本发明属于医药技术领域，涉及一种稳定的法匹拉韦注射液及其制备方法。
背景技术：
法匹拉韦(favipiravir)，化学名为6-氟-3-羟基吡嗪-2-甲酰胺，是由富山化学工业株式会社研制的一种rna依赖的rna聚合酶抑制剂类广谱抗病毒药物，于2014年7月在日本上市，剂型为片剂，规格为200mg/片，用于治疗新发或者复发的流感病毒感染。
法匹拉韦如下面的结构式所示：
法匹拉韦在细胞内被代谢为核糖三磷酸体(法匹拉韦rtp)，法匹拉韦rtp选择性抑制流感病毒的复制关联的rna聚合酶，其人源性rna聚合酶的抑制作用ic50值为905μml/l。鉴于此，为了在体内达到较高的血药浓度，法匹拉韦口服片剂的服用剂量较大，单日剂量可高达3200mg/天，分两次服用，每次服用1600mg，相当于8个剂量单位(8片)。这对儿童、老年等患者及吞咽困难患者的服药造成很大困难，患者的依从性难以保证。因此，公众寻求可以显著提高患者给药依从性，起效迅速，生物利用度更高，安全，稳定的注射剂型。
然而，开发法匹拉韦的供注射剂型却存在巨大挑战，其原因是：1)法匹拉韦在广泛ph范围内的水介质中溶解度低，药物溶液室温放置，或经配伍后容易结晶析出；2)法匹拉韦水溶液的稳定性欠佳，尤其是在碱性水溶液中容易发生碱降解，产生有关物质6-氟-3-羟基吡嗪基-2-甲酸。该有关物质含量增加会导致药液发生颜色变化，且影响给药安全性。
因此，目前公开的所有专利技术手段，都是将法匹拉韦开发为供注射用冻干粉针剂。例如专利tw201934539a报道了一种注射用法匹拉韦钠盐冻干制剂的制备方法，该发明人使用氢氧化钠与法匹拉韦成盐后，通过常规方法制备了法匹拉韦钠冻干制剂，但是该冻干制剂复溶性极差，影响临床使用便利性。专利cn103209967a则披露了一种注射用法匹拉韦葡甲胺盐的冻干制剂，形成的化合物具有优异的复溶性，克服了钠盐冻干难以复溶的问题。
但是，本领域技术人员仍然期待发现一种可直接静脉给药的法匹拉韦液体注射剂，不仅仅因为相较于冻干制剂，注射液的临床使用更加方便快捷，而且其生产工艺更加简单，生产周期更短，生产成本更低。当然，任何这种静脉制剂必须在产品的保质期内显示化学和物理稳定性。
技术实现要素：
法匹拉韦是一种弱酸性、水溶性差的药物，酸性和中性热水溶液的溶解度仅为5mg/ml，且溶液室温放置容易结晶析出。虽然在碱性条件下溶解度略有增加，但是其在强碱性条件下不稳定，容易发生碱降解，且其碱性水溶液的溶解度仍然不能满足静脉给药剂量。
开发供静脉注射的法匹拉韦注射液的前提是：1)足够的增溶效果，期望药液浓度达到30mg/ml或更高；2)足够的溶液稳定性，期望药液呈中性或弱碱性，防止或抑制碱性降解产物的产生。
本发明人通过实验发现：改性β-环糊精，特别是磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)对法匹拉韦具有良好的增溶作用。本发明人测定了水和碱化磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)水溶液中，不同磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)浓度下对法匹拉韦饱和溶解度的ph依赖性影响，结果见图1。在ph7.0和8.5时，随着磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)浓度的升高，法匹拉韦溶解度非线性升高。当磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)浓度达到400mg/ml时，即使在中性溶液(ph7.0)中，法匹拉韦的浓度也能够达到期望浓度30mg/ml。
本发明人还测定了磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)浓度为400mg/ml时，ph6.5至8.5范围内水溶液中法匹拉韦饱和溶解度，以及法匹拉韦溶液经终端灭菌(121℃，12min)后，指标降解产物6-氟-3-羟基吡嗪基-2-甲酸(碱降解产物)的水平(％)，见图2。该试验意义非凡，它科学、直观地反映了在增溶剂磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)浓度为400mg/ml时，同时满足一定的增溶效果(30mg/ml法匹拉韦)，以及药液热稳定，可耐受终端灭菌的ph范围，即ph6.8～7.6。
为此，本发明的目的在于提供一种稳定的法匹拉韦注射液及其制备方法。
本发明提供的稳定注射液，其中包含法匹拉韦，增溶剂磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)，还可包括少量酸碱调节剂。
在一些实施方案中，注射液中法匹拉韦的浓度为25～40mg/ml,磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)的浓度为300～500mg/ml。
优选地，在某一些进一步实施方案中，注射液中法匹拉韦的浓度为30mg/ml，磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)的浓度为400mg/ml。
在一些实施方案中，该稳定的法匹拉韦注射液的ph为约6.8至7.6。
优选地，在某一些进一步实施方案中，该稳定注射液的ph为约7.2。
本发明提供的稳定注射液，其中的酸碱调节剂选自氨水，氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、或其组合。
本发明所制备的稳定的法匹拉韦注射液的单剂量制剂灌装量是5～50ml，优选为10～40ml，特别优选为20ml。
本发明还提供制备上述稳定的法匹拉韦注射液的方法，包括如下步骤：
(1)取处方量60～90％的注射用水，加热至温度在50～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入碱性调节剂溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～2h，得到澄清溶液，用酸碱调节剂调节溶液ph至6.8至7.6之间，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于西林瓶或安瓿瓶中，封口，终端湿热灭菌(通常是115～126℃，灭菌10～40min)，包装、储存。
按照以上配比及方法制备的法匹拉韦注射液，可通过静脉滴注，静脉输注的形式进行给药。
本发明提供的法匹拉韦注射液，具有良好的特征属性，如稳定性，如安全性。
具体实施方式
通过以下实例来对本发明作进一步具体说明，包括但并不仅限于以下实例。
实施例1：
100支处方
制备方法
(1)取处方量60％的注射用水，加热至温度在60～70℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钠溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～0.5h，得到澄清溶液，用1m盐酸或1m氢氧化钠溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于安瓿瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例2：
100支处方
制备方法
(1)取处方量70％的注射用水，加热至温度在60～70℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入10％氨水溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～0.5h，得到澄清溶液，用1m盐酸或10％氨水溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于15或20ml西林瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例3：
100支处方
制备方法
(1)取处方量70％的注射用水，加热至温度在60～70℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钾溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～0.5h，得到澄清溶液，用1m氢氧化钾溶液或6m磷酸溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于15或20ml西林瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例4：
100支处方
制备方法
(1)取处方量70％的注射用水，加热至温度在60～75℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钠溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～1h，得到澄清溶液，用1m盐酸或1m氢氧化钠溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于安瓿瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例5：
100支处方
制备方法
(1)取处方量70％的注射用水，加热至温度在60～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入10％氨水溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～1h，得到澄清溶液，用1m盐酸或10％氨水溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于15或20ml西林瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌15min)，包装、储存。
实施例6：
100支处方
制备方法
(1)取处方量80％的注射用水，加热至温度在70～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钾溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.5～1.5h，得到澄清溶液，用6m磷酸溶液或1m氢氧化钾溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于安瓿瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例7：
100支处方
制备方法
(1)取处方量90％的注射用水，加热至温度在70～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钠溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌1.0～2.0h，得到澄清溶液，用1m盐酸或1m氢氧化钠溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于安瓿瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例8：
100支处方
制备方法
(1)取处方量90％的注射用水，加热至温度在70～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入10％氨水溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌1.0～2.0h，得到澄清溶液，用1m盐酸或10％氨水溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于安瓿瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例9：
100支处方
制备方法
(1)取处方量90％的注射用水，加热至温度在70～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钾溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌1.0～2.0h，得到澄清溶液，用6m磷酸溶液或1m氢氧化钾溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于15或20ml西林瓶中，每瓶装量10ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌12min)，包装、储存。
实施例10：
100支处方
制备方法
(1)取处方量90％的注射用水，加热至温度在70～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解。加入1m氢氧化钠溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液，测定ph在8.5～9.5之间；
(2)加入法匹拉韦，搅拌1.0～2.0h，得到澄清溶液，用1m盐酸或1m氢氧化钠溶液调节溶液ph至6.8至7.6之间，优选为ph7.2，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于15或20ml西林瓶中，每瓶装量8ml，封口，终端湿热灭菌(121℃，灭菌15min)，包装、储存。
试验例1：
依据《中国药典》2015版中药物稳定性研究指导原则，对代表性实施例1，实施例4和实施例7所制得的法匹拉韦注射液进行影响因素，长期和加速稳定性试验考察。影响因素考察的是注射液在强光、高温条件下的稳定性，具体条件是：强光(4500±500lx)、高温(60℃)。长期试验考察条件为温度25±2℃、相对湿度60±10％；加速试验考察条件为温度40±2℃、相对湿度75±5％。稳定性考察的项目为：溶液颜色、ph值、有关物质、含量等。
法匹拉韦注射液中法匹拉韦的含量可以参照以下hplc条件测定：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(agelampc18(2)(4.6*250mm,5μm)；柱温：25℃；流动相：0.6％的三氟乙酸水溶液(用三乙胺调节ph值至2.6)-乙腈(92:8)；流速：1.0ml/min；进样体积：20μl；检测器：uv检测器(波长323nm)；系统适用性：杂质e(6-氟-3-羟基吡嗪基-2-甲酸)色谱峰和法匹拉韦色谱峰相互之间分离度不得小于4.0，理论板数按法匹拉韦峰计算不低于3000。可以使用纯度大于99.5％的法匹拉韦及其杂质作为对照品进行测定。在本发明中，如未特别说明，组合物或原料药中法匹拉韦的量或相对量是通过以上hplc条件的方法测定。
法匹拉韦注射液中法匹拉韦的有关物质的测定可参照采用以上含量测定的相同hplc条件进行测定，组合物或原料药中已知杂质和未知杂质均按主成分自身稀释对照法进行定量计算。
法匹拉韦注射液的其它评价指标，如溶液颜色，如ph值，均可参照ich成员国公认的药典方法，或经过验证的方法，采用适宜的仪器设备进行测定。
表1，代表性实施例1，实施例4和实施例7产品影响因素试验结果
注：*杂质e为法匹拉韦碱性降解产物，化学名为6-氟-3-羟基吡嗪基-2-甲酸
表2，代表性实施例1，实施例4和实施例7产品长期和加速稳定性试验结果
注：*杂质e为法匹拉韦碱性降解产物，化学名为6-氟-3-羟基吡嗪基-2-甲酸
研究结论：在加速试验、长期试验及强光、高温条件下，本发明提供的注射用法匹拉韦注射液各质量属性均未发生明显变化，稳定性均良好，完全可满足药品生产，转运和储存需求。特别指出的是，碱性降解产物杂质未见大幅升高，始终处于0.5％的阈值范围内。
试验例2：
由于法匹拉韦注射液在临床上拟推荐的注射给药程序是：将注射液经生理盐水或5％葡萄糖稀释后，进行静脉推注或滴注。为考察稀释过程中，由于磺丁基醚-β-环糊精钠浓度降低(增溶效果也显著降低)，而导致稀释过程中出现沉淀，析晶的可能性。因此我们对实施例1(磺丁基醚-β-环糊精钠浓度最低)和实施例10(磺丁基醚-β-环糊精钠浓度最高)的注射液与生理盐水、5％葡萄糖注射液的配伍(临床使用)稳定性进行了研究。
将一支法匹拉韦注射液用生理盐水或5％葡萄糖注射液稀释至500ml。将配伍后的药液在室温下放置12h，检测放置前后配伍液的外观性状、ph和含量，测定结果如下表3。
表3，代表性实施例1，实施例10注射液配伍使用稳定性试验结果
*稀释后相对于初始含量
研究结论：施例1和实施例10制得的法匹拉韦注射液在配伍12小时内，外观(颜色)、ph、含量均无明显改变，能满足临床上的使用要求。
试验例3：
采用代表性实施例4，实施例5和实施例6制得的法匹拉韦注射液进行安全性评估。
3.1法匹拉韦注射液体外试管法溶血性试验
本研究采用新西兰兔血红细胞(2.5ml2％红细胞悬液)进行，2.5ml蒸馏水作阳性对照。法匹拉韦注射液的受试体积分别为0.5ml、0.4ml、0.3ml、0.2ml、0.1ml，其受试浓度为0.6mg/ml，37±0.5℃孵育，持续3小时观察，如出现溶液澄明红色，则视为具备溶血性。若无，则标记结果为无溶血性。
3.2法匹拉韦注射液豚鼠全身主动过敏试验
选用豚鼠作为实验对象，设立阴性、阳性对照组和法匹拉韦注射液高低剂量组，进行全身主动过敏实验。各组豚鼠隔日分别腹腔注射(ip)给予0.5ml/只的氯化钠注射液、3mg/ml卵清白蛋白溶液和浓度分别为30mg/ml、20mg/ml的法匹拉韦溶液进行致敏，共计3次。末次致敏后第14、21天分别足趾静脉快速注射相应浓度的药物进行激发，1.0ml/只。每次激发1/2动物，雌雄各半。随后观察全身过敏症状，并按全身致敏性评价标准进行分级。若无明显过敏症状，则判定为“－”。
3.3法匹拉韦注射液新西兰兔血管刺激性试验
选用新西兰兔作为试验对象，采用同体左右侧自身对比法进行试验。每只新西兰兔右侧耳缘静脉给予浓度为0.6mg/ml的法匹拉韦注射液，左侧耳缘静脉给药同体积氯化钠注射液。给药容积为11.18ml/kg，采用微量注射泵按照4.2ml/min速度注射。每天给药1次，连续给药6d。末次药后72h处死部分动物(雌雄各半)，剩余动物恢复期观察结束后处死。剪取含有血管的耳缘组织，观察有无血栓形成，内皮损伤等肉眼可见的明显刺激性症状。10％中性福尔马林固定液固定，常规组织切片进行组织病理学检查。依据组织病理学评分标准判断刺激分值，并与对照分值进行对比，差值作为最后评定依据。
汇总以上试验结果如下表4：
表4，法匹拉韦注射液安全性评估试验结果
研究结论：实施例4、实施5和实施例6制得的法匹拉韦注射液未显示溶血性，过敏性以及血管刺激性，安全性良好，提示临床用药安全，以及各种酸碱调节剂在注射液配方中的适用性。
附图说明
附图1为法匹拉韦饱和溶解度与磺丁基醚-β-环糊精钠(sbecd)浓度和ph的函数关系，其中横坐标表示sbecd浓度(mg/ml)，纵坐标表示法匹拉韦溶解度(mg/ml)。
附图2为40％(w/v)(400mg/ml)sbecd溶液中法匹拉韦饱和溶解度以及溶液经终端灭菌后杂质e水平和ph的函数关系，其中横坐标表示不同ph值，左y轴表示法匹拉韦溶解度(mg/ml)，右y轴表示杂质e含量(％)。
1.一种稳定的法匹拉韦注射液，该注射液含有活性成分法匹拉韦以及磺丁基醚-β-环糊精钠。
2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，该注射液中法匹拉韦的浓度为25～40mg/ml,磺丁基醚-β-环糊精钠的浓度为300～500mg/ml。
3.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，该注射液中法匹拉韦的浓度为30mg/ml,磺丁基醚-β-环糊精钠的浓度为400mg/ml。
4.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，该注射液的ph为6.8至7.6。
5.根据权利要求4所述的注射液，其特征在于，该注射液的ph为7.2。
6.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，该注射液还可以包含ph调节剂。
7.根据权利要求1-6所述的任一注射液的制备方法，其特征在于，采用终端灭菌法进行灭菌。
8.根据权利要求7所述的注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取处方量60～90％的注射用水，加热至温度在50～80℃之间，加入磺丁基醚-β-环糊精钠，搅拌使溶解；加入碱性调节剂溶液，碱化磺丁基醚-β-环糊精钠溶液；
(2)加入法匹拉韦，搅拌0.25～2h，得到澄清溶液，用酸碱调节剂调节溶液ph至6.8至7.6之间，补水至全量，0.22μm滤膜过滤；
(3)滤液灌装于西林瓶或安瓿瓶中，封口，终端湿热灭菌(通常是115～126℃，灭菌10～40min)，包装、储存。
技术总结