本发明属于医药技术领域，涉及一种温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂及其制备方法。
背景技术：
长效缓释制剂是一种将药物包埋在生物可降解高分子材料中，在较长时间范围内持续释放药物的新型制剂。其可以避免普通制剂因突释而产生的峰谷波动现象，保持血药浓度维持在药效范围内，在提高药效，降低药物的毒副作用的同时，减少给药频率，提高患者的顺应性。微球(microspheres)是一种为实现药物长效平稳释放的药物缓释系统。其粒径一般在微米级，具有控制药物缓慢释放、提高药物稳定性、掩盖药物不良味道等作用，是一种极具潜力的剂型，已成为近年来医药工业和生物化工领域的研究热点。突释现象明显一直是普通微球存在的主要缺限，由于微球表面和内部孔隙的存在，药物在释放初期经常出现大剂量释出的问题，因此在制备微球的工艺研究中，解决药物的突释问题极为重要。国内外学者为了延长药物释放的周期，进行了大量科学研究。例如，中国专利201710327278.3采用先将药物包裹到纳米粒中，然后微球再包埋纳米粒形成纳米粒微球复合制剂的方式来达到长效缓释的目的，该制剂在一定程度上解决了药物的突释现象，半个月其体外释放量达80%左右，但是需要分步制备纳米粒和微球，制备工艺较为繁琐；中国专利201310046205.9公开了一种将微球包裹于水凝胶中的技术，结果表明药物可持续释放达10天以上，但是其缓释效果一般，且其在保存中必会造成制剂中药物的泄露，应用受到一定限制。
针对以上问题，有必要在简化制备工艺流程、解决药物突释现象，保持药物长效缓释方面研发一种新型缓控释制剂，以便在多种需要频繁注射给药的疾病治疗中发挥作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂及其制备方法，不同于普通制剂及常规缓释制剂的突释作用机理，为一种不同于现有技术的新型缓释制剂的技术路线。
本发明以温敏水溶胶作为内水相，通过复乳法制备了w/o/w型微球。本发明的制剂解决了普通制剂及常规缓释制剂的突释问题，制备工艺更加简易，解决患者顺应性的同时明显延长药物的释放时间。
为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：
温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂的制备方法，步骤如下：
1）药物或含药微粒分散于质量浓度为5%-50%的温度敏感性水溶胶材料中作为内水相；
2）在3000-14000rpm高速剪切时将所述内水相滴加到高分子聚合物材料的质量浓度为5%-40%的二氯甲烷油相中制得w/o型初乳；
3）再将所述w/o型初乳在3000-10000rpm高速剪切时滴加到质量浓度为1%-10%的pva水溶液中制得w/o/w型复乳；
其中，步骤1）-步骤3）中，所述药物或含药微粒、温度敏感性水溶胶材料、高分子聚合物的质量比为1：（5-500）:（10-1000），所述内水相、油相、pva水溶液的体积比为1：（2-50）：（5-1000）；
4）然后，所述w/o/w型复乳在300-1000rpm转速搅拌3-5h固化制得微球混悬液；将所得微球进行离心、洗涤、冷冻干燥后即得到温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂。
针对上述发明目的，本发明还提供了对上述技术方案的优选方案。
优选，
所述药物为小分子药物或生物大分子药物。
进一步优选，所述药物为石杉碱甲、利培酮、奥氮平、酚噻嗪、丁酰苯、贝伐单抗、阿柏西普、雷珠单抗、康柏西普、胰岛素、艾塞那肽、特立帕肽、奥曲肽、曲普瑞林、醋酸戈舍瑞林中的任意一种。
优选，
所述含药微粒为纳米粒、囊泡、胶束、脂质体、环糊精包合物、纳米金、微乳、纳米乳中的任意一种或多种混合，并且所述含药微粒中所含的药物为上述药物中的任意一种或多种混合。
优选，
所述高分子聚合物材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）或其衍生物。
进一步优选，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）为均分子量为4000-45000的未封端的丙交酯-乙交酯共聚物。
优选，
步骤1）中所述温度敏感性水溶胶材料的质量浓度为10%-30%，步骤2）中所述高分子聚合物材料的质量浓度为10%-20%。
需要说明的是，本发明试验发现，当含有上述药物的内水相加入到油相中时会出现油水界面，上述药物会部分聚集在油水界面上出现结构翻转导致药物活性丧失，但是所述内水相中掺加混合上述蛋白保护剂后能够抑制制备过程中油水界面对抗体结构的破坏。
因此，当所述药物为生物大分子药物，如贝伐单抗、阿柏西普、雷珠单抗、康柏西普、胰岛素、艾塞那肽、特立帕肽、奥曲肽、曲普瑞林、醋酸戈舍瑞林中的任意一种，或所述含药微粒中所含的药物为上述药物时，
步骤1）中所述内水相中混合掺加蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为人血白蛋白（hsa）、牛血清白蛋白（bsa）、聚乙烯醇（pva）、壳聚糖中的一种或多种混合，
并且，所述蛋白保护剂在所述内水相中的质量浓度为1%-40%，进一步优选10%-30%。
为实现再一个发明目的，本发明提供了如下技术方案：
上述制备方法制得的温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂。
所述温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂的特征在于，载有药物或含药微粒的温敏水凝胶包裹于微球内，所述温敏水凝胶材料溶液在低温时处于溶胶状态，当环境温度达到24-36°c时可转变为凝胶半固体状态。本发明的复合制剂的特点在于被注射到体内后，由于体内环境温度升高微球内部的温敏水凝胶会从溶胶态转变为凝胶态，不论药物还是含药微粒均被包裹在半固体水凝胶当中，外界溶液在经过微球孔隙进入到微球内部时，由于水凝胶制剂的存在会对所含的药物形成释放阻碍，药物或含药微粒须经过水凝胶、微球两种制剂空间实现分级逐次释放，进而实现本系统在解决药物突释效应同时进一步地增强缓释作用及其可控性。
有益效果
本发明的温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂，通过机体自身温度的变化，微球内部温敏水溶胶实现溶胶至凝胶的相转变过程，对包含其中的药物释放进一步形成阻碍作用，实现了解决药物突释现象的同时达到缓慢释放的目的。
本发明的温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂可通过血管外给药方式，用于各类精神疾病、糖尿病、类风湿关节炎及乳腺癌、前列腺癌等部分癌症疾病的治疗。因此，本发明所制备的新型微球缓释制剂在对于提高各类精神疾病、糖尿病、类风湿关节炎及部分癌症在临床治疗效果上，解决药物突释效应，达到长效缓释目的均具有重要意义。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的具体实施方式一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1为本发明温敏水凝胶载石杉碱甲新型微球光学显微镜下形态；
图2为本发明温敏水凝胶载石杉碱甲新型微球体外释放曲线；
图3为本发明温敏水凝胶载bsa新型微球体外释放曲线；
图4为本发明温敏水凝胶载曲普瑞林新型微球体外释放曲线；
图5为本发明温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球光学显微镜下形态；
图6为本发明温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球体外释放曲线；
图7为本发明温敏水凝胶载艾塞那肽脂质体新型微球体外释放曲线；
图8为石杉碱甲普通微球体外释放曲线；
图9为bsa普通微球体外释放曲线；
图10为曲普瑞林普通微球体外释放曲线；
图11为艾塞那肽普通微球体外释放曲线；
图12为贝伐单抗普通微球体外释放曲线；
图13为贝伐单抗活性比较。
具体实施方式
下面将参照附图对本发明进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明而仍然实现本发明的有益效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。
为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须作出大量实施细节以实现开发者的特定目标。
为使本发明的目的、特征更明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。需要说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比率，仅用于方便、清晰地辅助说明本发明实施例的目的。
需要说明的是：
下述实施例中微球粒径测定选用粒度仪测定。
实施例中微球包封率按照如下步骤计算：取冻干的微球样品50mg于10ml量瓶中，加入乙腈定容至刻度，超声，检测溶液中药物浓度，进而求得药物质量，分别计算实际载药量与理论载药量，包封率(%)=实际载药量/理论载药量×100%，即得包封率。
实施例中通过酶标仪按照酶联免疫吸附测定法（elisa）分别测定抗体被加入前后的od值，然后通过比值计算抗体活性。
以下通过具体实施例对本发明进行说明，但是本发明的具体步骤不受实施例限制。
实施例1温敏水凝胶载石杉碱甲新型微球复合制剂的制备
称取石杉碱甲5mg于0.5mlph=4的去离子水中，超声使其溶解，向其中加入100mgplga-peg-plga（型号4500-1500-4500）温敏嵌段共聚物，4°c放置过夜，使其充分溶胀形成质量浓度为20%的水溶胶；水溶胶在12000rpm高速剪切下滴加到1ml质量浓度为15％的plga的油相中，形成w/o型初乳；所得初乳在5000rpm高速剪切时滴加到3ml质量浓度为1.5%的pva水溶液中，形成w/o/w型复乳；将复乳加入到100ml质量浓度为1.5%的pva水溶液中，800rpm搅拌3h，离心后取下层沉淀，洗涤、冷冻干燥，得载石杉碱甲新型微球复合制剂。
经检测，上述水溶胶相变温度为34-35°c，石杉碱甲新型微球粒径为10-100μm，包封率93.1%。
温敏水凝胶载石杉碱甲新型微球光学显微镜下形态见图1，从图1可以看出，所制备的新型微球形态圆整、表面光滑，由于水凝胶包裹在微球内部部分区域，各个区域材料密度不同导致整体颜色不均匀，同时也验证温敏材料的确包裹在微球内部。
图2为温敏水凝胶载石杉碱甲新型微球体外释放曲线，显示新型微球在第14天时累积释放约30%，较普通微球或其它缓释制剂具有十分明显的缓释效果。
实施例2温敏水凝胶载bsa新型微球复合制剂的制备
精密称定15mgbsa溶于0.5ml含50mgpva的质量浓度15%已溶胀的pcl-peg-pcl（型号1250-1500-1250）温敏水溶胶中，混匀，将水溶胶在10000rpm高速剪切下滴加到1.5ml质量浓度为10％plga的二氯甲烷中，得到w/o型初乳,所得初乳在6000rpm高速剪切时滴加到5ml质量浓度为3%的pva水溶液中，形成w/o/w型复乳,复乳加入到200ml质量浓度为3%的pva水溶液中，1000rpm搅拌4h，离心后取下层沉淀，去离子水洗涤3次、冷冻干燥，得载bsa新型微球制剂。
经检测，上述水溶胶相变温度32-33°c，bsa新型微球粒径为10-100μm，包封率89.8%。
温敏水凝胶载bsa新型微球体外释放曲线见图3，缓释效果明显，显示新型微球在第14天时累积释放约30%。
实施例3温敏水凝胶载曲普瑞林新型微球复合制剂的制备
精密称定曲普瑞林10mg和hsa100mg溶于0.5ml质量浓度10%已溶胀的pbla-peg-pbla（型号1500-1500-1500）温敏水溶胶中，混匀，将水溶胶在12000rpm高速剪切下滴加到2.5ml质量浓度为20％plga的二氯甲烷中，得到w/o型初乳,所得初乳在7000rpm高速剪切时滴加到7ml质量浓度为0.5%的pva水溶液中，形成w/o/w型复乳,复乳加入到500ml质量浓度为0.5%的pva水溶液中，1000rpm搅拌4h，离心后取下层沉淀，去离子水洗涤3次、冷冻干燥，得载曲普瑞林的新型微球制剂。
经检测，上述水溶胶相变温度35-36°c，曲普瑞林新型微球粒径为10-100μm，包封率90.5%。
温敏水凝胶载曲普瑞林新型微球体外释放曲线见图4，图4显示缓释效果明显，半个月释放不超过40%。
实施例4温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球复合制剂的制备
精密量取100mg/ml贝伐单抗溶液0.2ml与60mghsa溶于0.5ml质量浓度20%已溶胀的pcla-peg-pcla（型号1750-1500-1750）温敏水溶胶中，混匀，将水溶胶在12000rpm高速剪切下滴加到3ml质量浓度为20％plga的二氯甲烷中，得到w/o型初乳,所得初乳在7000rpm高速剪切时滴加到7ml质量浓度为0.5%的pva水溶液中，形成w/o/w型复乳,复乳加入到400ml质量浓度为0.5%的pva水溶液中，1000rpm搅拌3h，离心后取下层沉淀，去离子水洗涤3次、冷冻干燥，得载贝伐单抗的新型微球制剂。
经检测，上述水溶胶相变温度34-35°c，贝伐单抗新型微球粒径为10-100μm，包封率95.6%。
温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球光学显微镜下形态见图5，所制备的新型微球形态圆整、表面光滑，同时图5也证明温敏材料包裹于微球内部。
体外释放曲线见图6，图6显示缓释效果明显，14天时药物释放不超过30%。
实施例5温敏水凝胶载艾塞那肽脂质体新型微球复合制剂的制备
精密量取艾塞那肽脂质体溶液0.5ml（含药10mg）加入透明质酸-壳聚糖温敏溶胶中，使成质量浓度15%的温敏水溶胶；将水溶胶在8500rpm高速剪切下滴加到2ml质量浓度为15％plga的二氯甲烷中，得到w/o型初乳,所得初乳在6000rpm高速剪切时滴加到5ml质量浓度为0.5%的pva水溶液中，形成w/o/w型复乳,复乳加入到500ml质量浓度为0.5%的pva水溶液中，800rpm搅拌3h，离心后取下层沉淀，去离子水洗涤3次、冷冻干燥，得温敏水凝胶载艾塞那肽脂质体的新型微球制剂。
经检测，上述水溶胶相变温度34-35°c，载艾塞那肽脂质体新型微球粒径为10-100μm，包封率88.7%。
温敏水凝胶载艾塞那肽脂质体新型微球体外释放曲线见图7，图7显示艾塞那肽体外释放呈十分缓慢趋势，半个月释放20%左右，显著达到了十分缓慢释放的目的。
对比例1石杉碱甲普通微球的制备
精密称定石杉碱甲5mg于0.5mlph=4的去离子水中，超声溶解，将上述溶液在10000rpm高速剪切下滴加到2ml质量浓度15%plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，8000rpm高速剪切下分散到1%pva水溶液中，形成w/o/w型复乳，800rpm搅拌3h，微球洗涤3次，冷冻干燥即得。
石杉碱甲普通微球包封率为68.3%，体外释放曲线如图8所示，结果表明，石杉碱甲在半个月左右累积释放率达85%以上，释放较快，而实施例1制备的温敏水凝胶载石杉碱甲新型微球与对比例1的石杉碱甲普通微球相比，较普通微球或其它缓释制剂具有十分明显的缓释效果，而且包封率也优于普通微球。
对比例2bsa普通微球的制备
精密称定bsa6mg溶于0.5ml去离子水中使其溶解，将上述溶液在9000rpm高速剪切下滴加到2ml质量浓度10%plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，7000rpm高速剪切下分散到1.5%pva水溶液中，形成w/o/w型复乳，500rpm搅拌3h，微球洗涤3次，冷冻干燥即得。
bsa普通微球包封率仅为73.2%，体外释放曲线如图9所示，其释放速率较快，15天释放接近90%，突释明显。
对比例3曲普瑞林普通微球的制备
精密称定曲普瑞林10mg溶于0.5ml去离子水中使其溶解，将上述溶液在10500rpm高速剪切下滴加到2ml质量浓度15%plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，8500rpm高速剪切下分散到1%pva水溶液中，形成w/o/w型复乳，600rpm搅拌3h，微球洗涤3次，冷冻干燥即得。
曲普瑞林普通微球包封率为70.6%，体外释放曲线如图10所示，其首日释放接近30%，半个月释放在85%左右，突释明显。
对比例4艾塞那肽普通微球的制备
精密称定艾塞那肽5mg于0.5ml去离子水中，将上述溶液在10000rpm高速剪切下滴加到2ml质量浓度15%plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，8000rpm高速剪切下分散到1%pva水溶液中，形成w/o/w型复乳，800rpm搅拌3h，微球洗涤3次，冷冻干燥即得。
艾塞那肽普通微球包封率为79.8%，体外释放曲线如图11所示，结果表明，艾塞那肽在半个月左右累积释放率80%左右，释放首日突释达20%。
对比例5贝伐单抗普通微球的制备
精密称定贝伐单抗10mg溶于0.5ml去离子水中使其溶解，将上述溶液在11000rpm高速剪切下滴加到2ml质量浓度15%plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，7500rpm高速剪切下分散到1%pva水溶液中，形成w/o/w型复乳，800rpm搅拌3h，微球洗涤3次，冷冻干燥即得。
贝伐单抗普通微球包封率为73.1%，体外释放曲线如图12所示，其释放时间与其它普通微球制剂相似，近半个月左右，突释效应明显。
另外需要说明的是，当所载药物为生物大分子药物时制备内水相需要混合掺加蛋白保护剂。
下面以实施例4以及对比例5的生物大分子药物贝伐单抗为例予以说明。实施例4的温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球（含蛋白保护剂）与对比例5贝伐单抗普通微球（不含蛋白保护剂）通过体外释放试验，分别取其15天的释放溶液，通过elisa法对贝伐单抗活性进行了比较，结果如图13所示，温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球（处方1）的活性高于80%以上，而普通微球（处方2）的活性却低于40%。上述二者的差异即在于蛋白保护剂，试验表明温敏水凝胶载贝伐单抗新型微球比贝伐单抗普通微球由于蛋白保护剂的存在能够更好地保持了抗体的活性，分析原因即在于能较好抑制制备过程中油水界面对抗体结构的破坏。
通过上述实施例以及对比例的比较表明，本发明的所述温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂较普通微球制剂不仅大幅提高了所述药物在微球中的包封率，而且解决了w/o/w型微球的突释效应，如图2-4、6、7与图8-12相比所示，本发明的所述温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂在14天内累积的体外释放在30%左右，缓释效果明显，而在相同的时间内上述药物的普通微球制剂的累积体外释放均在84%以上，个别药物的普通微球制剂甚至达到了90%以上，突释明显。
同时，本发明还提高了所包载的蛋白、多肽类生物大分子的生物活性保证药物达到缓慢释放的目的。本发明所制备的新型微球缓释制剂在对于提高各类精神疾病、糖尿病、类风湿关节炎及部分癌症在临床治疗效果上，解决药物突释效应，达到长效缓释目的均具有重要意义。
温度敏感型水凝胶由于内部为三维网状结构，使得本身的缓释效果一般。本发明的温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂的特点在于温敏水凝胶制剂载药与微球制剂的结合，将载有药物或含药微粒的温敏水凝胶包裹于微球内不仅大幅提高了所述药物在微球中的包封率，而且获得了十分理想的药物缓释效果，14天药物累积释放仅30%左右。本发明的温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂其中的温敏水溶胶由于体内环境的升高会发生凝胶态的转变，药物需要经历水凝胶、微球或囊泡、水凝胶、微球的空间阻碍而实现分级逐次释放达到缓释目的，同时水凝胶骨架溶蚀后所形成的的胶体亦会阻塞或填充于微球孔隙内部，相互共同的作用达到延缓药物释放的效果和目的。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
1.温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）药物或含药微粒分散于质量浓度为5%-50%的具有温度敏感性水溶胶材料中作为内水相；
2）在3000-14000rpm高速剪切时将所述内水相滴加到高分子聚合物材料质量浓度为5%-40%的二氯甲烷油相中制得w/o型初乳；
3）再将所述w/o型初乳在3000-10000rpm高速剪切时滴加到质量浓度为1%-10%的pva水溶液中制得w/o/w型复乳；
其中，步骤1）-步骤3）中，所述药物或含药微粒、温度敏感性水溶胶材料、高分子聚合物的质量比为1：（5-500）：（10-1000），所述内水相、油相、pva水溶液的体积比为1：（2-50）：（5-1000）；
4）然后，所述w/o/w型复乳在300-1000rpm转速搅拌3-5h固化制得微球混悬液；将所得微球进行离心、洗涤、冷冻干燥后即得到温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述药物为石杉碱甲、利培酮、奥氮平、酚噻嗪、丁酰苯、贝伐单抗、阿柏西普、雷珠单抗、康柏西普、胰岛素、艾塞那肽、特立帕肽、奥曲肽、曲普瑞林、醋酸戈舍瑞林中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含药微粒为纳米粒、囊泡、胶束、脂质体、环糊精包合物、纳米金、微乳、纳米乳中的任意一种或多种混合，并且所述含药微粒中所含的药物为权利要求2中所述药物的任意一种或多种混合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高分子聚合物材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）或其衍生物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）为均分子量4000-45000未封端的丙交酯-乙交酯共聚物。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述温度敏感性水溶胶材料的质量浓度为10%-30%，步骤2）中所述高分子聚合物材料的质量浓度为10%-20%。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当所述药物为贝伐单抗、阿柏西普、雷珠单抗、康柏西普、胰岛素、艾塞那肽、特立帕肽、奥曲肽、曲普瑞林、醋酸戈舍瑞林中的任意一种，或所述含药微粒中所含的药物为上述药物时，
步骤1）中所述内水相中混合掺加蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为人血白蛋白（hsa）、牛血清白蛋白（bsa）、聚乙烯醇（pva）、壳聚糖中的一种或多种混合，
并且，所述蛋白保护剂在所述内水相中的质量浓度为1%-40%。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白保护剂在所述内水相中的质量浓度为10%-30%。
9.任一权利要求1-8所述的制备方法制得的温敏水凝胶载药的新型微球复合制剂。
技术总结