本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法和应用。
背景技术：
近年来有数据表明，在我国乳腺癌已成为女性最常见肿瘤其中之一，约占女性发病恶性肿瘤的四分之一。世界范围内其每年新发病例约170万，死亡约41万。我国每年女性乳腺癌发病16.9万，是女性第2位最常见恶性肿瘤；我国女性因乳腺癌死亡约4.5万，是女性第6位最常见的恶性肿瘤死亡原因。目前，手术是治疗乳腺癌的主要方式，但其具有费用高、创伤面积大、复发率高等缺点。因此，开发安全有效的抗乳腺肿瘤药物意义重大。
黄芩苷(baicalin)，别名：贝加灵，黄金茶，山茶根，烂心草(河北)；是从双子叶唇形科植物黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)的干燥根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，化学名为5，6-二羟基-7-o-葡萄糖醛酸黄酮苷，cas号：21967-41-9，分子式：c21h18o11，分子量：446.36100，常温下为淡黄色粉末，味苦，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于氯仿和硝基苯，几乎不溶于水，可溶于热乙酸。研究表明，黄芩苷具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成、缓解哮喘、泻火解毒、止血、安胎、抗变态反应及解痉作用，也具有较强的抗癌反应生理效能。
但是，由于黄芩苷分子结构中的黄酮和葡萄苷酸之间可以形成分子内氢键，导致其水溶性和脂溶性均较差，并含有多酚羟基结构容易氧化变质，口服生物利用度仅为2.2％，因而限制了其临床应用。另外，虽然现在很多改善黄芩苷生物利用度的纳米制剂，如黄芩苷纳晶混悬剂、黄芩苷元脂质体组合药物、黄芩苷纳米结晶等都已被开发出来，但这些制剂均不具备主动靶向到肿瘤组织的能力。因此，研发一种能够提高黄芩苷生物利用度，同时又能够将黄芩苷主动靶向到肿瘤组织的方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有黄芩苷生物利用度低且现有乳腺癌治疗药物不具有主动靶向性能的缺陷和不足，提供一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法及应用。
本发明的目的是提供一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法。
本发明另一目的是提供所述方法制备得到的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒。
本发明再一目的是提供所述纳米粒在作为或制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
s1.将叶酸偶联白蛋白载体溶于缓冲溶液中，得到叶酸偶联白蛋白载体溶液；
s2.边搅拌边将溶解有黄芩苷的无水乙醇溶液加入步骤s1得到的载体溶液中，超声，滴加戊二醛溶液进行交联固化，旋蒸出乙醇溶液，即得所述包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒。
本发明采用去溶剂化法制备包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒，在叶酸偶联白蛋白载体溶液中加入对白蛋白不溶且含有黄芩苷的无水乙醇溶液，能够引起相分离而将黄芩苷包封成纳米粒，使用此方法所制备的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的粒径较小，分散性好，包封率高。
优选地，步骤s2所述黄芩苷与步骤s1所述叶酸偶联白蛋白载体的质量比为1～2:10。
更优选地，步骤s2所述黄芩苷与步骤s1所述叶酸偶联白蛋白载体的质量比为1:10。
优选地，步骤s1所述缓冲溶液与步骤s2所述无水乙醇的体积比为1:4～6。
更优选地，步骤s1所述缓冲溶液与步骤s2所述无水乙醇的体积比为1:4。
优选地，步骤s1所述缓冲溶液的ph值为7.0～9.0。
更优选地，步骤s1所述缓冲溶液的ph值为9.0。
优选地，步骤s1所述叶酸偶联白蛋白载体溶液的浓度为1％～2％。
更优选地，步骤s1所述叶酸偶联白蛋白载体溶液的浓度为1％。
优选地，步骤s2所述搅拌的温度为24℃～30℃。
若搅拌的温度过高(大于30℃)，白蛋白变性析出；若搅拌的温度过低(小于24℃)，所形成的纳米粒粒径过小，载药量显著降低。
更优选地，步骤s2所述搅拌的温度为25℃。
优选地，步骤s2所述搅拌的速度为400～600rad/min。
若搅拌的速度过高(大于600rad/min)，所形成的纳米粒粒径过小，包载不充分，载药量下降；若搅拌的速度过低(小于400rad/min)，部分溶液中乙醇浓度过高，造成白蛋白变性过度引起聚沉。
更优选地，步骤s2所述搅拌的速度为500rad/min。
优选地，步骤s2所述加入的速度为4～6ml/s。
若加入的速度过高(大于6ml/s)，溶液易于溅出或打翻；若加入的速度过低(小于4ml/s)，部分溶液中乙醇浓度过高，造成白蛋白变性过度引起聚沉。
更优选地，步骤s2所述加入的速度为5ml/s。
优选地，步骤s2所述戊二醛溶液的浓度为0.25％～1％。
若戊二醛溶液的浓度过高(大于1％)，交联固化作用过强，引起纳米粒形成絮状聚沉；若戊二醛溶液的浓度过低(小于0.25％)，交联固化作用不够，纳米粒大小不均一，包载不充分。
更优选地，步骤s2所述戊二醛溶液的浓度为0.25％。
优选地，步骤s2所述超声时超声探头的发射功率为250～350w。
更优选地，步骤s2所述超声时超声探头的发射功率为300w。
优选地，步骤s2所述超声的时间为0.5～1.5min。
若超声的时间过高(大于1.5min)，纳米粒粒径过小，载药量下降；若超声的时间过低(小于0.5min)，纳米粒粒径大小不均一。
更优选地，步骤s2所述超声的时间为1min。
优选地，步骤s1所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲液或nahco3溶液。
更优选地，步骤s1所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲液。
本发明还保护上述方法制备得到的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒。
另外，本发明经过创造性的探索研究证实了所述包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒对乳腺癌细胞具有显著的细胞毒性作用，且动物体内实验表明该纳米粒具有良好的抑制肿瘤生长的作用；因此，所述纳米粒在作为或制备治疗乳腺癌的药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到了具有肿瘤靶向的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒，既克服了黄芩苷水溶性差的缺陷，同时在叶酸偶联白蛋白载体上偶联叶酸，通过叶酸与叶酸受体的配体-受体结合作用，使包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒特异性地识别肿瘤细胞，能够提高纳米粒的肿瘤靶向性，从而有效地提高了黄芩苷的生物利用度，增强了其抗肿瘤药效和降低了毒副作用；
其中，叶酸受体fr作为包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白载体的靶目标，本发明将识别fr的配体叶酸修饰到偶联白蛋白载体表面，实现肿瘤的主动靶向；且叶酸偶联白蛋白载体具有安全无毒、生物相容性良好、无抗原性等多种优点，其作为一种新型理想的药物载体，还具有缓释、生物利用度高、主动靶向、可减轻抗癌药物的不良反应等优点；且该纳米粒的制备方法简单，粒径较小，分散性好，包封率高；因此，本发明制备得到包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒在作为或制备治疗乳腺癌的药物中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例2制备得到的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的电镜形态图。
图2是ba、空白fa-bsanps和fa-bsanps/ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果图；其中，(a)图是ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果图；(b)图是空白fa-bsanps对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果图；(c)图是fa-bsanps/ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果图。
图3是本发明建立得到的乳腺癌细胞mcf-7裸鼠模型。
图4是乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后体重变化结果图。
图5是乳腺癌细胞mcf-7裸鼠肿瘤形态图；其中，“negativecontrol”代表pbs组、“group1”代表ba组、“group2”代表fa-bsa组、“group3”代表fa-bsa/balow组、“group4”代表fa-bsa/bamiddle组、“group5”代表fa-bsanps/bahigh组。
图6是乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后肿瘤体积变化曲线图。
图7是乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后肿瘤体积结果图。
图8是乳腺癌细胞mcf-7裸鼠抑瘤率测定结果图。
图9是fa-bsanps/ba在裸鼠体内生物分布结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒(fa-bsanps/ba)制备工艺条件的优化
1、缓冲溶液ph值的优化
(1)实验方法
固定其他制备因素条件不变的情况下，使溶解叶酸偶联白蛋白(fa-bsa)载体的缓冲溶液的ph值分别为7.0、8.0、9.0、10.0，制备fa-bsanps/ba，分别测定粒径和包封率(pdi)。
(2)实验结果
缓冲溶液ph值对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果如表1所示，可以看出，随着缓冲溶液ph值的增加，fa-bsanps/ba粒径逐渐减小，但是当缓冲溶液ph值达到10.0时，pdi值随着增大；因此，选择制备fa-bsanps/ba时的缓冲溶液的ph值为7.0～9.0，最佳ph值为9.0。
表1缓冲溶液ph值对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果
2、fa-bsa浓度的优化
(1)实验方法
固定其他制备因素条件不变的情况下，使fa-bsa的浓度分别为0.5％、1％、2％、3％、4％、6％、8％，制备fa-bsanps/ba，分别测定粒径和包封率。
(2)实验结果
fa-bsa浓度对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果如表2所示，可以看出，随着fa-bsa浓度的增加，fa-bsanps/ba的粒径也随着增加；但是当fa-bsa浓度过低时，粒径不均匀，会产生许多粒径20nm左右的小峰，使载药量下降；因此，选择制备fa-bsanps/ba时的fa-bsa的浓度为1％～2％，最佳浓度为1％。
表2fa-bsa浓度对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果
3、ba与fa-bsa质量比的优化
(1)实验方法
固定其他制备因素条件不变的情况下，使ba(黄芩苷)与fa-bsa质量比分别为1:10、2:10、4:10、6:10、8:10，制备fa-bsanps/ba，分别测定粒径和包封率。
(2)实验结果
ba与fa-bsa质量比对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果如表3所示，可以看出，随着ba用量的增加，fa-bsanps/ba的粒径明显增加；且当ba与fa-bsa质量比大于2:10时，粒径有大小峰或产生絮状沉淀；因此，选择制备fa-bsanps/ba时的ba与fa-bsa质量比为1～2:10，最佳质量比为1:10。
表3ba与fa-bsa质量比对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果
4、缓冲溶液与无水乙醇体积比的优化
(1)实验方法
固定其他制备因素条件不变的情况下，使缓冲溶液与无水乙醇体积比分别为1:1、1:3、1:6、1:9，制备fa-bsanps/ba，分别测定粒径和包封率。
(2)实验结果
缓冲溶液与无水乙醇体积比对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果如表4所示，可以看出，当缓冲溶液与无水乙醇的体积比过高(≥1:2)时，产生絮状沉淀，纳米粒不能形成；当缓冲溶液与无水乙醇的体积比过低(≤1:10)时，使得fa-bsa浓度过低，导致形成的纳米粒粒径过小，且大小不均一，包封率严重下降；因此，综合考虑选择制备fa-bsanps/ba时的缓冲溶液与无水乙醇的体积比为1:4～6，最佳体积比为1:4。
表4缓冲溶液与无水乙醇体积比对fa-bsanps/ba粒径和包封率的影响结果
实施例2包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备
一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
精密称取处方量的ba，溶于适量无水乙醇中，得到溶解有ba的无水乙醇溶液；精密称取处方量的fa-bsa载体，溶于适量的ph值为9.0的缓冲溶液中，配置成1％浓度的fa-bsa载体溶液；
25℃、500rad/min搅拌条件下，将溶解有ba的无水乙醇溶液以5ml/s的速度加入fa-bsa载体溶液中，将溶液置于超声探头下超声(超声探头的发射功率为300w)1min，滴加浓度为0.25％的戊二醛溶液进行交联固化；最后将溶液转移至旋转蒸发仪中，37℃旋蒸出乙醇溶液，即得fa-bsanps/ba；其中，缓冲溶液与无水乙醇的体积比为1:4；ba与fa-bsa质量比为1:10。
本发明实施例2制备得到的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的电镜形态图如图1所示。
实施例3包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备
一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
精密称取处方量的ba，溶于适量无水乙醇中，得到溶解有ba的无水乙醇溶液；精密称取处方量的fa-bsa载体，溶于适量的ph值为7.0的缓冲溶液中，配置成2％浓度的fa-bsa载体溶液；
24℃、400rad/min搅拌条件下，将溶解有ba的无水乙醇溶液以4ml/s的速度加入fa-bsa载体溶液中，将溶液置于超声探头下超声(超声探头的发射功率为250w)0.5min，滴加浓度为1％的戊二醛溶液进行交联固化；最后将溶液转移至旋转蒸发仪中，37℃旋蒸出乙醇溶液，即得fa-bsanps/ba；其中，缓冲溶液与无水乙醇的体积比为1:6；ba与fa-bsa质量比为1:2。
实施例4包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备
一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
精密称取处方量的ba，溶于适量无水乙醇中，得到溶解有ba的无水乙醇溶液；精密称取处方量的fa-bsa载体，溶于适量的ph值为8.0的缓冲溶液中，配置成1.5％浓度的fa-bsa载体溶液；
28℃、600rad/min搅拌条件下，将溶解有ba的无水乙醇溶液以6ml/s的速度加入fa-bsa载体溶液中，将溶液置于超声探头下超声(超声探头的发射功率为350w)1.5min，滴加浓度为0.5％的戊二醛溶液进行交联固化；最后将溶液转移至旋转蒸发仪中，37℃旋蒸出乙醇溶液，即得fa-bsanps/ba；其中，缓冲溶液与无水乙醇的体积比为1:5；ba与fa-bsa质量比为1:6。
实施例5包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备
一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
精密称取处方量的ba，溶于适量无水乙醇中，得到溶解有ba的无水乙醇溶液；精密称取处方量的fa-bsa载体，溶于适量的ph值为8.50的缓冲溶液中，配置成1.8％浓度的fa-bsa载体溶液；
30℃、550rad/min搅拌条件下，将溶解有ba的无水乙醇溶液以5.5ml/s的速度加入fa-bsa载体溶液中，将溶液置于超声探头下超声(超声探头的发射功率为320w)0.8min，滴加浓度为0.75％的戊二醛溶液进行交联固化；最后将溶液转移至旋转蒸发仪中，37℃旋蒸出乙醇溶液，即得fa-bsanps/ba；其中，缓冲溶液与无水乙醇的体积比为1:5.5；ba与fa-bsa质量比为1:8。
应用例1包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定
1、试剂配制
培养基的配制：取10ml胎牛血清，1ml双抗(青霉素/链霉素溶液)，89mlrpmi-1640不完全培养基，混合。
mtt溶液的配制：250.0mgmtt粉末，用pbs配制浓度为5mg/ml的溶液，无菌条件下操作，过0.22μm无菌滤膜，于-20℃保存。
pbs溶液的配制：取10g分装的pbs粉末，将其溶解于1l的容量瓶中，超纯水定容，高压灭菌锅灭菌，无菌条件下分装，于4℃保存。
ba溶液的配制：以dmso为溶剂，制备浓度为2mg/ml的ba溶液，得到的ba溶液用rpmi-1640不完全培养基稀释不同浓度梯度，过0.22μm无菌滤膜，现配现用。
fa-bsanps/ba分散液及空白fa-bsanps溶液的配制：取实施例2～5任一制备得到的fa-bsanps/ba，采用冻干保护剂冻干后，根据hplc法测定包封率，计算ba浓度；取适量fa-bsanps/ba分散液及空白fa-bsanps分散液，过0.22μm无菌滤膜，于4℃冰箱保存。
2、实验方法
(1)乳腺癌mcf-7细胞复苏、培养、传代
乳腺癌mcf-7细胞从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴中使其快速溶化，于1000rpm离心5min，弃上清液，用pbs轻轻吹打清洗，于1000rpm离心5min，弃上清液，加rpmi-1640完全培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)使其重悬，放于co2培养箱中(5％co2，37℃)培养。每隔2天更换培养液，倒置显微镜下观察，当mcf-7细胞生长覆盖培养瓶大于80％时，将培养瓶中含细胞代谢物的培养基吸走，pbs清洗3次，胰酶消化离心，弃上清液，加入培养液重悬，吸取一定体积的细胞悬液分装到新的培养瓶中，于co2培养箱中培养。
(2)fa-bsanps/ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定
1)分别精密量取适量的pbs、ba、fa-bsanps、fa-bsanps/ba，经0.22μm的滤膜过滤，待用。
2)取对数期生长的mcf-7细胞，加入胰酶消化为单层细胞，且相互之间不连接成团，即加入培养基，吹打分散混匀，细胞混悬液在血球计数板上计数。
3)将细胞混悬液稀释到细胞数为4×104cells/ml。
4)将96孔板在紫外灯下消毒30min，每孔加入100μl的细胞混悬液，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
5)24h后，取出96孔板，去除旧的培养基，分别加入pbs(空白对照组)、ba(ba组)、fa-bsanps(fa-bsa组)、fa-bsanps/ba(fa-bsa/ba组)，浓度分别为400μm/l、200μm/l、100μm/l、50μm/l、25μm/l、12.5μm/l、6.25μm/l和3.1252μm/l，每组5个平行，将不同组96孔板放入培养箱中48h。
6)48h后，取出96孔板，去除旧的培养基，每空加入20μlmtt溶液，置于37℃，5％co2培养箱中培养4h。
7)4h后，取出96孔板，去除其中的mtt溶液和培养基，加入150μl的dmso溶液溶解甲瓒，轻轻摇晃使结晶物溶解，37℃孵育20min，之后将96孔板置于酶标仪上检测，在490nm处记录od值。
以空白组调零，实验重复3次，计算细胞活力及ic50。细胞毒性计算公式如下：
细胞活力(％)＝(药物处理组od值-空白调零组od值)/(对照组od值-空白调零组od值)×100％。
3、实验结果
ba、空白fa-bsanps和fa-bsanps/ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果如图2所示，其中，(a)图是ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果，可以看出，当ba的浓度高达400μm/l时，mcf-7细胞的存活率也高达70％以上；(b)图是空白fa-bsanps对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果，可以看出，当空白fa-bsanps的浓度为100μm/l时，对mcf-7细胞活力具有也可以忽略的毒性作用；(c)图是fa-bsanps/ba对乳腺癌mcf-7细胞的毒性测定结果，可以看出，当fa-bsanps/ba的浓度为50μm/l时，具有显著的细胞毒性，细胞存活率仅为32％；且在fa-bsanps/ba的浓度为50～400μm/l时，随着fa-bsanps/ba浓度的升高，其对乳腺癌mcf-7细胞的毒性增强；当fa-bsanps/ba的浓度为400μm/l时，mcf-7细胞的存活率仅为10％左右。
以上结果表明：与ba、空白fa-bsanps相比，本发明制备得到的fa-bsanps/ba对乳腺癌mcf-7细胞具有显著的细胞毒性。
应用例2包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒对乳腺癌细胞mcf-7裸鼠模型的药效研究
1、实验方法
(1)乳腺癌细胞mcf-7裸鼠模型的建立
将购置于广东省医学实验动物中心的雌性balb/c裸鼠于无菌级(spf)动物房中分笼饲养，相对湿度60±15％，环境温度23±2℃，自然光照，国家标准固体混合饲料喂养，自由饮水，待其饲养一周后，将培养的密度为1×107mcf-7细胞与基质胶等比混合，皮下注入雌性balb/c裸鼠(4-5周龄，体重18-22g)腋下右侧方，2w左右，待肿瘤长至约100mm3时，视为建模成功。
(2)实验分组及给药方式
将建模成功的乳腺癌细胞mcf-7裸鼠，随机平均分为pbs组(空白对照组)、ba组、fa-bsa组、fa-bsa/balow组、fa-bsa/bamiddle组、fa-bsanps/bahigh组共六组，分别尾静脉注射pbs、ba、fa-bsanps、fa-bsanps/ba(3,6,9mg/kg)，每3d给药一次，共给药7次。
(3)乳腺癌细胞mcf-7裸鼠体重变化测定
每只乳腺癌细胞mcf-7裸鼠均先称量体重，根据体重给药，给药剂量为3,6,9mg/kg(按ba量计)。每次给药前，用天平对每只乳腺癌细胞mcf-7裸鼠进行称重并记录，记录乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后体重变化。
(4)乳腺癌细胞mcf-7裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率测定
建模后，每次给药前测量乳腺癌细胞mcf-7裸鼠肿瘤的长径和短径，并根据公式(1)计算裸鼠肿瘤体积大小，根据乳腺癌细胞mcf-7裸鼠的肿瘤体积变化绘制肿瘤生长曲线，根据公式(2)计算抑瘤率：
裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率计算公式如下：
肿瘤体积＝1/2ab2；公式中：a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。
抑瘤率(％)＝(vpbs-v治疗)/vpbs×100％；
公式中：a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。vpbs为注射pbs的mcf-7模型裸鼠的体积，v治疗分别为注射ba、fa-bsanps/ba的mcf-7模型裸鼠的体积。
(5)乳腺癌细胞mcf-7裸鼠动物体内荧光成像
为了研究fa-bsanps/ba的体内分布，在balb/c裸鼠右侧腋下皮下接种mcf-7细胞(每只裸鼠约5×106个细胞)。当肿瘤体积达到150-200mm3时，通过尾静脉向裸鼠注射吲哚菁绿(icg)溶液及共载ba和icg的fa-bsanps，然后将裸鼠麻醉并在小动物成像系统(ivisluminaxrseriesⅲ软件)成像，成像时间点为0.5、1、4、8、24h。在给药后第4或者24小时解剖裸鼠并取出主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肿瘤组织)，并在成像系统下观察和拍照。利用ivisluminaxrseriesⅲ软件，对裸鼠全身及组织区域内的荧光强度进行分析。
(6)数据分析
所有数据重复三次，计算其平均值及sd值(x±sd)，结果进行t检验，p<0.05说明数据较显著，显著性分析采用spss22.0软件进行计算，图片采用originpro8软件进行绘制。
2、实验结果
(1)裸鼠体重变化测定结果
本发明建立得到的乳腺癌细胞mcf-7裸鼠模型如图3所示。
乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后体重变化结果如图4所示，可以看出，pbs组mcf-7模型裸鼠体重随着时间的增长有一定程度的增加，fa-bsa组裸鼠体重先增长后有所下降，而fa-bsa/balow组、fa-bsa/bamiddle组、fa-bsanps/bahigh组裸鼠体重均先增长后趋于平缓；且与pbs组、ba组、fa-bsa组相比，fa-bsa/ba组裸鼠体重显著降低，其中，fa-bsanps/bahigh(9mg/kg)组裸鼠的体重最低。
以上结果说明：本发明制备得到的fa-bsanps/ba能够显著降低乳腺癌细胞mcf-7模型裸鼠的体重。
(2)裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率测定结果
乳腺癌细胞mcf-7裸鼠肿瘤形态如图5所示，乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后肿瘤体积变化曲线如图6所示，乳腺癌细胞mcf-7裸鼠给药前后肿瘤体积结果如图7所示，可以看出，pbs组和fa-bsa组mcf-7模型裸鼠肿瘤体积出现增长的趋势且肿瘤体积较大，ba组mcf-7模型裸鼠肿瘤的增长相对于pbs组和fa-bsanps组稍有减缓，而fa-bsa/balow组、fa-bsa/bamiddle组、fa-bsanps/bahigh组肿瘤体积增长的显著缓慢，其中，fa-bsanps/bahigh(9mg/kg)裸鼠的肿瘤体积最小。
乳腺癌细胞mcf-7裸鼠抑瘤率测定结果如图8所示，可以看出，ba组抑瘤率为10.3％，fa-bsa组抑瘤率为2.4％，fa-bsa/balow组抑瘤率为61.6％，fa-bsa/bamiddle组抑瘤率为61.5％，而fa-bsanps/bahigh组抑瘤率高达66.8％。
以上结果说明：相比于ba，本发明制备得到的fa-bsanps/ba能够显著增强其对mcf-7模型裸鼠肿瘤的抑制作用，显著降低裸鼠肿瘤体积，显著增强抑瘤率。
(3)乳腺癌细胞mcf-7裸鼠动物体内荧光成像结果
fa-bsanps/ba在裸鼠体内生物分布结果如图9所示，可以看出，fa-bsa/balow组、fa-bsa/bamiddle组、fa-bsanps/bahigh组能够在1小时内在肿瘤部位累积，之后荧光强度维持24小时；在给药后4小时，荧光图像显示fa-bsanps/ba主要分布在肿瘤、肝脏和肾脏组织中。
以上结果说明：本发明制备得到的fa-bsanps/ba能够快速到达肿瘤部位进行作用，并在肿瘤部位持续作用很长时间，更好的发挥其对肿瘤细胞的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1.将叶酸偶联白蛋白载体溶于缓冲溶液中，得到叶酸偶联白蛋白载体溶液；
s2.边搅拌边将溶解有黄芩苷的无水乙醇溶液加入步骤s1得到的载体溶液中，超声，滴加戊二醛溶液进行交联固化，旋蒸出乙醇溶液，即得所述包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2所述黄芩苷与步骤s1所述叶酸偶联白蛋白载体的质量比为1～2:10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1所述缓冲溶液与步骤s2所述无水乙醇的体积比为1:4～6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1所述缓冲溶液的ph值为7.0～9.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1所述叶酸偶联白蛋白载体溶液的浓度为1％～2％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2所述搅拌的温度为24℃～30℃；步骤s2所述搅拌的速度为400～600rad/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2所述加入的速度为4～6ml/s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2所述戊二醛溶液的浓度为0.25％～1％。
9.权利要求1～8任一所述方法制备得到的包载黄芩苷的叶酸偶联白蛋白纳米粒。
10.权利要求9所述纳米粒在作为或制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
技术总结