本发明属于靶向给药
技术领域：
，尤其涉及一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用。
背景技术：
：随着人口老龄化，包括血管性痴呆和阿尔兹海默症的老年痴呆症患病率逐年升高。临床上常用药物主要为多奈哌齐、加兰他敏等胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂美金刚。但是，这些药物仅具有较弱的缓解症状的作用，并不能够延缓疾病的进程。随着分子生物学理论和技术的发展，设计与认知功能障碍发生密切相关的基因药物有望成为治疗老年痴呆症的新希望。尽管老年痴呆症的机制尚未完全阐明，β淀粉样蛋白(amyloidβpeptide,aβ)沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经元死亡、炎症反应、突触可塑性等仍然是临床和基础研究中的经典病理改变。然而，目前针对这些单一靶点的药物研究都以临床研究失败而告终。这些结果说明：开发多靶点治疗药物可能是未来治疗老年痴呆症的有效途径。自1993年报道了micrornas(mirnas)可以通过转录后调节蛋白的表达发挥生物学作用以来，mirnas的研究就成为了生物医学研究的明星领域。mirnas在老年痴呆中的作用研究也不例外。以往研究已经发现多个mirnas可以调节淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,app)和β-分泌酶(β-site,appcleavingenzyme1,bace1)的表达,参与aβ的形成和聚集过程。本课题组研究发现：采用双侧颈总动脉结扎(2vo)术构建的长期大脑低灌注(cbh)动物模型表现为明显的学习记忆下降。在与记忆密切相关的脑区(海马、皮层、基底前脑)中，mir-195表达下降。随后的系列研究发现，mir-195以多靶点调控的方式参与了cbh大鼠脑内aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经元死亡，炎症反应，递质释放障碍等病理改变。因此，mir-195可能成为潜在的多靶点的治疗药物用于老年痴呆症的治疗。然而，核酸治疗药物的稳定性差、不能穿透血脑屏障(blood-brainbarriers,bbb)是阻碍其成药的关键问题。技术实现要素：为提高mir-195核酸治疗药物的稳定性和血脑屏障穿透性，本发明提供了一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用。本发明的技术方案：一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，以含有糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂的脑靶向纳米脂质体为药物载体，所述药物载体内包载有正电聚合物/mir-195复合物。进一步的，具体组分包括摩尔比为(50～70):(20～40):(5～9):(1～5):(0.1～1)的epc、cho、糖基修饰聚乙二醇化磷脂、细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂和正电聚合物/mir-195复合物。进一步的，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。进一步的，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man。进一步的，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。进一步的，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat。进一步的，所述正电聚合物/mir-195复合物中正电聚合物与mir-195的质量比为(1～10)：(1～10)。进一步的，所述正电聚合物为pei、pdma、ema、鱼精蛋白或壳聚糖中的一种。进一步的，所述mir-195的核酸序列为mir-195拟似物、修饰的mir-195拟似物或mir-195前体拟似物中的一种。进一步的，所述正电聚合物为pei，所述pei与mir-195按质量比6:7.33复配得到pei/mir-195复合物。进一步的，epc、cho、dspe-peg2000-man、dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物的摩尔比为60:30:7:3:0.1，或70:20:5:5:0.5，或50:40:9:1:1。一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，步骤如下：步骤一、制备糖基修饰聚乙二醇化磷脂：将dspe-peg-n3溶于叔丁醇中，加入糖基、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过硅胶柱得到糖基修饰聚乙二醇化磷脂；步骤二、制备细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂：以马来酸酐为原料，衍生化修饰炔烃，再与dspe-peg通过铜催化环加成反应连接，得到衍生化马来酸酐修饰的dspe-peg，将细胞穿透肽与合成的马来酸酐修饰的dspe-peg通过点击化学反应连接，得到细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂；步骤三、制备正电聚合物/mir-195复合物：将正电聚合物和mir-195分别溶解于depc生理盐水中，将正电聚合物溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液，常温静置30min，得到正电聚合物/mir-195复合物；步骤四、制备载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体：按摩尔比(50～70):(20～40):(5～9):(1～5):(0.1～1)准备epc、cho、步骤一制备的糖基修饰聚乙二醇化磷脂、步骤二制备的细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂和步骤三制备的正电聚合物/mir-195复合物，将epc、cho、步骤一制备的糖基修饰聚乙二醇化磷脂和步骤二制备的细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂溶解于无水乙醇中，减压旋干得到脂质膜，用步骤三制备的含有正电聚合物/mir-195复合物的depc生理盐水水化所得脂质膜，对所得水化体系进行超声处理，使脂质体充分分散在水化体系中，通过聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，得到载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体。进一步的，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。进一步的，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man，其制备方法为：按质量体积比500mg:5ml:83mg:5ml:85μl:250μl准备好dspe-peg2000-n3、叔丁醇、对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，将dspe-peg2000-n3溶于叔丁醇中，加对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过200-300目硅胶柱得到dspe-peg2000-man。进一步的，所述对炔烃化d-甘露糖的制备方法为：将d-甘露糖、醋酸酐和吡啶按质量体积比10g:100ml:100ml混合，室温反应过夜，用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥旋干得到乙酰化d-甘露糖；按质量体积比21g:100ml:22.85g:16ml准备所得乙酰化d-甘露糖、二氯甲烷、对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，将乙酰化d-甘露糖溶于二氯甲烷中，加入对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，室温反应过夜，用乙酸乙酯和氢氧化钠溶液萃取，有机相干燥旋干，重结晶得到对硝基乙酰化d-甘露糖；按质量体积比2.43g:100ml:1.35g:3ml准备所得对硝基乙酰化d-甘露糖、甲醇、甲醇钠和三氟乙酸，将对硝基乙酰化d-甘露糖溶于甲醇中，加入甲醇钠室温反应过夜，向粗品中继续加入三氟乙酸，旋蒸除溶剂，加水溶解粗品，离心去上清，得到对硝基d-甘露糖；按质量体积比1.07g:40ml:0.05g准备所得对硝基d-甘露糖、甲醇和钯碳，将对硝基d-甘露糖溶于甲醇中，加入钯碳，使体系在充满氢气的环境中反应1小时，抽滤，滤液过200-300目硅胶柱得到对氨基d-甘露糖；按质量体积比1g:10ml:0.42g:0.24ml:1.85ml准备所得对氨基d-甘露糖、dmf、戊二酸酐、炔丙基胺和diea，将对氨基d-甘露糖溶于dmf中，加入戊二酸酐，室温反应30min后，再加入炔丙基胺、diea，继续室温反应1h，用二氯甲烷和水萃取，水相旋干过200-300目硅胶柱得对炔烃化d-甘露糖。进一步的，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。进一步的，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat，其制备方法为：(1)制备dspe-peg600-n3：按质量体积比25g:150ml:14ml:19g:50ml准备peg600、dcm、tea、tscl和2mhcl，将peg600加入dcm和tea，搅拌使peg600溶解，冰浴至体系温度降到0℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加tscl，滴加完毕后搅拌过夜；次日向体系中加入2mhcl，搅拌15min，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物1；按质量体积比27.45g:70ml:5.46g准备所得化合物1、dmf和nan3；将化合物1溶于dmf，加入nan3，50℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物2；按质量体积比23.53g:100ml:75ml:6.46g准备所得化合物2、甲苯、2mhcl和pph3；将化合物2溶于甲苯和2mhcl，再加入pph3，40℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物3；按质量体积比34.74g:100ml:9.4ml:5.8g准备所得化合物3、dcm、tea和戊二酸酐；将化合物3溶于dcm，再加入tea、戊二酸酐，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物4；按质量体积比2.3g:20ml:350mg:580mg准备所得化合物4、dcm、nhs和edci；将化合物4溶于dcm，再加入nhs、edci，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物5；按质量体积比2.71g:30ml:1.63g:1.2ml准备所得化合物5、dcm、dspe和tea；将化合物5溶于dcm，再加入dspe、tea，室温搅拌过夜，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-n3；(2)制备衍生化马来酸酐修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-mal：按质量体积比75ml:9g:8.59g准备冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸；在氮气保护条件下，混合冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸，加热回流，搅拌5h，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，旋干得化合物6；按质量体积比2.8g:30ml:2.9g:3.81g准备所得化合物6、dcm、nhs和edci；在氮气保护条件下，混合化合物6、dcm、nhs和edci，室温搅拌8h，反应完毕后用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得化合物7；按质量体积比2.22g:20ml:0.64ml:2.89ml准备所得化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺；在氮气保护条件下，混合化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺，室温搅拌过夜，旋干溶液，过200-300目硅胶柱得化合物8；按质量体积比500mg:10ml:110.4mg:892μl:540μl准备dspe-peg600-n3、水-叔丁醇等体积混合液、所得化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠；在氮气保护条件下，向水-叔丁醇等体积混合液中加入dspe-peg600-n3使其溶解，再加入化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠，室温搅拌5h；反应完毕后，旋干溶液，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-mal；(3)制备tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat：按质量体积比10mg:4ml:15mg:2ml:2ml准备所得dspe-peg600-mal、氯仿、tat肽、甲醇和三乙胺；在氮气保护条件下，将dspe-peg600-mal溶于氯仿中，另将tat肽溶于甲醇中，混合所得溶液，并加入三乙胺，反应24h，旋干溶剂，用氯仿溶解，过滤，滤液旋干，得dspe-peg600-tat。进一步的，步骤三所述正电聚合物/mir-195复合物中正电聚合物与mir-195的质量比为(1～10)：(1～10)。进一步的，步骤三所述正电聚合物为pei、pdma、ema、鱼精蛋白或壳聚糖中的一种。进一步的，步骤三所述mir-195的核酸序列为mir-195拟似物、修饰的mir-195拟似物或mir-195前体拟似物中的一种。进一步的，步骤三所述正电聚合物为pei，所述pei与mir-195按质量比6:7.33复配得到pei/mir-195复合物。进一步的，步骤四中epc、cho、dspe-peg2000-man、dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物的摩尔比为60:30:7:3:0.1，或70:20:5:5:0.5，或50:40:9:1:1。进一步的，步骤四所述聚碳酸酯膜的过膜处理为使用孔径为100nm的聚碳酸酯膜将所述超声处理后的水化体系反复挤出5～15次。进一步的，步骤四所得纳米脂质体的粒径为120～160nm，所得纳米脂质体中mir-195的包封率不低于70％，48h体外释放率低于35％。一种所述载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体在制备治疗阿尔兹海默症和脑缺血引起的血管性痴呆的药物中的应用。进一步的，所述阿尔兹海默症和脑缺血引起的血管性痴呆的症状主要包括阿尔兹海默症和脑缺血引起的认知功能障碍。本发明的有益效果：本发明根据受体介导靶向给药系统设计原理，将正电聚合物吸附mir-195后包载入由糖基和细胞穿透肽修饰的纳米脂质体中，特异性靶向脑组织治疗血管性痴呆和阿尔茨海默症，尤其是由脑缺血和阿尔兹海默症引起的认知功能障碍。本发明通过正电聚合物与mir-195带负电的磷酸基团形成带正电的复合物，既可以压缩mir-195体积使其便于包载和递送，还可以帮助mir-195实现溶酶体逃逸而不被细胞内溶酶体降解，并将mir-195递送至细胞内。本发明利用糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体为药物载体，改善循环中mir-195的稳定性，避免了机体微环境变化对mir-195的破坏，提高了其生物效应。本发明提供的糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体充分利用具有较强穿透血脑屏障作用的糖基和具有较强细胞穿透作用的细胞穿透肽，使双修饰后的纳米脂质体兼具主动靶向于脑部和穿透细胞膜的能力，可使所携带的药物高效的特异性靶向脑组织并进入脑细胞发挥作用。本发明通过水合法在纳米脂质体中包载正电聚合物吸附的mir-195，并在脂质体表面修饰细胞穿透肽和糖基，使得该脂质体具有了靶向脑部、抑制aβ聚集，tau蛋白过度磷酸化，神经元树突退化、神经元的死亡和小胶质细胞极化的作用。经体外细胞试验、体内分布实验、药效学评价等实验均证明该脂质体可以使mir-195不被体内核酶降解而顺利到达脑部并蓄积和释放。药效学评价显示，经尾静脉注射给药，该脂质体可以明显改善双侧颈总动脉结扎引起血管性痴呆大鼠、app/ps1和mir-195条件敲除小鼠的学习记忆能力。附图说明图1为实施例1制备dspe-peg2000-man的合成流程图；图2为实施例1制备的dspe-peg2000-man的1hnmr表征图谱；图3为实施例2制备dspe-peg600-n3的合成流程图；图4为实施例2制备的dspe-peg600-n3的1hnmr表征图谱；图5为实施例2制备dspe-peg600-mal的合成流程图；图6为实施例2制备的dspe-peg600-mal的1hnmr表征图谱；图7为实施例2制备dspe-peg600-tat的合成流程图；图8为实施例4制备的四种载药纳米脂质体的体外释放率对比图；图9为实施例5利用流式细胞术检测sh-sy5y细胞对实施例4制备的四种载药纳米脂质体和游离cy3-mir-195摄取的荧光位移图；图10为实施例5利用流式细胞术检测sh-sy5y细胞对实施例4制备的四种载药纳米脂质体和游离cy3-mir-195摄取量的柱状图；图11为实施例6利用qrt-pcr技术检测注射实施例3制备的载药脂质体dpmt195与未注射小鼠海马和皮层mir-195的表达水平对比图；图12为实施例7中barnes迷宫实验训练期不同敲除小鼠接触目标的潜伏期对比图；图13为实施例7中barnes迷宫实验探索期不同敲除小鼠接触目标的潜伏期对比图；图14为实施例8中barnes迷宫实验训练期不同app/ps1转基因小鼠接触目标的潜伏期对比图；图15为实施例8中barnes迷宫实验探索期不同app/ps1转基因小鼠接触目标的潜伏期对比图；图16为实施例9中morris水迷宫实验训练期不同大鼠接触平台的潜伏期对比图；图17为实施例9中morris水迷宫实验探索期不同大鼠穿越平台次数对比图；图18为实施例9中morris水迷宫实验探索期不同大鼠在目标象限游泳距离百分比对比图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。实施例1本实施例提供了一种脑靶向分子甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man的制备方法：将10gd-甘露糖溶于100ml醋酸酐和100ml吡啶中，室温反应过夜。用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥旋干得到乙酰化d-甘露糖，产率93.88％。将21g乙酰化d-甘露糖溶于100ml二氯甲烷中，加入22.85g对硝基苯酚和16ml三氟化硼乙醚溶液，室温反应过夜。用乙酸乙酯和氢氧化钠溶液萃取，有机相干燥旋干。重结晶得到对硝基乙酰化d-甘露糖，产率70.12％。将2.43g对硝基乙酰化d-甘露糖溶于100ml甲醇中，加入1.35g甲醇钠室温反应过夜，向粗品中继续加入3ml三氟乙酸，旋蒸除溶剂。加入20ml水溶解粗品，离心去上清，得到对硝基d-甘露糖，产率70.86％。将1.07g对硝基d-甘露糖溶于40ml甲醇中，加入0.05g钯碳，使体系在充满氢气的环境中反应1小时。抽滤，滤液过200-300目硅胶柱，流动相为二氯甲烷和甲醇按体积比7:1配制的混合液，得到对氨基d-甘露糖，产率95.49％。将1g对氨基d-甘露糖溶于10mldmf(二甲基甲酰胺)中，加入0.42g戊二酸酐，室温反应30min后，再加入0.24ml炔丙基胺、1.85mldiea(n,n-二异丙基乙胺)，继续室温反应1h。用二氯甲烷和水萃取，水相旋干过200-300目硅胶柱，流动相为二氯甲烷和甲醇按体积比7:1配制的混合液，得对炔烃化d-甘露糖，产率44.3％。将500mgdspe–peg2000-n3溶于5ml叔丁醇中，加入83mg炔烃化d-甘露糖、5ml水、85μl0.3mol/lcuso4·5h2o和1mol/l250μl抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过200-300目硅胶柱，流动相为二氯甲烷和甲醇按体积比5:1配制的混合液，得到dspe-peg2000-man，产率53.83％。图2为本实施例制备的dspe-peg2000-man的1hnmr表征图谱；由图2所示图谱可以证明已成功合成dspe-peg2000-man。本实施例使用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叠氮(dspe-peg2000-n3)购自上海芃硕生物科技有限公司。实施例2本实施例提供了一种脑靶向分子tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat的制备方法：1、制备dspe-peg600-n3：将25gpeg600(41.7mmol，1eq)溶解于150mldcm(二氯甲烷)和14mltea(三乙胺，166.7mmol，4eq)，搅拌使peg600溶解。冰浴，待体系温度降到0℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加19gtscl(4-甲基磺酰氯，166.7mmol，4eq)，滴加完毕后搅拌过夜。tlc监测反应。次日向体系中加入2mhcl50ml，搅拌15min，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱，流动相为pe(石油醚)和ea(乙酸乙酯)按体积比5:1配制的混合液，得化合物1，27.45g无色油状液体，产率83.92％。27.45g所得化合物1（21mmol，1eq)溶于70mldmf，加入5.46gnan3(84mmol，4eq)，50℃加热搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，得化合物2，23.53g黄色油状液体，产率87.11％。23.53g所得化合物2(22.4mmol，1eq)溶于100ml甲苯和75ml2mhcl，再加入6.46gpph3(24.64mmol，1.1eq)，40℃加热搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，得化合物3，19.11g黄色油状液体，产率83.3％。34.74g化合物3(33.92mmol，1eq)溶于100mldcm，再加入9.4mltea(67.84mmol，2eq)、5.8g戊二酸酐(50.88mmol，1.5eq)，室温搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和meoh按体积比20:1配制的混合液，得化合物4，23.26g油状液体，产率60.24％。2.3g化合物4(2.02mmol，1eq)溶于20mldcm，再加入350mgnhs(n-羟基琥珀酰亚胺，3.03mmol，1.5eq)、580mgedci(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，3.03mmol，1.5eq)，室温搅拌过夜。tlc监测反应。用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，得化合物5，2.71g无色油状液体，产率88.1％。2.71g化合物5(2.19mmol，1eq)溶于30mldcm，再加入1.63gdspe(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，2.19mmol，1eq)、1.2mltea(8.76mmol，4eq)，室温搅拌过夜。tlc监测反应。过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和meoh按体积比10:1配制的混合液，得dspe-peg600-n3，2.56g白色固体，产率62.44％。图4为本实施例制备的dspe-peg600-n3的1hnmr表征图谱；由图4所示图谱可以证明已成功合成聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-n3。2、制备衍生化马来酸酐修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-mal：在氮气保护条件下，混合75ml冰乙酸、9g马来酸酐和8.59gβ-丙氨酸，加热回流，搅拌5h；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为pe(石油醚)和ea(乙酸乙酯)按体积比1:1配制的混合液。用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，流动相为pe和ea按体积比2:1配制的混合液，旋干得6.4g白色固体即化合物6，产率41.24％。在氮气保护条件下，混合2.8g化合物6、30mldcm、2.9gnhs和3.81gedci，室温搅拌8h；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为dcm和甲醇按体积比20:1配制的混合液。反应完毕后用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，流动相为含有2％丙酮的dcm，得2.78g白色固体即化合物7，产率63.04％。在氮气保护条件下，混合2.22g化合物7、20mldcm、0.64ml丙炔胺和2.89ml三乙胺，室温搅拌过夜；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为dcm和甲醇按体积比20:1配制的混合液。旋干溶液，过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和甲醇按体积比60:1配制的混合液。得1g白色固体即化合物8，产率58.14％。在氮气保护条件下，向10ml由水和叔丁醇按体积比1:1配制的混合液中加入500mgdspe-peg600-n3使其溶解。再加入110.4mg化合物8、892μl0.3mol/l的cuso4·5h2o和540μl1mol/l的抗坏血酸钠，室温搅拌5h；tlc薄层色谱监测反应，展开剂为体积比为7:1的dcm和meoh的混合溶液，其中含有2％氨水。反应完毕后，旋干溶液，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，流动相为dcm和meoh按体积比20:1～10:1配制的混合溶液，其中含有1％氨水，得210mg白色固体即dspe-peg600-mal，产率37.83％。图6为本实施例制备的dspe-peg600-mal的1hnmr表征图谱；从图6图谱中可以看出衍生化马来酸酐与dspe-peg600已连接，证明成功合成dspe-peg600-mal。3、制备tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat：在氮气保护条件下，将10mgdspe-peg600-mal溶于4ml氯仿中，另将15mgtat肽溶于2ml甲醇中，混合溶液，并加入2ml三乙胺，反应24h。tlc薄层色谱监测反应，展开剂为体积比为4:1的dcm和meoh溶液溶液。旋干溶剂，用氯仿溶解，过滤，滤液旋干，得12.7mg白色固体即dspe-peg600-tat，产率63.52％。本实施例使用的tat肽由北京博奥森生物技术有限公司合成，tat肽的氨基酸序列为crkkrrqrrr。实施例3本实施例提供了一种载有pei/mir-195复合物的糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体pei/mir-195 man tat-lip(dpmt195)的制备方法：1、制备pei/mir-195复合物：将6.0μgpei与7.33μgmir-195分别溶解于500μldepc生理盐水中，将pei溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液中，常温静置30分钟，即形成pei/mir-195复合物。2、制备man tat-lip：按摩尔比60:30:7:3:0.1准备epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man、实施例2制备的dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物；将epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用含有所得pei/mir-195复合物的depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，然后将所得脂质体混合溶液置于截留分子量为30kda的透析袋中，以生理盐水透析30min，去除透过液中未包封的游离药物mir-195，收集透析袋内的液体得到载有pei/mir-195复合物的糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体——pei/mir-195 man tat-lip，记作dpmt195，将所得纳米脂质体样品保存在4℃，备用。本实施例使用的蛋黄磷脂酰胆碱(epc)和胆固醇(cho)购自biolifescience&technologyco.,ltd(上海，中国)；本实施例使用的mir-195购自上海吉玛制药技术有限公司(上海，中国)。对比例1本对比例提供了一种载有pei/mir-195复合物的糖基单修饰的脑靶向纳米脂质体pei/mir-195 man-lip的制备方法：1、制备pei/mir-195复合物：将6.0μgpei与7.33μgmir-195分别溶解于500μldepc生理盐水中，将pei溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液中，常温静置30分钟，即可形成pei/mir-195复合物。2、制备man-lip：按摩尔比60:30:7:3:0.1准备epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man、实施例2制备的dspe-peg600-n3和pei/mir-195复合物；将epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-n3溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用含有所得pei/mir-195复合物的depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，然后将所得脂质体混合溶液置于截留分子量为30kda的透析袋中，以生理盐水透析30min，去除透过液中未包封的游离药物mir-195，收集透析袋内的液体得到载有pei/mir-195复合物的糖基单修饰的脑靶向纳米脂质体——pei/mir-195 man-lip，将所得纳米脂质体样品保存在4℃，备用。对比例2本对比例提供了一种载有pei/mir-195复合物的细胞穿透肽单修饰的脑靶向纳米脂质体pei/mir-195 tat-lip的制备方法：1、制备pei/mir-195复合物：将6.0μgpei与7.33μgmir-195分别溶解于500μldepc生理盐水中，将pei溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液中，常温静置30分钟，即可形成pei/mir-195复合物。2、制备tat-lip：按摩尔比60:30:7:3:0.1准备epc、cho、dspe-peg2000-n3和实施例2制备的dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物；将epc、cho、dspe-peg2000-n3和dspe-peg600-tat溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用含有所得pei/mir-195复合物的depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，然后将所得脂质体混合溶液置于截留分子量为30kda的透析袋中，以生理盐水透析30min，去除透过液中未包封的游离药物mir-195，收集透析袋内的液体得到载有pei/mir-195复合物的细胞穿透肽单修饰的脑靶向纳米脂质体——pei/mir-195 tat-lip，将所得纳米脂质体样品保存在4℃，备用。对比例3本对比例提供了一种载有pei/mir-195复合物的无修饰的脑靶向纳米脂质体pei/mir-195 lip的制备方法：1、制备pei/mir-195复合物：将6.0μgpei与7.33μgmir-195分别溶解于500μldepc生理盐水中，将pei溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液中，常温静置30分钟，即形成pei/mir-195复合物。2、制备无修饰纳米脂质体lip：按摩尔比60:30:7:3:0.1准备epc、cho、dspe-peg2000-n3、实施例2制备的dspe-peg600-n3和pei/mir-195复合物；将epc、cho、dspe-peg2000-n3和dspe-peg600-n3溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用含有所得pei/mir-195复合物的depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，然后将所得脂质体混合溶液置于截留分子量为30kda的透析袋中，以生理盐水透析30min，去除透过液中未包封的游离药物mir-195，收集透析袋内的液体得到载有pei/mir-195复合物的无修饰的脑靶向纳米脂质体——pei/mir-195 lip，将所得纳米脂质体样品保存在4℃，备用。实施例4本实施例采用与实施例3、对比例1-3相同的配比和制备方法，以cy3-mir-195代替mir-195分别制备了如下四种载药脂质体：糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体pei/cy3-mir-195 man tat-lip；糖基单修饰的脑靶向纳米脂质体pei/cy3-mir-195 man-lip；细胞穿透肽单修饰的脑靶向纳米脂质体pei/cy3-mir-195 tat-lip；无修饰的脑靶向纳米脂质体pei/cy3-mir-195 lip。本实施例使用的cy3-mir-195购自上海吉玛制药技术有限公司(上海，中国)。cy3是一种荧光染料，在检测脂质体性质时可作为一种标记物。对本实施例制备的四种载药纳米脂质体pei/cy3-mir-195 man tat-lip、pei/cy3-mir-195 man-lip、pei/cy3-mir-195 tat-lip、pei/cy3-mir-195 lip和pei/cy3-mir-195复合物进行了表征及包封率、体外释放效果的测定：1、纳米脂质体的表征：室温下，取去离子水1ml，分别取四种载药纳米脂质体和pei/cy3-mir-195复合物各10μl，混匀后注入到动态光散射粒度仪的专用比色皿中，使用动态光散射粒度仪zetasizernanozs90测试脂质体的平均粒径和zeta电位。2、纳米脂质体包封率的测定：分别取2ml四种载药纳米脂质体，以20000×g，离心30分钟，将上清液保留，以epc和cho按质量比40:10制备的空白脂质体lip的上清液为对照，利用荧光分光分度计检测cy3-mir-195的吸光度值，并绘制标准吸收曲线，根据公式包封率(％)＝(cy3-mir-195总的加入量-上清液中cy3-mir-195的量)/cy3-mir-195总的加入量×100％，求算载药脂质体中cy3-mir-195的包封率。各脂质体的粒径、zeta电位、包封率和释放率见表1：表1由表1数据可以看出，脂质体的平均粒径为120～160nm，带负电性，包封率均达到70％以上；通过pdi—多分散系数数值的对比可以看出，三种修饰的脂质体其pdi值均小于0.3，说明三种修饰的脂质体的粒径大小分布均较好。3、脂质体的体外释放实验分别取1ml四种载药纳米脂质体，放入分子截留量为30kda的透析袋中，然后将其放于100ml用depc水处理过的pbs透析液(ph＝7.4)中，在37℃磁力搅拌下透析，分别在透析后1，2，4，6，18，24和48小时取2ml透析外液，同上方法检测荧光值，进而求得其浓度值，根据公式：释放率(％)＝(t1 t2 t3 t4 t5)/t总×100％(t总：总药量(10μg)；t＝c×v；c：释放浓度(μg/l)；v：透析液体积(10ml)，得出各时间点释放度。图8为本实施例制备的四种载药纳米脂质体的体外释放率对比图；由图8可以看出脂质体48小时体外释放率低于35％，说明药物较好的存留在细胞内，有较好的缓释效果。实施例5本实施例使用流式细胞仪检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例4制备的四种载药纳米脂质体的摄取情况：(1)人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y的培养在含1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清的dmem中培养sh-sy5y细胞。放置于37℃、5％co2的细胞培养箱中。(2)流式细胞术检测sh-sy5y细胞对不同脂质体的摄取情况将细胞接种到六孔板中，并使细胞培养过夜，然后用dmem/低糖替代dmem/高糖，继续培养12小时，之后分别加实施例4制备的四种载药纳米脂质体，以及未被包被、溶于dmso中游离cy3-mir-195；在37℃、5％co2下孵育细胞。空白对照组为dmem/低糖培养基。孵育4小时后，对细胞进行胰酶消化，离心，再用pbs重悬，收集细胞，进行检测。流式细胞仪检测细胞内cy3的荧光强度。cy3的发射波长为600nm，用fl2-a滤光片检测荧光强度，并利用flowjo7.6软件对数据进行分析。图9为本实施例利用流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例4制备的四种载药纳米脂质体和游离cy3-mir-195摄取的荧光位移图；图10为本实施例利用流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y细胞对实施例4制备的四种载药纳米脂质体和游离cy3-mir-195摄取量的柱状图；结果显示双配体修饰后的纳米脂质体相较于单配修饰的脂质体更容易被sh-sy5y细胞摄取，这说明双修饰后的纳米脂质体更容易穿透细胞膜进入细胞。实施例6本实施例利用qrt-pcr技术检测正常c57bl/6小鼠静脉注射实施例3制备的载有pei/mir-195复合物的糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体dpmt195后，脑内mir-195的摄取情况。实验方法：设置两组正常c57bl/6小鼠；一组为正常给药组(dpmt195)：由小鼠尾静脉注射实施例3制备的载药纳米脂质体，注射剂量为0.5mg/kg。另一组为未注射纳米脂质体的对照组。注射3天后取材观察注射dpmt195组和未注射组小鼠海马和皮层mir-195的表达水平，验证给药组脑内mir-195摄取情况：(1)脑组织rna的提取每50-100mg脑组织样品在液氮中磨碎，加入1ml的trizol试剂，进行匀浆处理。将匀浆样品在室温(15-30℃)下放置5min，使核酸蛋白质复合物完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。2-8℃10000×g离心15min。样品分三层：底层为黄色有机物，上层为无色的水相和一个中间层，rna主要在水相中。将水相转移至新管中，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。2-8℃10000×g离心10min。离心后在管侧和管底出现rna沉淀，移去上清。加入1mldepc水配制的75％酒精，洗涤rna沉淀。2-8℃7500×g离心5min。弃上清。室温放置干燥rna沉淀，5-10min后，加入depc水溶解rna。用紫外分光光度计检测rna浓度，记录a260/280比值，其在1.8-2.0之间为佳。获得的rna溶液保存于-80℃备用。(2)逆转录根据appliedbiosystems(abi)的high-capacitycdnareversetranscriptionkit操作步骤进行逆转录反应。逆转录引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggccaatat。将所需试剂放置于冰上至其完全融化，轻弹混匀。所加试剂剂量如表2所示：表210×rtbuffer2μl25×dntpmix(100μm)0.8μlmultiscribereversetranscriptase1μl10×rtmirna-1952μlu6primers2μltotalrna1μgnucleasefreewater至20μl反应条件为：25℃10min，37℃120min，85℃5min，最后温度降至4℃，产物于-20℃保存。(3)pcr采用appliedbiosystems公司的7500fastreal-timepcr仪器运行此实验。pcr引物：f：acactccagctgggtagcagcacagaaatattg；r：ctcaactggtgtcgtgga。反应条件为：95℃10min预变性，95℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，共40个循环。溶解曲线为：95℃30sec，60℃1min，95℃30sec，60℃1min。(4)结果分析在此实验中，目的基因与管家基因扩增效率相同，数学推导得出公式：目的基因量＝2-△△ct，而△△ct＝(ct目的基因－ct管家基因)实验组－(ct目的基因－ct管家基因)对照组，即实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。根据此公式计算出目的基因的相对含量，利用t检验统计数据进行分析。图11为本实施例利用qrt-pcr技术检测注射实施例3制备的载药脂质体dpmt195与未注射小鼠海马和皮层mir-195的表达水平对比图；结果显示尾静脉注射糖基联合细胞穿透肽修饰并载有正电聚合物/mir-195复合物的脂质体(dpmt195)的小鼠海马(hippo)和皮层(cortex)mir-195的表达水平均较较未注射组表达水平明显增高。这说明dpmt195能够穿透血脑屏障进入中枢神经系统，且外源导入的mir-195成功进入脑内并实现高表达。本实施例使用的mir-195pcrmastermix(powersybrgreenpcr)试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司(上海，中国)。实施例7本实施例使用条件敲除mir-195小鼠(ko小鼠)评价实施例3制备的载药脂质体dpmt195对小鼠学习和记忆的影响：barnes迷宫实验是经典的测定动物对于目标的空间记忆能力的方法。实验动物分为三组：野生型小鼠(wt)、条件敲除mir-195小鼠1月龄(ko1m)、条件敲除mir-195小鼠1月龄 尾静脉注射实施例3制备的载药脂质体(ko1m dpmt195)。尾静脉注射dpmt195的注射剂量为0.5mg/kg，2周给药一次，一共给药2次。行为学检测第1-6天，训练小鼠在风和光的环境下进入逃避空洞。休息3天，在第10天撤掉逃避空洞，观察小鼠在到达逃避空洞位置的潜伏期。图12为本实施例中barnes迷宫实验训练期不同小鼠接触目标的潜伏期对比图；图13为本实施例中barnes迷宫实验探索期不同小鼠接触目标的潜伏期对比图；由图12和图13可以看出，本发明提供的载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体dpmt195能够明显缩短条件敲除mir-195小鼠到达逃避孔洞的潜伏期，改善小鼠的认知能力。原因在于，本发明提供的纳米脂质体能够靶向小鼠脑部，穿透小鼠血脑屏障进入小鼠脑细胞中积聚并释放mir-195，发挥药效。实施例8本实施例使用app/ps1转基因小鼠评价实施例3制备的载药脂质体dpmt195对小鼠学习和记忆的影响：同样使用barnes迷宫实验进行空间记忆的评估，实验动物分为三组：野生型小鼠6月龄(wt)、app/ps1转基因小鼠6月龄(app/ps1)、app/ps1转基因小鼠6月龄(app/ps1) 尾静脉注射实施例3制备的载药脂质体(app/ps1 dpmt195)。尾静脉注射dpmt195的注射剂量为0.5mg/kg，每2周给药1次，一共给药2次。行为学测试第1-6天，训练小鼠在风和光的环境下进入逃避空洞。休息3天，在第10天撤掉逃避空洞，观察小鼠在到达逃避空洞位置的潜伏期。图14为本实施例中barnes迷宫实验训练期不同app/ps1转基因小鼠接触目标的潜伏期对比图，图15为本实施例中barnes迷宫实验探索期不同app/ps1转基因小鼠接触目标的潜伏期对比图；由图14和图15可以看出，本发明提供的载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体dpmt195能够明显缩短app/ps1转基因小鼠的到达孔洞的潜伏期，改善老年痴呆小鼠的认知能力。原因在于，本发明提供的载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体dpmt195能够靶向小鼠脑部，穿透小鼠血脑屏障进入小鼠脑细胞中积聚并释放mir-195，发挥药效。实施例9本实施例使用双侧颈总动脉结扎(2vo)大鼠评价实施例3制备的载药脂质体dpmt195对脑缺血大鼠学习和记忆的影响：采用永久性结扎双侧颈总动脉(2vo)的方法建立血管性痴呆动物模型：大鼠术前12h禁食。用2％戊巴比妥钠25mg/kg腹腔注射麻醉后，动物仰卧固定，颈部备皮，酒精消毒，颈部正中切口，钝性分离暴露双侧颈总动脉并将其永久性结扎。饲养8周后进行各项指标的检测。2vo法制作的血管性痴呆模型具有导致痴呆的时程长等特点，这种方法实质上是以慢性低灌注引起脑缺血缺氧，最终导致神经细胞功能下降、学习记忆功能障碍，较好地模拟了人类因动脉粥样硬化、动脉管腔狭窄等因素导致的血管性痴呆。使用morris水迷宫实验进行空间记忆的评估，实验动物分为三组：假手术组(sham)、2vo组和2vo 尾静脉注射实施例3制备的载药脂质体(app/ps1 dpmt195)组。尾静脉注射dpmt195的注射剂量为0.35mg/kg，每2周给药1次，一共给药4次。行为学测试第1-5天，训练小鼠在水池中的定位航行能力。连续测试5d，计算每天潜逃期平均值，以评价动物学习记忆的能力。在第6天撤走平台，将大鼠从平台所在象限的对侧象限如前述操作投入水中，记录大鼠120s穿过平台所在位置的次数和目的象限的路程百分比。评价动物的记忆能力。图16为本实施例中水迷宫实验训练期给药和未给药2vo大鼠接触目标的潜伏期对比图，图17为本实施例中水迷宫实验探索期给药和未给药2vo大鼠在目标象限的穿越平台的次数对比；图18为本实施例中水迷宫实验探索期给药和未给药2vo大鼠在目标象限的游泳距离对比。由图16、图17和图18可以看出，本发明提供的载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体dpmt195能够明显缩短2vo大鼠到达目标平台的潜伏期，改善2vo大鼠的学习和记忆能力。原因在于，本发明提供的载药纳米脂质体dpmt195能够靶向大鼠脑部，穿透大鼠血脑屏障进入大鼠脑细胞中积聚并释放mir-195，发挥药效。实施例10本实施例提供了一种载有pei/mir-195复合物的糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体mir-195 man tat-lip的制备方法：1、制备pei/mir-195复合物：将6.0μgpei与7.33μgmir-195分别溶解于500μldepc生理盐水中，将pei溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液中，常温静置30分钟，即形成pei/mir-195复合物。2、制备man tat-lip：按摩尔比70:20:5:5:0.5准备epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man、实施例2制备的dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物；将epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用含有所得pei/mir-195复合物的depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，然后将所得脂质体混合溶液置于截留分子量为30kda的透析袋中，以生理盐水透析30min，去除透过液中未包封的游离药物mir-195，收集透析袋内的液体得到载有pei/mir-195复合物的糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体-载药脂质体-10，将所得纳米脂质体样品保存在4℃，备用。实施例11本实施例提供了一种载有pei/mir-195复合物的糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体mir-195 man tat-lip的制备方法：1、制备pei/mir-195复合物：将6.0μgpei与7.33μgmir-195分别溶解于500μldepc生理盐水中，将pei溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液中，常温静置30分钟，即形成pei/mir-195复合物。2、制备man tat-lip：按摩尔比50:40:9:1:1准备epc、cho、实施例1制备的dspe-peg2000-man、实施例2制备的dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物；将epc、cho、dspe-peg2000-man和dspe-peg600-tat溶解于无水乙醇中，减压旋干得到初次脂质膜，将所得初次脂质膜用无水乙醇重溶并再次旋干得到二次脂质膜，将所得二次脂质膜用含有所得pei/mir-195复合物的depc生理盐水溶解水化，对所得水化体系进行超声处理，500w超声功率处理5min，使脂质体充分分散在水化体系中，通过孔径为100nm的聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，即反复挤出10次，然后将所得脂质体混合溶液置于截留分子量为30kda的透析袋中，以生理盐水透析30min，去除透过液中未包封的游离药物mir-195，收集透析袋内的液体得到载有pei/mir-195复合物的糖基和细胞穿透肽双修饰的脑靶向纳米脂质体-载药脂质体-11，将所得纳米脂质体样品保存在4℃，备用。利用实施例10制备的载药脂质体-10和实施例11制备的载药脂质体-11进行与实施例9相同的使用双侧颈总动脉结扎(2vo)大鼠评价载药脂质体对脑缺血大鼠学习和记忆实验，实验结果统计数据结果如表3-表6所示。载药脂质体-10：表3：水迷宫实验检测载药脂质体-10对2vo大鼠训练期到达潜伏期的影响表4：水迷宫实验检测载药脂质体-10对2vo大鼠空间探索实验穿越平台次数和目标象限游泳距离％的影响载药脂质体-11：表5：水迷宫实验检测载药脂质体-11对2vo大鼠训练期到达潜伏期的影响表6：水迷宫实验检测载药脂质体-11对2vo大鼠空间探索实验穿越平台次数和目标象限游泳距离％的影响由表4-表6的数据结果可以看出，实施例10制备的载药脂质体-10和实施例11制备的载药脂质体-11都能够明显缩短2vo大鼠到达目标平台的潜伏期，改善2vo大鼠的学习和记忆能力。这说明本发明提供的不同的epc、cho、dspe-peg2000-man、dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物摩尔比制备的载药脂质体都能够靶向大鼠脑部，穿透大鼠血脑屏障进入大鼠脑细胞中积聚并释放mir-195，发挥药效。sequencelisting<110>哈尔滨医科大学<120>一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用<130>1<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>10<212>prt<213>tat肽<400>1cysarglyslysargargglnargargarg1510当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，以含有糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂的脑靶向纳米脂质体为药物载体，所述药物载体内包载有正电聚合物/mir-195复合物。
2.根据权利要求1所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，具体组分包括摩尔比为(50～70):(20～40):(5～9):(1～5):(0.1～1)的epc、cho、糖基修饰聚乙二醇化磷脂、细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂和正电聚合物/mir-195复合物。
3.根据权利要求1或2所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
4.根据权利要求3所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man。
5.根据权利要求4所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
6.根据权利要求5所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat。
7.根据权利要求6所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述正电聚合物/mir-195复合物中正电聚合物与mir-195的质量比为(1～10)：(1～10)。
8.根据权利要求7所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述正电聚合物为pei、pdma、ema、鱼精蛋白或壳聚糖中的一种。
9.根据权利要求8所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述mir-195的核酸序列为mir-195拟似物、修饰的mir-195拟似物或mir-195前体拟似物中的一种。
10.根据权利要求9所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，所述正电聚合物为pei，所述pei与mir-195按质量比6:7.33复配得到pei/mir-195复合物。
11.根据权利要求10所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体，其特征在于，epc、cho、dspe-peg2000-man、dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物的摩尔比为60:30:7:3:0.1，或70:20:5:5:0.5，或50:40:9:1:1。
12.一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、制备糖基修饰聚乙二醇化磷脂：
将dspe-peg-n3溶于叔丁醇中，加入糖基、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过硅胶柱得到糖基修饰聚乙二醇化磷脂；
步骤二、制备细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂：
以马来酸酐为原料，衍生化修饰炔烃，再与dspe-peg通过铜催化环加成反应连接，得到衍生化马来酸酐修饰的dspe-peg，将细胞穿透肽与合成的马来酸酐修饰的dspe-peg通过点击化学反应连接，得到细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂；
步骤三、制备正电聚合物/mir-195复合物：
将正电聚合物和mir-195分别溶解于depc生理盐水中，将正电聚合物溶液搅拌并缓慢加入mir-195溶液，常温静置30min，得到正电聚合物/mir-195复合物；
步骤四、制备载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体：
按摩尔比(50～70):(20～40):(5～9):(1～5):(0.1～1)准备epc、cho、步骤一制备的糖基修饰聚乙二醇化磷脂、步骤二制备的细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂和步骤三制备的正电聚合物/mir-195复合物，将epc、cho、步骤一制备的糖基修饰聚乙二醇化磷脂和步骤二制备的细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂溶解于无水乙醇中，减压旋干得到脂质膜，用步骤三制备的含有正电聚合物/mir-195复合物的depc生理盐水水化所得脂质膜，对所得水化体系进行超声处理，使脂质体充分分散在水化体系中，通过聚碳酸酯膜对超声处理后的水化体系进行过膜处理，得到载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体。
13.根据权利要求12所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中的糖基为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽二糖或麦芽三糖中的一种，所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
14.根据权利要求13所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤一所述糖基修饰聚乙二醇化磷脂为甘露糖修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg2000-man，其制备方法为：
按质量体积比500mg:5ml:83mg:5ml:85μl:250μl准备好dspe-peg2000-n3、叔丁醇、对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，将dspe-peg2000-n3溶于叔丁醇中，加对炔烃化d-甘露糖、水、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠，室温反应过夜；所得粗品用水和二氯甲烷萃取，有机相干燥旋干；过200-300目硅胶柱得到dspe-peg2000-man。
15.根据权利要求14所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，所述对炔烃化d-甘露糖的制备方法为：
将d-甘露糖、醋酸酐和吡啶按质量体积比10g:100ml:100ml混合，室温反应过夜，用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥旋干得到乙酰化d-甘露糖；
按质量体积比21g:100ml:22.85g:16ml准备所得乙酰化d-甘露糖、二氯甲烷、对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，将乙酰化d-甘露糖溶于二氯甲烷中，加入对硝基苯酚和三氟化硼乙醚溶液，室温反应过夜，用乙酸乙酯和氢氧化钠溶液萃取，有机相干燥旋干，重结晶得到对硝基乙酰化d-甘露糖；
按质量体积比2.43g:100ml:1.35g:3ml准备所得对硝基乙酰化d-甘露糖、甲醇、甲醇钠和三氟乙酸，将对硝基乙酰化d-甘露糖溶于甲醇中，加入甲醇钠室温反应过夜，向粗品中继续加入三氟乙酸，旋蒸除溶剂，加水溶解粗品，离心去上清，得到对硝基d-甘露糖；
按质量体积比1.07g:40ml:0.05g准备所得对硝基d-甘露糖、甲醇和钯碳，将对硝基d-甘露糖溶于甲醇中，加入钯碳，使体系在充满氢气的环境中反应1小时，抽滤，滤液过200-300目硅胶柱得到对氨基d-甘露糖；
按质量体积比1g:10ml:0.42g:0.24ml:1.85ml准备所得对氨基d-甘露糖、dmf、戊二酸酐、炔丙基胺和diea，将对氨基d-甘露糖溶于dmf中，加入戊二酸酐，室温反应30min后，再加入炔丙基胺、diea，继续室温反应1h，用二氯甲烷和水萃取，水相旋干过200-300目硅胶柱得对炔烃化d-甘露糖。
16.根据权利要求12-15任一所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中的细胞穿透肽为tat肽、map肽、kala肽、pptg肽或pep-1肽中的一种，所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂中聚乙二醇的分子量为600～5000da。
17.根据权利要求16所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤二所述细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂为tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat，其制备方法为：
(1)制备dspe-peg600-n3：
按质量体积比25g:150ml:14ml:19g:50ml准备peg600、dcm、tea、tscl和2mhcl，将peg600加入dcm和tea，搅拌使peg600溶解，冰浴至体系温度降到0℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加tscl，滴加完毕后搅拌过夜；次日向体系中加入2mhcl，搅拌15min，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物1；
按质量体积比27.45g:70ml:5.46g准备所得化合物1、dmf和nan3；将化合物1溶于dmf，加入nan3，50℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物2；
按质量体积比23.53g:100ml:75ml:6.46g准备所得化合物2、甲苯、2mhcl和pph3；将化合物2溶于甲苯和2mhcl，再加入pph3，40℃加热搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物3；
按质量体积比34.74g:100ml:9.4ml:5.8g准备所得化合物3、dcm、tea和戊二酸酐；将化合物3溶于dcm，再加入tea、戊二酸酐，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干，过200-300目硅胶柱得化合物4；
按质量体积比2.3g:20ml:350mg:580mg准备所得化合物4、dcm、nhs和edci；将化合物4溶于dcm，再加入nhs、edci，室温搅拌过夜，用二氯甲烷和水萃取，有机相干燥旋干得化合物5；
按质量体积比2.71g:30ml:1.63g:1.2ml准备所得化合物5、dcm、dspe和tea；将化合物5溶于dcm，再加入dspe、tea，室温搅拌过夜，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-n3；
(2)制备衍生化马来酸酐修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-mal：
按质量体积比75ml:9g:8.59g准备冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸；在氮气保护条件下，混合冰乙酸、马来酸酐和β-丙氨酸，加热回流，搅拌5h，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱，旋干得化合物6；
按质量体积比2.8g:30ml:2.9g:3.81g准备所得化合物6、dcm、nhs和edci；在氮气保护条件下，混合化合物6、dcm、nhs和edci，室温搅拌8h，反应完毕后用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得化合物7；
按质量体积比2.22g:20ml:0.64ml:2.89ml准备所得化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺；在氮气保护条件下，混合化合物7、dcm、丙炔胺和三乙胺，室温搅拌过夜，旋干溶液，过200-300目硅胶柱得化合物8；
按质量体积比500mg:10ml:110.4mg:892μl:540μl准备dspe-peg600-n3、水-叔丁醇等体积混合液、所得化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠；在氮气保护条件下，向水-叔丁醇等体积混合液中加入dspe-peg600-n3使其溶解，再加入化合物8、0.3mol/l的cuso4·5h2o和1mol/l的抗坏血酸钠，室温搅拌5h；反应完毕后，旋干溶液，用二氯甲烷和水萃取，过200-300目硅胶柱得dspe-peg600-mal；
(3)制备tat肽修饰聚乙二醇化磷脂dspe-peg600-tat：
按质量体积比10mg:4ml:15mg:2ml:2ml准备所得dspe-peg600-mal、氯仿、tat肽、甲醇和三乙胺；在氮气保护条件下，将dspe-peg600-mal溶于氯仿中，另将tat肽溶于甲醇中，混合所得溶液，并加入三乙胺，反应24h，旋干溶剂，用氯仿溶解，过滤，滤液旋干，得dspe-peg600-tat。
18.根据权利要求17所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤三所述正电聚合物/mir-195复合物中正电聚合物与mir-195的质量比为(1～10)：(1～10)。
19.根据权利要求18所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤三所述正电聚合物为pei、pdma、ema、鱼精蛋白或壳聚糖中的一种。
20.根据权利要求19所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤三所述mir-195的核酸序列为mir-195拟似物、修饰的mir-195拟似物或mir-195前体拟似物中的一种。
21.根据权利要求20所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤三所述正电聚合物为pei，所述pei与mir-195按质量比6:7.33复配得到pei/mir-195复合物。
22.根据权利要求21所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤四中epc、cho、dspe-peg2000-man、dspe-peg600-tat和pei/mir-195复合物的摩尔比为60:30:7:3:0.1，或70:20:5:5:0.5，或50:40:9:1:1。
23.根据权利要求22所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤四所述聚碳酸酯膜的过膜处理为使用孔径为100nm的聚碳酸酯膜将所述超声处理后的水化体系反复挤出5～15次。
24.根据权利要求23所述一种载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体的制备方法，其特征在于，步骤四所得纳米脂质体的粒径为120～160nm，所得纳米脂质体中mir-195的包封率不低于70％，48h体外释放率低于35％。
25.一种如权利要求1-11任一所述载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体在制备治疗阿尔兹海默症和脑缺血引起的血管性痴呆的药物中的应用。
26.根据权利要求25所述载有正电聚合物/mir-195复合物的脑靶向纳米脂质体在制备治疗阿尔兹海默症和脑缺血引起的血管性痴呆的药物中的应用，所述阿尔兹海默症和脑缺血引起的血管性痴呆的症状主要包括阿尔兹海默症和脑缺血引起的认知功能障碍。
技术总结本发明涉及一种载有正电聚合物/miR‑195复合物的脑靶向纳米脂质体及其制备方法与应用，属于靶向给药技术领域。为提高核酸治疗药物的稳定性和血脑屏障穿透性，本发明提供了一种载有正电聚合物/miR‑195复合物的脑靶向纳米脂质体，以含有糖基修饰聚乙二醇化磷脂和细胞穿透肽修饰聚乙二醇化磷脂的脂质体为药物载体包载正电聚合物/miR‑195复合物。本发明通过正电聚合物和药物载体提高了miR‑195的稳定性，通过糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体提高了药物靶向脑部并穿透细胞膜的能力，使所携带的药物高效的特异性靶向脑组织治疗阿尔茨海默症和血管性痴呆，尤其是由阿尔兹海默症和脑缺血引起的认知功能障碍。
技术研发人员：艾静;彭海生;苏丹;陈重
受保护的技术使用者：哈尔滨医科大学
技术研发日：2020.02.26
技术公布日：2020.06.09
