤活性，实现在制备抗肿瘤药物中的应用，并经实验，取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下（以实施例1为例）。
实验一：bi-es菌落pcr鉴定
挑取平板上阳性单克隆2个，于pyg液体培养基中37"c厌氧培养12-16h,6000r/min离心5min收集菌体，加入终浓度10mg/ml溶菌酶37℃水浴1h以裂解婴儿双歧杆菌细胞壁，以裂解菌液为模版、ftk、rtk为上下游引物做菌落pcr，反应条件为94℃、5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min,35cycle；72℃、10min。pcr产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果表明，内皮抑素质粒成功转化进入婴儿双歧杆菌。
实验二：bi-es-fealg的表征
取0.1mg/ml的alg溶液18ml至玻璃瓶中，加入bi-es菌液（浓度约为3*108cfu/ml）500μl，磁力搅拌30min后，取6ml0.8mg/ml的fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至alg溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3000r/min离心5min，弃上清液，沉淀即为bi-es-fealg凝胶。tem、sem结果表明，fealg凝胶壳成功包覆在bi-es表面。
实验三：bi-es-fealg负载dox的鉴定
取0.1mg/ml的alg溶液18ml至玻璃瓶中，加入bi-es菌液（浓度约为3*108cfu/ml）500μl，磁力搅拌30min混合均匀，加入5.4mgdox，磁力搅拌5min后，取6ml0.8mg/ml的fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至alg溶液中，继续磁力搅拌反应3h。反应结束后，3000r/min离心5min，取上清液，测定其在479nm处的吸光度，根据dox的标准曲线计算出上清液中dox的含量，计算载药率和包封率。结果表明，阿霉素成功负载在bi-es-fealg上。
实验四：bi-es-fealg/dox的抗肿瘤活性测定
体外抗肿瘤活性以鼠结直肠癌细胞株ct26为研究对象；
时间效应：用bi-es-fealg/dox对细胞进行一次处理,在不同时间点考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（srb法）；剂量效应：用不同剂量bi-es-fealg/dox处理细胞，通过srb法考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用；
以上实验均设不同实验组bi-es-fealg、dox、bi-es-fealg/dox。结果表明bi-es-fealg/dox对细胞的抑制作用具有明显的时间依赖性及浓度依赖性，且bi-es及dox具有显著的协同抑瘤作用；
体内抗肿瘤活性：aom/dss法构建小鼠结肠癌模型，构建成功后，将肿瘤移植至小鼠皮下，当肿瘤体积达到100-300mm3时,将动物随机分组并开始处理（静脉注射）①bi-es-fealg、②dox、③bi-es-fealg/dox。同时设生理盐水对照组和阳性对照组。连续监测肿瘤体积直到动物处死为止。到第七周时,处死所有小鼠，取出肿瘤，称重。按照相对肿瘤增殖率t/c评价效果；
实验结果表明相比于其他组，bi-es-fealg/dox在体内取得了显著的抑瘤效应，相对肿瘤增殖率最小。
本发明除按上述方法重复三个实验的同时，还对实施例2-4给出的产品做了同样的实验，均取得了相同和相近似的结果，这里不一一列举，实验表明，方法稳定可靠，产品质量好，与现有技术相比，具有以下有益技术效果：
（1）本发明采用婴儿双歧杆菌作为基因载体,既可充分发挥其本身的抗肿瘤作用，又利用其乏氧趋向性主动靶向肿瘤乏氧区域，在肿瘤组织内定植和生长；
（2）本发明采用海藻酸铁纳米凝胶作为药物载体，在肿瘤微环境的弱酸性和还原性条件下，fe3 被还原成fe2 ，纳米凝胶解交联，负载的化疗药物阿霉素释放并作用于肿瘤细胞；
（3）内皮抑素基因的表达，通过阻断肿瘤血管形成的作用抑制肿瘤的生长和转移，与化疗药物阿霉素协同作用，显著降低药物的使用剂量和毒副作用，提高药物的治疗效率，开拓了治疗抗肿瘤药物的新途径，有显著的经济和社会效益。
1.一种由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1-2μg内皮抑素质粒加入预冷的含有80-150μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴5-10分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至1-5ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2-3h，在5000-6000r/min离心3-5min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠0.9-1.8mg，溶解于9-18ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将4.8-9.6mgfecl3·6h2o溶解于6-12ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入3-5mg阿霉素，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3000-4000r/min离心3-5min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
2.根据权利要求1所述的由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1.55μg内皮抑素质粒加入预冷的含有125μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴7.5分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至2.5ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2.6h，在5800r/min离心4.3min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠1.4mg，溶解于14ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将7.2mgfecl3·6h2o溶解于9ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入4mg阿霉素，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3500r/min离心4.3min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
3.根据权利要求1所述的由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1μg内皮抑素质粒加入预冷的含有80μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴5分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至1ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2h，在5000r/min离心5min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠0.9mg，溶解于9ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将4.8mgfecl3·6h2o溶解于6ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入3mg阿霉素，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3000r/min离心5min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
4.根据权利要求1所述的由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将1.5μg内皮抑素质粒加入预冷的含有100μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴8分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至2ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏2.5h，在5500r/min离心4min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠1.8mg，溶解于18ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将4.8mgfecl3·6h2o溶解于6ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入4mg阿霉素，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，3500r/min离心4min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
5.根据权利要求1所述的由细菌驱动的生物马达联合递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）bi-es菌液的制备：将2μg内皮抑素质粒加入预冷的含有150μl感受态婴儿双歧杆菌悬液中，冰浴10分钟，转移到预冷的电击杯中电击，电压2.5kv，电容25μf，电阻200ω，电击后迅速转移至5ml新鲜的含0.5m蔗糖的pyg液体培养基中，37℃厌氧复苏3h，在6000r/min离心3min，收集菌体，迅速涂布于含amp的tpy固体培养基平板，37℃厌氧培养72h，得菌落，取菌落接种于pyg液体培养基中，37℃厌氧培养至od600为0.2，得浓度为3x108cfu/ml的bi-es的菌液；
（2）bi-es-fealg/dox的制备：将分子量为2×105kda的海藻酸钠1.8mg，溶解于18ml超纯水中，超声30分钟使其溶胀，再将9.6mgfecl3·6h2o溶解于12ml超纯水中，超声30分钟使其溶解；向海藻酸钠溶液加入步骤（1）制备的bi-es菌液，磁力搅拌30min混合均匀，再加入5mg阿霉素，磁力搅拌5min，将fecl3·6h2o溶液以1ml/min的速度逐滴加至海藻酸钠溶液中，继续磁力搅拌反应3h，反应结束后，4000r/min离心3min，弃去上清液，得沉淀，即为bi-es-fealg/dox凝胶的细菌驱动的生物马达联合递药系统。
6.权利要求1-5任一方法制备的由细菌驱动的生物马达联合递药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术总结