本发明涉及化学药物合成领域，特别是涉及一种核壳结构刺激响应型药物载体的制备方法及药物释放方法。
背景技术：
目前，磁性介孔二氧化硅在生物医学方面应用广泛，主要由于其具有表面易修饰、良好生物相容性、较大的比表面积、高孔容和可调的孔道直径等显著优势，而且磁性粒子的存在，可使载药的磁性介孔二氧化硅在外加磁场的作用下可以直接送达病灶部位，实现靶向给药，降低药物的毒副作用。
nasrallah等采用双相系统中的剪切界面组装合成了生物相容的核-壳结构磁性介孔二氧化硅微球，成功将胰蛋白酶固定在微球上得到fe3o4@rf@msio2，其均匀尺寸约为600nm，垂直介孔为6.0nm，大孔体积为0.77cm3/g。研究结果表明，这些具有固定化胰蛋白酶的磁性微球可根据分子量的不同选择性酶解蛋白质。通过斑马鱼模型的毒理学测试，得出微球对斑马鱼胚胎没有整体急性毒性，致畸性或神经毒性。将抗癌药物吉西他滨(gem)装载到微球上，发现微球显示出ph响应特性，这有利于癌症治疗下的gem释放。egodawatte等[56]将抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-fu)装载到磁性介孔二氧化硅纳米复合材料中，使用三种不同的溶剂(水，水/丙酮，二甲基亚砜)，深入了解不同溶剂如何影响胺基改性磁性介孔二氧化硅对于5-fu装载和释放。研究表明，溶剂的极性不仅影响材料的负载能力，还影响装载到材料中的5-fu的释放百分比。当使用水和水/丙酮作为溶剂时，胺基改性材料与5-fu的较大氢键结合能力导致5-fu的较低释放。chen等开发了一种具有磁性核的多功能治疗磁性介孔二氧化硅纳米粒子(mmsns)，用于肿瘤靶向磁共振成像和精确控制治疗。通过铂(iv)前药连接将β-环糊精(β-cd)固定在介孔二氧化硅壳的表面，用于在细胞内通过还原反应触发药物释放。再通过主-客体相互作用将arg-gly-asp(rgd)肽配体进一步引入到β-cd上用于靶向治疗癌症的目的。在靶向癌细胞的活性内吞作用后，mmsns中的铂(iv)前药将恢复为活性铂(ii)药物，以响应癌细胞中固有的还原微环境，导致β-cd网脱离，同时触发包埋在mmsns中的抗癌药物多柔比星(dox)原位释放，从而杀死癌细胞。研究发现在外部磁场的作用下，载有药物的mmsn在体内磁共振成像(mri)中显示出高对比度，并且在癌症部位中表现出磁性增强的有效积聚，显著抑制癌细胞的生长且毒副作用最小。an等以带有二硒键(se-se)的硅烷偶联剂改性磁性介孔二氧化硅，再进一步接枝叶酸，开发了一种新型的还原反应型靶向药物递送系统。该纳米复合材料具有显着的gsh触发响应药物释放，并且随着gsh浓度的增加，dox释放明显增强。与人体正常细胞相比，该载体更易于被hela癌细胞摄取，并且表现出更高的细胞毒性。
刺激响应型药物载体具有诸多优势，其不仅能够提高药物的稳定性，克服溶解度差、生物利用度低、缺乏选择性等问题，而且可以根据剂量、治疗持续时间和治疗位置来控制药物释放，从而提高药物治疗效果，减小对正常组织的毒副作用。
技术实现要素：
本发明目的是以fe3o4/msio2为核，以p(maa-co-nipam)为壳，mba为交联剂，经聚合反应后制备出具有核壳结构可控释放的药物载体fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)。并提出药物载体控制药物释放的方法。
本发明采用以下的技术方案：核壳结构刺激响应型药物载体的制备方法，步骤一：制备四氧化三铁纳米粒子fe3o4；步骤二：制备磁性介孔二氧化硅fe3o4/msio2；步骤三：合成fe3o4/msio2-mps；其中，步骤四：每一单位fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的合成，原料用料比例为，将0.1gfe3o4/msio2-mps、0.1g甲基丙烯酸maa、0.4gn-异丙基丙烯酰胺nipam和40ml蒸馏水加入到100ml三口烧瓶中，机械搅拌均匀，将60mg过硫酸铵和60mg亚硫酸氢钠溶解于5ml蒸馏水中，将其加入到三口烧瓶中，40℃下搅拌反应10min，最后将溶解于5ml蒸馏水的0.08gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺mba，加入到上述反应体系中，氮气保护下反应6h，反应结束，磁分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，50℃真空干燥，即得复合粒子核壳结构刺激响应型药物载体fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)。
核壳结构刺激响应型药物载体的药物释放方法，其中，药物以载体fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox通过改变ph值和温度来控制药物释放量。所述ph值为6，所述温度为40℃。
与现有技术相比本发明有益效果为：本发明提供了一种核壳结构刺激响应型药物载体的制备方法以及以此为载体的药物释放方法。该药物载体可将药物输送到所需的组织，器官，细胞和亚细胞，并通过人体正常组织与肿瘤组织的环境差异(如ph、温度、酶、还原性谷胱甘肽等)或无创外部刺激(如光、电、磁场等)来实现药物的按需释放，从而提高药物治疗效果，减小对正常组织的毒副作用。磁性介孔二氧化硅因其具有表面易修饰、良好生物相容性、较大的比表面积、高孔容和可调的孔径等显著优势，而且可在外加磁场的作用下直接到达病灶部位，实现靶向给药。
附图说明
图1fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的制备示意图；
图2mba用量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响图；
图3nipam用量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响图；
图4反应时间对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能的影响图；
图5引发剂对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能的影响图；
图6溶剂量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能的影响图；
图7fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox在不同ph下的释药性能图；
图8fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox在不同温度下的释药性能图。
具体实施方式
实施例1：
步骤一：采用溶剂热法制备四氧化三铁纳米粒子fe3o4，将1.35gfecl3·6h2o、1.8g醋酸钠naac加入到装有30ml乙二醇的聚四氟乙烯内胆中，超声15min，再加入0.29g柠檬酸钠，持续超声使其形成均匀的黄色溶液，将包含上述溶液的聚四氟乙烯内胆转移至高压反应釜中，200℃下反应10h，反应结束，自然冷却至室温，通过外加磁场分离，无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，50℃真空干燥，即得四氧化三铁纳米粒子fe3o4。
步骤二：fe3o4/msio2的制备，将0.5gfe3o4、1g十六烷基三甲基溴化铵ctab、20ml蒸馏水和200ml无水乙醇加入到500ml三口烧瓶中，超声分散均匀，再将3ml正硅酸乙酯teos加入到上述溶液中搅拌15min；然后在30℃条件下，缓慢滴加4ml氨水，快速搅拌反应18h，反应结束，通过外加磁场分离，无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，室温真空干燥24h，再将干燥后的产物转移至马弗炉中，以1℃/min的速率升高到550℃，并在550℃下继续焙烧6h，自然冷却至室温，即得磁性介孔二氧化硅fe3o4/msio2。
步骤三：fe3o4/msio2-mps的合成，将0.5gfe3o4/msio2、200ml无水乙醇和10ml蒸馏水加入到500ml三口烧瓶中，超声分散均匀，升温至60℃，加入5mlkh-570，氮气保护下反应12h，反应结束，磁分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，50℃真空干燥即得fe3o4/msio2-mps。
步骤四：每一单位fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的合成，原料用料比例如下，将0.1gfe3o4/msio2-mps、0.1g甲基丙烯酸maa、0.4gn-异丙基丙烯酰胺nipam和40ml蒸馏水加入到100ml三口烧瓶中，机械搅拌均匀，将60mg过硫酸铵和60mg亚硫酸氢钠溶解于5ml蒸馏水中，将其加入到三口瓶中，40℃下搅拌反应10min，最后将溶解于5ml蒸馏水的0.08gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺mba，加入到上述反应体系中，氮气保护下反应6h，反应结束，磁分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，50℃真空干燥，即得复合粒子fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)。
采用单一变量法，依次考察交联剂(mba)、温敏单体(nipam)、反应时间、氧化还原型引发剂(nahso3、(nh4)2s2o8)和溶剂用量五个因素对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的平衡吸附量的影响，探究fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的最佳制备工艺条件。
1)mba用量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响
在0.1gfe3o4/msio2-mps，0.1gmaa，0.4gnipam，60ml蒸馏水，60mg(nh4)2s2o8，60mgnahso3和反应时间8h条件下，改变交联剂的用量分别为0.04g、0.06g、0.08g、0.10g和0.12g，考察不同产物对100mg/l的dox溶液吸附结果如图2。
由图2可知，交联剂的用量显著影响fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的吸附能力。随着mba用量的增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量先增加后减少。当mba用量为0.08g时，吸附量达到最大。交联剂用量较少时，聚合物不能形成稳定的交联结构，但在交联剂用量较多时，复合材料交联程度过高，分子链之间交联过于紧密，影响材料的溶胀与收缩，吸附位点较少，并且dox在fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)中传质速度变慢，故mba的最佳用量为0.08g。
2)nipam用量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响
在0.1gfe3o4/msio2-mps，0.1gmaa，0.08gmba，60ml蒸馏水，60mg(nh4)2s2o8，60mgnahso3和反应时间8h的条件下，改变nipam的用量分别为0.2g、0.4g、0.6g、0.8g和1g，结果如图3。
由图3可知，随着nipam用量的增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量先增加后减少。在nipam用量为0.4g时，平衡吸附量达到最大。fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的吸附量是由介孔二氧化硅和表面聚合物共同决定的。nipam含有酰胺基团可与dox通过氢键作用力连接，当nipam用量较少时，材料的吸附位点较少，且相对交联剂的用量较多，导致交联程度较大，故吸附量较低；当nipam用量较多时，介孔材料表面包裹聚合物过多，dox不易进入介孔内，且分子链间容易团聚，致使载体吸附量减小，故nipam的最佳用量为0.4g。
3)反应时间对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响
在0.1gfe3o4/msio2-mps，0.1gmaa，0.4gnipam，0.08gmba，60ml蒸馏水，60mg(nh4)2s2o8和60mgnahso3的条件下，改变反应时间分别为1h、2h、3h、6h和8h，结果如图4。
由图4可知，随着反应时间的增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量逐渐增加，当到达6h时，吸附量达到平衡而后不在变化。当反应时间较少时，磁性介孔二氧化硅表面包裹聚合物过少，可吸附dox的官能团羧基、酰胺基团等含量较少，吸附量较低；当反应时间达到6h时，聚合反应完全，吸附位点最多，时间继续增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的吸附量几乎不变，故反应时间最佳为6h。
4)复合引发剂最佳用量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响
在0.1gfe3o4/msio2-mps，0.1gmaa，0.4gnipam，0.08gmba，60ml蒸馏水和反应时间6h条件下，改变复合引发剂(nahso3与(nh4)2s2o8质量比为1：1)的用量分别为40mg、80mg、120mg、160mg和200mg，结果如图5。
由图5可知，随着复合引发剂用量的增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量先增加后减少，在(nh4)2s2o8和nahso3用量均达到60mg时，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量达到最大。当引发剂用量较少时，自由基含量过低，聚合反应速率较慢，在6h时间内未反应完全，吸附位点较少。当引发剂用量较多时，聚合体系产生的单体自由基含量过多，聚合速率过快，分子链间容易交联聚合，团聚较严重，且单体分子间更容易发生均聚反应，致使吸附位点减少，导致fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量下降。
5)溶剂的用量对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)吸附性能影响
在0.1gfe3o4/msio2-mps，0.1gmaa，0.4gnipam，0.08gmba，60mg(nh4)2s2o8，60mgnahso3和反应时间6h的条件下，改变溶剂用量(蒸馏水)分别为40ml、50ml、60ml、70ml和80ml，结果如图6。
由图6可知，随着溶剂用量的增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的平衡吸附量先增加再逐渐降低。在溶剂量为50ml时，平衡吸附量达到最大值为79.07mg/g。当溶剂量较小时，引发剂与交联剂溶度相对较大，反应速率过快，且交联程度较大，吸附量较小；当溶剂量较多时，单体溶度较低，聚合体系自由基含量过少，聚合反应不易发生，致使磁性介孔二氧化硅表面接枝聚合物含量过低，吸附量下降，故蒸馏水的最佳用量为50ml。
以最大吸附量为标准，通过单因素实验法确定材料的最佳制备条件。当fe3o4/msio2-mps用量0.1g，maa用量0.1g，nipam用量0.4g，mba用量0.08g，60mg(nh4)2s2o8，60mgnahso3，溶剂用量50ml和反应时间6h时，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对100mg/l的dox吸附量达到最大值79.07mg/g。
实施例2
核壳结构刺激响应型药物载体的药物释放方法，其中，药物以载体fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox通过改变ph值和温度来控制药物释放量。最佳ph值为6，最佳温度为40℃。
1、fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的释药性能测试
1)不同ph下fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)释药性能测试
称取一定量的fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)置于浓度为150mg/l的dox溶液中，避光振荡吸附12h。离心取上清液测dox剩余浓度，进而计算载药质量，并将载药后的fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox冷冻干燥。
再称取5份0.1g的fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox分别加入到含有10ml不同ph值(3、4、5、6和7.4)的pbs缓冲溶液中，在37℃下进行缓释。在特定时间(1h、2h、3h、4h、5h、7h、10h、12h、24h、36h和48h)离心取上清液3ml，测量溶液吸光度，又同时加入3ml对应ph值的pbs缓冲溶液，维持溶液总体积不变，最终计算药物累积释放率。
2)不同温度下fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)释药性能测试
称取4份0.1g的fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox分别加入到含有10mlph值为6的pbs缓冲溶液中，在不同温度(30℃、35℃、40℃和45℃)下进行缓释。在特定时间(1h、2h、3h、4h、5h、7h、10h、12h、24h、36h和48h)离心取上清液3ml，测量溶液吸光度，又同时加入3ml对应ph值的pbs缓冲溶液，维持溶液总体积不变，最终计算药物累积释放率。
累积释放率的计算公式：
式中：
crp—dox的累计释放率，％；
ve—pbs更换体积，l；
v0—pbs总体积，l；
ci—第i次取出溶液的dox浓度，mg/l；
mdox—载体中所含dox总质量，mg；
n—取出液体的次数。
2、fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox的体外药物释放
1)不同ph下fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox的释药性能
研究fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox在不同ph值(3、4、5、6和7.4)下的药物释放性能，结果如图7所示。
由图7可知，ph对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox的释药性能影响较大。在累积释放时间48h、不同ph值(3、4、5、6和7.4)的pbs缓冲溶液中，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的累积释放率分别为21.08％、24.46％、27.16％、93.43％和48.67％。fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的累积释放量是由外层聚合物和内层介孔共同释放结果。在酸性较强时，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的外层聚合物溶胀率较低，聚合物内dox的释放受阻，此时以介孔内药物向外扩散释放为主，总体释放量较低。随着ph值逐渐增加，聚合物溶胀率增加，fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)对dox的累积释放率逐渐增加，在ph值为6时，缓释量达到最大。而大多数肿瘤细胞外环境呈弱酸性(ph值6.5左右)，故fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox具有较好的应用前景。在ph值为7.4时释药量反而降低，可能由于外层聚合物溶胀率虽达到最大，但介孔内药物释放与其路径长短有关，故聚合物壳层过厚，阻碍介孔内药物扩散释放，致使整体释放量下降。以上表明，dox在fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)中的释放具有明显ph响应性，可通过改变ph来控制药物释放量。
2)不同温度下fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox的释药性能
研究fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox在不同温度(30℃、35℃、40℃和45℃)下的药物释放性能，结果如图8所示。
图8给出了fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)在不同温度下对dox的累积释放曲线。fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)在30℃、35℃、40℃和45℃温度下对dox的累积释放率分别为70.58％、77.51％、81.38％和80.75％。当温度低于低临界溶解温度(lcst)时，聚合物溶胀率较高，温度逐渐升高，分子热运动加剧，利于药物分子的扩散释放，故30℃到40℃药物释放量逐渐增多。当温度达到45℃时，已高于lcst点，聚合物急剧收缩，阻碍聚合物壳层中的dox释放，整体释放量下降。以上表明fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)具有温度刺激响应性，可通过温度变化来控制药物释放量。40℃时缓释量最多，而大多数肿瘤组织的温度高于人体正常温度(37℃)，故fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)具有实际应用潜力。
综上：对fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)在不同温度和不同ph条件下的释药性能进行研究，表明fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)具有温度和ph双重刺激响应性，可通过改变ph和温度来控制药物释放量。
1.核壳结构刺激响应型药物载体的制备方法，步骤一：制备四氧化三铁纳米粒子fe3o4；步骤二：制备磁性介孔二氧化硅fe3o4/msio2；步骤三：合成fe3o4/msio2-mps；其特征在于，步骤四：每一单位fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)的合成原料用料比例为，将0.1gfe3o4/msio2-mps、0.1g甲基丙烯酸maa、0.4gn-异丙基丙烯酰胺nipam和40ml蒸馏水加入到三口烧瓶中，机械搅拌均匀，将60mg过硫酸铵和60mg亚硫酸氢钠溶解于5ml蒸馏水中，将其加入到三口烧瓶中，40ºc下搅拌反应10min，最后将溶解于5ml蒸馏水的0.08gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺mba，加入到上述反应体系中，氮气保护下反应6h，反应结束，磁分离，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，50ºc真空干燥，即得复合粒子核壳结构刺激响应型药物载体fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)。
2.如权利要求1所述的核壳结构刺激响应型药物载体的药物释放方法，其特征在于，药物以载体fe3o4/msio2/p(maa-co-nipam)-dox通过改变ph值和温度来控制药物释放量。
3.如权利要求2所述的核壳结构刺激响应型药物载体的药物释放方法，其特征在于，所述ph值为6，所述温度为40ºc。
技术总结