本发明属于靶向给药技术领域，尤其涉及一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用。
背景技术：
脑部肿瘤、帕金森氏症、老年痴呆、抑郁症以及精神分裂症等中枢神经系统疾病危害严重，治疗难度大。随着分子生物学技术的发展，人们对疾病的认识也转进深入到蛋白、基因和分子层面。这些理论和技术的发展，使得大分子，多肽、蛋白质、抗体、多聚糖与核酸药物应运而生，用于治疗因基因结构或表达异常引起的脑部疾病的预防和诊断。然而由于每个生物大分子内有几千到几十万个原子，分子量从几万到几百万以上，使得100％的生物大分子药物难以通过血脑屏障(blood-brainbarriers，bbb)进入中枢神经系统和细胞内发挥作用。此外，由于血脑屏障的特殊结构，有接近98％的小分子物质也不能够进入脑组织。因此，寻找能够高效穿透血脑屏障和神经细胞膜的药物载体对实现药物的脑靶向性，提高药物疗效，降低外周副作用具有重要意义。
脂质体是磷脂分散在水中形成的类球状、包封一部分水相的封闭囊泡，其粒经大小可在15纳米到几十微米，可作为疏水、亲水以及两亲性药物载体。脂质体在体内无降解、无毒、无免疫原性，做为药物载体可以提高治疗指数、降低毒副作用、减少给药剂量，可作为提高药物脑内浓度的理想载体。但是普通脂质体进入体内可以快速被肝、脾和骨髓等组织的网状内皮系统吞噬而不能到达靶位。在脂质体表面修饰聚乙二醇链，可以形成空间稳定的脂质体，避免被吞噬细胞吞噬，延长其在血液中停留时间，增加了循环至血脑屏障的机会。如果脂质体纳米粒经过特异的表面修饰，可以实现主动靶向于脑部的目的，并改变药物对生物膜的透过性，有利于药物向细胞内的传递。
表达在血脑屏障上的葡萄糖转运蛋白-1可以转运葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖和其他具有相似结构的物质进入血脑屏障。利用血脑屏障的葡萄糖转运体作为靶点来设计糖搭载脂质体制剂，可实现脑靶向给药的目的。用于脑缺血、脑肿瘤治疗的糖基修饰的脂质体就是其中之一。糖基修饰的脂质体表现出较好的脑靶向性，但其细胞膜穿透性较弱，有些药物如核酸类药物以及部分肽类药物需要进入细胞核发挥作用，而单一糖基修饰的脂质体虽然能够穿透血脑屏障进入脑组织，但其穿透细胞膜进入细胞的作用较弱，使得药物蓄积在细胞外，造成其药效下降。
技术实现要素：
为解决单一糖基修饰的脂质体穿透细胞膜进入细胞能力弱而使药物聚积在细胞外，药效下降的问题，本发明提供了一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用。
本发明的技术方案：
一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，包含摩尔比为(50～70):(20～40):(5～9):(1～5)的epc、cho、糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂。
进一步的，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
进一步的，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man。
进一步的，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
进一步的，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat。
进一步的，所述epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat的摩尔比为60:30:7:3，或70:20:5:5，或50:40:9:1。
一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，步骤如下：
步骤一、制备糖基修饰聚乙二醇化磷脂：
将dspe-peg-n3溶于叔丁醇中，加入糖基、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过硅胶柱得到糖基修饰聚乙二醇化磷脂；
步骤二、制备细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂：
以马来酸酐为原料，衍生化修饰炔烃，再与dspe-peg通过铜催化环加成反应连接，得到衍生化马来酸酐修饰的dspe-peg，将细胞穿透肽与合成的马来酸酐修饰的dspe-peg通过点击化学反应连接，得到细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂；
步骤三、制备糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体：
将摩尔比为(50～70):(20～40):(5～9):(1～5)的epc、cho、糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，使脂质体充分分散在水化体系中，通过聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，得到糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体。
进一步的，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
进一步的，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man，其制备方法为：
按质量体积比500mg:5ml:83mg:5ml:85μl:250μl准备好dspe-peg2000-n3、叔丁醇、对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，将dspe-peg2000-n3溶于叔丁醇中，加对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过200-300目硅胶柱得到dspe-peg2000-man。
进一步的，所述对炔烃化d-甘露糖的制备方法为：
将d-甘露糖、醋酸酐和吡啶按质量体积比10g:100ml:100ml混合，室温反应过夜，用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥旋干得到乙酰化d-甘露糖；
按质量体积比21g:100ml:22.85g:16ml准备所得乙酰化d-甘露糖、二氯甲烷、对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，将乙酰化d-甘露糖溶于二氯甲烷中，加入对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，室温反应过夜，用乙酸乙酯和氢氧化钠溶液萃取，有机相干燥旋干，重结晶得到对硝基乙酰化d-甘露糖；
按质量体积比2.43g:100ml:1.35g:3ml准备所得对硝基乙酰化d-甘露糖、甲醇、甲醇钠和三氟乙酸，将对硝基乙酰化d-甘露糖溶于甲醇中，加入甲醇钠室温反应过夜，向粗品中继续加入三氟乙酸，旋蒸除溶剂，加水溶解粗品，离心去上清，得到对硝基d-甘露糖；
按质量体积比1.07g:40ml:0.05g准备所得对硝基d-甘露糖、甲醇和钯碳，将对硝基d-甘露糖溶于甲醇中，加入钯碳，使体系在充满氢气的环境中反应1小时，抽滤，滤液过200-300目硅胶柱得到对氨基d-甘露糖；
按质量体积比1g:10ml:0.42g:0.24ml:1.85ml准备所得对氨基d-甘露糖、dmf、戊二酸酐、炔丙基胺和diea，将对氨基d-甘露糖溶于dmf中，加入戊二酸酐，室温反应30min后，再加入炔丙基胺、diea，继续室温反应1h，用二氯甲烷和水萃取，水相旋干过200-300目硅胶柱得对炔烃化d-甘露糖。
进一步的，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
进一步的，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat，其制备方法为：
(1)制备dspe-peg600-n3：
按质量体积比25g:150ml:14ml:19g:50ml准备peg600、dcm、tea、tscl和2mhcl，将peg600加入dcm和tea，搅拌使peg600溶解，冰浴至体系温度降到0℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加tscl，滴加完毕后搅拌过夜；次日向体系中加入2mhcl，搅拌15min，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物1；
按质量体积比27.45g:70ml:5.46g准备所得化合物1、dmf和nan3；将化合物1溶于dmf，加入nan3，50℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物2；
按质量体积比23.53g:100ml:75ml:6.46g准备所得化合物2、甲苯、2mhcl和pph3；将化合物2溶于甲苯和2mhcl，再加入pph3，40℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物3；
按质量体积比34.74g:100ml:9.4ml:5.8g准备所得化合物3、dcm、tea和戊二酸酐；将化合物3溶于dcm，再加入tea、戊二酸酐，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物4；
按质量体积比2.3g:20ml:350mg:580mg准备所得化合物4、dcm、nhs和edci；将化合物4溶于dcm，再加入nhs、edci，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物5；
按质量体积比2.71g:30ml:1.63g:1.2ml准备所得化合物5、dcm、dspe和tea；将化合物5溶于dcm，再加入dspe、tea，室温搅拌过夜，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-n3；
(2)制备衍生化马来酸酐修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-mal：
按质量体积比75ml:9g:8.59g准备冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸；在氮气保护条件下，混合冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸，加热回流，搅拌5h，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，旋干得化合物6；
按质量体积比2.8g:30ml:2.9g:3.81g准备所得化合物6、dcm、nhs和edci；在氮气保护条件下，混合化合物6、dcm、nhs和edci，室温搅拌8h，反应完毕后用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得化合物7；
按质量体积比2.22g:20ml:0.64ml:2.89ml准备所得化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺；在氮气保护条件下，混合化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺，室温搅拌过夜，旋干溶液，过200-300目硅胶柱得化合物8；
按质量体积比500mg:10ml:110.4mg:892μl:540μl准备dspe-peg600-n3、水-叔丁醇等体积混合液、所得化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠；在氮气保护条件下，向水-叔丁醇等体积混合液中加入dspe-peg600-n3使其溶解，再加入化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠，室温搅拌5h；反应完毕后，旋干溶液，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-mal；
(3)制备tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat：
按质量体积比10mg:4ml:15mg:2ml:2ml准备所得dspe-peg600-mal、氯仿、tat肽、甲醇和三乙胺；在氮气保护条件下，将dspe-peg600-mal溶于氯仿中，另将tat肽溶于甲醇中，混合所得溶液，并加入三乙胺，反应24h，旋干溶剂，用氯仿溶解，过滤，滤液旋干，得dspe-peg600-tat。
进一步的，步骤三所述epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat的摩尔比为60:30:7:3，或70:20:5:5，或50:40:9:1。
进一步的，步骤三所述聚碳酸酯膜的过膜处理为使用孔径为100nm的聚碳酸酯膜将所述超声处理后的水化体系反复挤出5～15次。
进一步的，所得纳米脂质体的粒径为100～160nm，带负电性。
一种所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体在制备药物载体中的应用。
进一步的，所述药物载体为靶向脑部的药物载体。
本发明的有益效果：
本发明提供的糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，充分利用具有较强穿透血脑屏障作用的糖基和具有较强细胞穿透作用的细胞穿透肽，使双修饰后的纳米脂质体兼具主动靶向于脑部和穿透细胞膜的能力。将本发明提供的脑靶向纳米脂质体用于药物载体，可使所携带的药物高效的特异性靶向脑组织并进入脑细胞发挥作用，解决了药物载体不易进入脑细胞而聚集在细胞外难以发挥药效，且易引起外周副作用的问题。经体外细胞试验和体内分布实验均证明本发明提供的脑靶向纳米脂质体可以顺利到达脑部并蓄积在脑细胞，能够长时间稳定地维持局部药物浓度，减少药量，同时又不易引起机体的不良反应，具有重要的临床意义。
附图说明
图1为实施例1制备dspe-peg2000-man的合成流程图；
图2为实施例1制备的dspe-peg2000-man的1hnmr表征图谱；
图3为实施例2制备dspe-peg600-n3的合成流程图；
图4为实施例2制备的dspe-peg600-n3的1hnmr表征图谱；
图5为实施例2制备dspe-peg600-mal的合成流程图；
图6为实施例2制备的dspe-peg600-mal的1hnmr表征图谱；
图7为实施例2制备dspe-peg600-tat的合成流程图；
图8为实施例3制备的纳米脂质体的粒径分布图；
图9为实施例3制备的纳米脂质体的zeta电位图；
图10为实施例3制备的纳米脂质体的透射电镜图；
图11为实施例7利用流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip摄取的荧光位移图；
图12为实施例7利用流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip摄取量的柱状图；
图13为实施例8利用活细胞工作站检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip的动态摄取过程图；
图14为实施例11利用小动物活体成像检测实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠体内的靶向分布图及在小鼠脑部的荧光强度对比图；
图15为实施例11利用小动物活体成像检测实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠立体的脑部荧光强度柱状图；
图16为实施例12利用小动物活体成像检测实施例9制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠体内的靶向分布图及在小鼠脑部的荧光强度对比图；
图17为实施例12利用小动物活体成像检测实施例9制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠立体的脑部荧光强度柱状图；
图18为实施例13利用小动物活体成像检测实施例10制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠体内的靶向分布图及在小鼠脑部的荧光强度对比图；
图19为实施例13利用小动物活体成像检测实施例10制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠立体的脑部荧光强度柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
本实施例提供了一种脑靶向分子甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man的制备方法：
将10gd-甘露糖溶于100ml醋酸酐和100ml吡啶中，室温反应过夜。用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥旋干得到乙酰化d-甘露糖，产率93.88％。
将21g乙酰化d-甘露糖溶于100ml二氯甲烷中，加入22.85g对硝基苯酚和16ml三氟化硼乙醚溶液，室温反应过夜。用乙酸乙酯和氢氧化钠溶液萃取，有机相干燥旋干。重结晶得到对硝基乙酰化d-甘露糖，产率70.12％。
将2.43g对硝基乙酰化d-甘露糖溶于100ml甲醇中，加入1.35g甲醇钠室温反应过夜，向粗品中继续加入3ml三氟乙酸，旋蒸除溶剂。加入20ml水溶解粗品，离心去上清，得到对硝基d-甘露糖，产率70.86％。
将1.07g对硝基d-甘露糖溶于40ml甲醇中，加入0.05g钯碳，使体系在充满氢气的环境中反应1小时。抽滤，滤液过200-300目硅胶柱，流动相为二氯甲烷和甲醇按体积比7:1配制的混合液，得到对氨基d-甘露糖，产率95.49％。
将1g对氨基d-甘露糖溶于10mldmf(二甲基甲酰胺)中，加入0.42g戊二酸酐，室温反应30min后，再加入0.24ml炔丙基胺、1.85mldiea(n,n-二异丙基乙胺)，继续室温反应1h。用二氯甲烷和水萃取，水相旋干过200-300目硅胶柱，流动相为二氯甲烷和甲醇按体积比7:1配制的混合液，得对炔烃化d-甘露糖，产率44.3％。
将500mgdspe–peg2000-n3溶于5ml叔丁醇中，加入83mg对炔烃化d-甘露糖、5ml水、85μl0.3mol/lcuso4·5h2o和1mol/l250μl抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过200-300目硅胶柱，流动相为二氯甲烷和甲醇按体积比5:1配制的混合液，得到dspe-peg2000-man，产率53.83％。
图2为本实施例制备的dspe-peg2000-man的1hnmr表征图谱；由图2所示图谱可以证明已成功合成dspe-peg2000-man。
本实施例使用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叠氮(dspe-peg2000-n3)购自上海芃硕生物科技有限公司。
实施例2
本实施例提供了一种脑靶向分子tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat的制备方法：
1、制备dspe-peg600-n3：
将25gpeg600(41.7mmol，1eq)溶解于150mldcm(二氯甲烷)和14mltea(三乙胺，166.7mmol，4eq)，搅拌使peg600溶解。冰浴，待体系温度降到0℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加19gtscl(4-甲基磺酰氯，166.7mmol，4eq)，滴加完毕后搅拌过夜。tlc监测反应。次日向体系中加入2mhcl50ml，搅拌15min，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱，流动相为pe(石油醚)和ea(乙酸乙酯)按体积比5:1配制的混合液，得化合物1，27.45g无色油状液体，产率83.92％。
27.45g所得化合物1(21mmol，1eq)溶于70mldmf，加入5.46gnan3(84mmol，4eq)，50℃加热搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，得化合物2，23.53g黄色油状液体，产率87.11％。
23.53g所得化合物2(22.4mmol，1eq)溶于100ml甲苯和75ml2mhcl，再加入6.46gpph3(24.64mmol，1.1eq)，40℃加热搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，得化合物3，19.11g黄色油状液体，产率83.3％。
34.74g化合物3(33.92mmol，1eq)溶于100mldcm，再加入9.4mltea(67.84mmol，2eq)、5.8g戊二酸酐(50.88mmol，1.5eq)，室温搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和meoh按体积比20:1配制的混合液，得化合物4，23.26g油状液体，产率60.24％。
2.3g化合物4(2.02mmol，1eq)溶于20mldcm，再加入350mgnhs(n-羟基琥珀酰亚胺，3.03mmol，1.5eq)、580mgedci(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，3.03mmol，1.5eq)，室温搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，得化合物5，2.71g无色油状液体，产率88.1％。
2.71g化合物5(2.19mmol，1eq)溶于30mldcm，再加入1.63gdspe(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，2.19mmol，1eq)、1.2mltea(8.76mmol，4eq)，室温搅拌过夜。tlc监测反应。过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和meoh按体积比10:1配制的混合液，得dspe-peg600-n3，2.56g白色固体，产率62.44％。
图4为本实施例制备的dspe-peg600-n3的1hnmr表征图谱；由图4所示图谱可以证明已成功合成聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-n3。
2、制备衍生化马来酸酐修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-mal：
在氮气保护条件下，混合75ml冰乙酸、9g马来酸酐和8.59gβ-丙氨酸，加热回流，搅拌5h；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为pe(石油醚)和ea(乙酸乙酯)按体积比1:1配制的混合液。用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，流动相为pe和ea按体积比2:1配制的混合液，旋干得6.4g白色固体即化合物6，产率41.24％。
在氮气保护条件下，混合2.8g化合物6、30mldcm、2.9gnhs和3.81gedci，室温搅拌8h；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为dcm和甲醇按体积比20:1配制的混合液。反应完毕后用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，流动相为含有2％丙酮的dcm，得2.78g白色固体即化合物7，产率63.04％。
在氮气保护条件下，混合2.22g化合物7、20mldcm、0.64ml丙炔胺和2.89ml三乙胺，室温搅拌过夜；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为dcm和甲醇按体积比20:1配制的混合液。旋干溶液，过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和甲醇按体积比60:1配制的混合液。得1g白色固体即化合物8，产率58.14％。
在氮气保护条件下，向10ml由水和叔丁醇按体积比1:1配制的混合液中加入500mgdspe-peg600-n3使其溶解。再加入110.4mg化合物8、892μl0.3mol/l的cuso4·5h2o和540μl1mol/l的抗坏血酸钠，室温搅拌5h；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为体积比为7:1的dcm和meoh的混合溶液，其中含有2％氨水。反应完毕后，旋干溶液，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和meoh按体积比20:1～10:1配制的混合溶液，其中含有1％氨水，得210mg白色固体即dspe-peg600-mal，产率37.83％。
图6为本实施例制备的dspe-peg600-mal的1hnmr表征图谱；从图6图谱中可以看出衍生化马来酸酐与dspe-peg600已连接，证明成功合成dspe-peg600-mal。
3、制备tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat：
在氮气保护条件下，将10mgdspe-peg600-mal溶于4ml氯仿中，另将15mgtat肽溶于2ml甲醇中，混合溶液，并加入2ml三乙胺，反应24h。tlc薄层色谱监测反应，展开剂为体积比为4:1的dcm和meoh溶液溶液。旋干溶剂，用氯仿溶解，过滤，滤液旋干，得12.7mg白色固体即dspe-peg600-tat，产率63.52％。
本实施例使用的tat肽由北京博奥森生物技术有限公司合成，tat肽的氨基酸序列为crkkrrqrrr。
实施例3
本实施例提供了一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法：
将epc(蛋黄磷脂酰胆碱)、cho(胆固醇)、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比60:30:7:3溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行水浴超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，得到dspe-peg2000-man联合dspe-peg600-tat修饰的脑靶向纳米脂质体，将所得纳米脂质体样品-1保存在4℃，备用。
本实施例使用的蛋黄磷脂酰胆碱(epc)和胆固醇(cho)购自biolifescience&technologyco.,ltd(中国上海)。
对本实施例所得纳米脂质体样品-1进行表征：
室温下，取去离子水1ml，再取10μl本实施例制备好的纳米脂质体样品-1，混匀后注入到动态光散射粒度仪的专用比色皿中，使用动态光散射粒度仪zetasizernanozs90测试脂质体的平均粒径和zeta电位。用透射电镜拍摄脂质体的形态。
图8为本实施例制备的纳米脂质体的粒径分布图，由图8可知纳米脂质体的粒径为120～160nm；图9为本实施例制备的纳米脂质体的zeta电位图，由图9可知纳米脂质体带负电性，图10为本实施例制备的纳米脂质体的透射电镜图；由图10可看出纳米脂质体的形态多为球形。
实施例4
本实施例提供了一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法：
将epc(蛋黄磷脂酰胆碱)、cho(胆固醇)、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比70:20:5:5溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行水浴超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，得到dspe-peg2000-man联合dspe-peg600-tat修饰的脑靶向纳米脂质体。
实施例5
本实施例提供了一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法：
将epc(蛋黄磷脂酰胆碱)、cho(胆固醇)、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比50:40:9:1溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行水浴超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，得到dspe-peg2000-man联合dspe-peg600-tat修饰的脑靶向纳米脂质体。
实施例6
为了考察脑靶向纳米脂质体的脑靶向性和细胞穿透效果，本实施例分别制备了糖基联合细胞穿透肽双配体修饰的脑靶向纳米脂质体(man tat-lip)、糖基单配体修饰纳米脂质体(man-lip)、细胞穿透肽单配体修饰纳米脂质体(tat-lip)和无修饰纳米脂质体(lip)，同时分别以罗丹明b(rho)、dio或dir对所制备的纳米脂质体进行荧光标记，用于检测纳米脂质体的体内和体外摄取情况。
以下为不同修饰方案的纳米脂质体的具体制备方法：
(1)不同荧光标记的双配体修饰的脑靶向纳米脂质体man tat-lip：
将epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比60:30:7:3用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dio(1mg/ml，50μl)、rho(3.15mg/ml,100μl)或dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dio、rho或者dir，收集透析袋中的液体，得到dio、rho或者dir标记的由糖基和细胞穿透肽双配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
(2)糖基单配体修饰纳米脂质体man-lip：
将epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-n3按摩尔比60:30:7:3用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dio(1mg/ml，50μl)、rho(3.15mg/ml,100μl)或dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dio、rho或者dir，收集透析袋中的液体，得到dio、rho或者dir标记的由糖基单配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用；
(3)细胞穿透肽单配体修饰纳米脂质体tat-lip：
将epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比60:30:7:3用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dio(1mg/ml，50μl)、rho(3.15mg/ml,100μl)或dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dio、rho或者dir，收集透析袋中的液体，得到dio、rho或者dir标记的由细胞穿透肽单配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
(4)无修饰纳米脂质体lip：
将epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-n3按摩尔比60:30:7:3用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dio(1mg/ml，50μl)、rho(3.15mg/ml,100μl)或dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dio、rho或者dir，收集透析袋中的液体，得到dio、rho或者dir标记的未修饰的脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
本实施例使用的3,3′-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate(dio)，罗丹明b(rho)和1,1'-二(十八烷基)-3,3,3'3'-四甲基-碘化二碘花青(dir)购自hede生物技术有限公司(北京，中国)。
实施例7
本实施例使用流式细胞仪检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体的摄取情况，具体方法如下：
(1)人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y的培养
在含1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清的dmem中培养sh-sy5y细胞。放置于37℃、5％co2的细胞培养箱中。
(2)流式细胞术检测sh-sy5y细胞对四种纳米脂质体的摄取情况
将细胞接种到六孔板中，并使细胞培养过夜，然后用dmem/低糖替代dmem/高糖，继续培养12小时，之后分别加入实施例6制备的dio标记的不同修饰的脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip，在37℃、5％co2下孵育细胞。空白对照组为dmem/低糖培养基。孵育4小时后，对细胞进行胰酶消化，离心，再用pbs重悬，收集细胞，使用流式细胞仪检测sh-sy5y细胞内dio的荧光强度。dio的发射波长为560nm，用fl2-a滤光片检测荧光强度，并利用flowjo7.6软件对数据进行分析。
图11本实施例利用为流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip摄取的荧光位移图；图12为本实施例利用流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip摄取量的柱状图；结果显示糖基联合细胞穿透肽双配体修饰后的纳米脂质体man tat-lip相较于单配修饰的脂质体更容易被sh-sy5y细胞摄取，这说明糖基联合细胞穿透肽双修饰后的纳米脂质体更容易穿透细胞膜进入细胞。
实施例8
本实施例利用活细胞工作站检测了sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体的摄取动态过程，具体方法如下：
(1)活细胞工作站检测细胞对药物的摄取动态过程：将sh-sy5y细胞接种于活细胞工作站专用小皿中，培养48小时，更换新的培养液，加入核染料hochest3325850μl(10μg/ml)，膜染料dio20μl(6μg/ml)，静止1.5min，倒掉培养液，pbs清洗3遍，然后加入实施例6制备的rho标记的不同修饰的脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip和游离rho，以pbs缓冲液为空白对照组。连续拍摄30min，拍摄时间间隔为15s。观察细胞对药物的摄取过程。
图13为本实施例利用活细胞工作站检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip的动态摄取过程图；由图13可以看出，糖基联合细胞穿透肽双配体修饰后的纳米脂质体man tat-lip组细胞摄取量较其他组明显增多，而且在10min开始即可快速高效的进入细胞并维持至30min，这说明双修饰后的纳米脂质体穿透细胞膜的能力得到显著提升。
实施例9
本实施例分别制备了糖基联合细胞穿透肽双配体修饰的脑靶向纳米脂质体(man tat-lip)、糖基单配体修饰纳米脂质体(man-lip)、细胞穿透肽单配体修饰纳米脂质体(tat-lip)和无修饰纳米脂质体(lip)，同时以dir对所制备的纳米脂质体进行荧光标记。
以下为不同修饰方案的纳米脂质体的具体制备方法：
(1)dir荧光标记的双配体修饰的脑靶向纳米脂质体man tat-lip：
将epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比70:20:5:5用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的由糖基和细胞穿透肽双配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
(2)dir荧光标记的糖基单配体修饰纳米脂质体man-lip：
将epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-n3按摩尔比70:20:5:5用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的由糖基单配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用；
(3)dir荧光标记的细胞穿透肽单配体修饰纳米脂质体tat-lip：
将epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比70:20:5:5用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的由细胞穿透肽单配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
(4)dir荧光标记的无修饰纳米脂质体lip：
将epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-n3按摩尔比70:20:5:5用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的未修饰的脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
实施例10
本实施例分别制备了糖基联合细胞穿透肽双配体修饰的脑靶向纳米脂质体(man tat-lip)、糖基单配体修饰纳米脂质体(man-lip)、细胞穿透肽单配体修饰纳米脂质体(tat-lip)和无修饰纳米脂质体(lip)，同时以dir对所制备的纳米脂质体进行荧光标记。
以下为不同修饰方案的纳米脂质体的具体制备方法：
(1)dir荧光标记的双配体修饰的脑靶向纳米脂质体man tat-lip：
将epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比50:40:9:1用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的由糖基和细胞穿透肽双配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
(2)dir荧光标记的糖基单配体修饰纳米脂质体man-lip：
将epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man和实施例2制备的dspe-peg600-n3按摩尔比50:40:9:1用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的由糖基单配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用；
(3)dir荧光标记的细胞穿透肽单配体修饰纳米脂质体tat-lip：
将epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-tat按摩尔比50:40:9:1用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的由细胞穿透肽单配体修饰的纳米脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
(4)dir荧光标记的无修饰纳米脂质体lip：
将epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-n3按摩尔比50:40:9:1无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中，通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的初次脂质膜；将所得初次脂质膜加入无水乙醇复溶；向溶于乙醇的脂质体中加入溶于甲醇的dir(8.33mg/ml，5μl)；用旋蒸使其再次成膜并用depc生理盐水溶解水化，通过超声处理使脂质体溶液分散，并通过聚碳酸酯膜挤出，推100nm膜10次，然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000da的透析袋中，以生理盐水透析30分钟，以除去未包封的dir，收集透析袋中的液体，得到dir标记的未修饰的脂质体，将脂质体样品保存在4℃，备用。
实施例11
本实施例用小动物活体成像检测了实施例6制备的四种纳米脂质体在小鼠体内的靶向性：
将c57bl/6小鼠用4％水合氯醛麻醉后，分别尾静脉注射等量由实施例6制备的dir染料标记的纳米脂质体lip、man-lip，tat-lip，man tat-lip和游离dir，将小鼠放于活体成像动物仓中分别拍摄x-光成像和激发波长为720nm，发射波长为790nm的荧光成像。各实验组分别于给药后1h，2h，4h，6h，8h拍摄，之后各时间点取离体脑部，荧光拍摄。
本实施例使用的健康成年c57bl/6小鼠购自吉林大学实验动物中心。
图14为本实施例利用小动物活体成像检测实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠体内的靶向分布图及在小鼠脑部的荧光强度对比图；图14显示dir标记的糖基联合细胞穿透肽双配体修饰后的纳米脂质体man tat-lip在小鼠脑中累积量(荧光强度)明显高于其他组。图15为本实施例利用小动物活体成像检测实施例6制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠立体的脑部荧光强度柱状图，图15显示离体的大脑中药物的累积量最高的是糖基联合细胞穿透肽双配体修饰后的纳米脂质体man tat-lip组，这说明双修饰后的纳米脂质体具有更强的脑部靶向能力，较于单配体修饰的man-lip和tat-lip，该双配体分子修饰的脂质体可以大幅度的提高药物穿透血脑屏障的靶向效率。
实施例12
本实施例用小动物活体成像以与实施例11相同的方法检测了实施例9制备的四种纳米脂质体在小鼠体内的靶向性。
图16为实施例12利用小动物活体成像检测实施例9制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠体内的靶向分布图及在小鼠脑部的荧光强度对比图；图17为实施例12利用小动物活体成像检测实施例9制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠立体的脑部荧光强度柱状图。
实施例13
本实施例用小动物活体成像以与实施例11相同的方法检测了实施例10制备的四种纳米脂质体在小鼠体内的靶向性。
图18为实施例13利用小动物活体成像检测实施例10制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠体内的靶向分布图及在小鼠脑部的荧光强度对比图；图19为实施例13利用小动物活体成像检测实施例10制备的四种纳米脂质体lip、man-lip、tat-lip、man tat-lip在c57bl/6小鼠立体的脑部荧光强度柱状图。
从图16-图19可以看出，糖基联合细胞穿透肽双配体修饰后的纳米脂质体man tat-lip在小鼠脑中累积量(荧光强度)明显高于其他组。同时，离体的大脑中药物的累积量最高的是糖基联合细胞穿透肽双配体修饰后的纳米脂质体man tat-lip组。这一结果与图14、图15显示的结果相同，这说明以不同的epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat摩尔比制备的糖及联合细胞穿透肽双修饰的纳米脂质体均具备较强的脑部靶向能力和穿透细胞膜能力。
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<110>哈尔滨医科大学
<120>一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用
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<213>tat肽
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1510
1.一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，包含摩尔比为(50～70):(20～40):(5～9):(1～5)的epc、cho、糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂。
2.根据权利要求1所述一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
3.根据权利要求2所述一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man。
4.根据权利要求1-3任一所述一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
5.根据权利要求4所述一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat。
6.根据权利要求5所述一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat的摩尔比为60:30:7:3，或70:20:5:5，或50:40:9:1。
7.一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、制备糖基修饰聚乙二醇化磷脂：
将dspe-peg-n3溶于叔丁醇中，加入糖基、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过硅胶柱得到糖基修饰聚乙二醇化磷脂；
步骤二、制备细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂：
以马来酸酐为原料，衍生化修饰炔烃，再与dspe-peg通过铜催化环加成反应连接，得到衍生化马来酸酐修饰的dspe-peg，将细胞穿透肽与合成的马来酸酐修饰的dspe-peg通过点击化学反应连接，得到细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂；
步骤三、制备糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体：
将摩尔比为(50～70):(20～40):(5～9):(1～5)的epc、cho、糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，使脂质体充分分散在水化体系中，通过聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，得到糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体。
8.根据权利要求7所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
9.根据权利要求8所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man，其制备方法为：
按质量体积比500mg:5ml:83mg:5ml:85μl:250μl准备好dspe-peg2000-n3、叔丁醇、对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，将dspe-peg2000-n3溶于叔丁醇中，加对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过200-300目硅胶柱得到dspe-peg2000-man。
10.根据权利要求9所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述对炔烃化d-甘露糖的制备方法为：
将d-甘露糖、醋酸酐和吡啶按质量体积比10g:100ml:100ml混合，室温反应过夜，用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥旋干得到乙酰化d-甘露糖；
按质量体积比21g:100ml:22.85g:16ml准备所得乙酰化d-甘露糖、二氯甲烷、对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，将乙酰化d-甘露糖溶于二氯甲烷中，加入对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，室温反应过夜，用乙酸乙酯和氢氧化钠溶液萃取，有机相干燥旋干，重结晶得到对硝基乙酰化d-甘露糖；
按质量体积比2.43g:100ml:1.35g:3ml准备所得对硝基乙酰化d-甘露糖、甲醇、甲醇钠和三氟乙酸，将对硝基乙酰化d-甘露糖溶于甲醇中，加入甲醇钠室温反应过夜，向粗品中继续加入三氟乙酸，旋蒸除溶剂，加水溶解粗品，离心去上清，得到对硝基d-甘露糖；
按质量体积比1.07g:40ml:0.05g准备所得对硝基d-甘露糖、甲醇和钯碳，将对硝基d-甘露糖溶于甲醇中，加入钯碳，使体系在充满氢气的环境中反应1小时，抽滤，滤液过200-300目硅胶柱得到对氨基d-甘露糖；
按质量体积比1g:10ml:0.42g:0.24ml:1.85ml准备所得对氨基d-甘露糖、dmf、戊二酸酐、炔丙基胺和diea，将对氨基d-甘露糖溶于dmf中，加入戊二酸酐，室温反应30min后，再加入炔丙基胺、diea，继续室温反应1h，用二氯甲烷和水萃取，水相旋干过200-300目硅胶柱得对炔烃化d-甘露糖。
11.根据权利要求7-10任一所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
12.根据权利要求11所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat，其制备方法为：
(1)制备dspe-peg600-n3：
按质量体积比25g:150ml:14ml:19g:50ml准备peg600、dcm、tea、tscl和2mhcl，将peg600加入dcm和tea，搅拌使peg600溶解，冰浴至体系温度降到0℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加tscl，滴加完毕后搅拌过夜；次日向体系中加入2mhcl，搅拌15min，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物1；
按质量体积比27.45g:70ml:5.46g准备所得化合物1、dmf和nan3；将化合物1溶于dmf，加入nan3，50℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物2；
按质量体积比23.53g:100ml:75ml:6.46g准备所得化合物2、甲苯、2mhcl和pph3；将化合物2溶于甲苯和2mhcl，再加入pph3，40℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物3；
按质量体积比34.74g:100ml:9.4ml:5.8g准备所得化合物3、dcm、tea和戊二酸酐；将化合物3溶于dcm，再加入tea、戊二酸酐，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物4；
按质量体积比2.3g:20ml:350mg:580mg准备所得化合物4、dcm、nhs和edci；将化合物4溶于dcm，再加入nhs、edci，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物5；
按质量体积比2.71g:30ml:1.63g:1.2ml准备所得化合物5、dcm、dspe和tea；将化合物5溶于dcm，再加入dspe、tea，室温搅拌过夜，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-n3；
(2)制备衍生化马来酸酐修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-mal：
按质量体积比75ml:9g:8.59g准备冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸；在氮气保护条件下，混合冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸，加热回流，搅拌5h，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，旋干得化合物6；
按质量体积比2.8g:30ml:2.9g:3.81g准备所得化合物6、dcm、nhs和edci；在氮气保护条件下，混合化合物6、dcm、nhs和edci，室温搅拌8h，反应完毕后用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得化合物7；
按质量体积比2.22g:20ml:0.64ml:2.89ml准备所得化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺；在氮气保护条件下，混合化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺，室温搅拌过夜，旋干溶液，过200-300目硅胶柱得化合物8；
按质量体积比500mg:10ml:110.4mg:892μl:540μl准备dspe-peg600-n3、水-叔丁醇等体积混合液、所得化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠；在氮气保护条件下，向水-叔丁醇等体积混合液中加入dspe-peg600-n3使其溶解，再加入化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠，室温搅拌5h；反应完毕后，旋干溶液，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-mal；
(3)制备tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat：
按质量体积比10mg:4ml:15mg:2ml:2ml准备所得dspe-peg600-mal、氯仿、tat肽、甲醇和三乙胺；在氮气保护条件下，将dspe-peg600-mal溶于氯仿中，另将tat肽溶于甲醇中，混合所得溶液，并加入三乙胺，反应24h，旋干溶剂，用氯仿溶解，过滤，滤液旋干，得dspe-peg600-tat。
13.根据权利要求12所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤三中epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat的摩尔比为60:30:7:3，或70:20:5:5，或50:40:9:1。
14.根据权利要求13所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤三所述聚碳酸酯膜的过膜处理为使用孔径为100nm的聚碳酸酯膜将所述超声处理后的水化体系反复挤出5～15次。
15.根据权利要求14所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所得纳米脂质体的粒径为100～160nm，带负电性。
16.一种如权利要求1-6任一所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体在制备药物载体中的应用。
17.根据权利要求16所述糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体在制备药物载体中的应用，所述药物载体为靶向脑部的药物载体。
技术总结