本发明涉及生物合成及医用材料领域，具体为一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法。
背景技术：
目前，许多天然或人工合成生物材料已经被广泛用于组织工程应用上。近来，纤维素，壳聚糖，透明质酸和胶原等天然产生的材料已经广泛的用于组织工程并引起了极大的兴趣1。在这些材料当中，纤维素是地球上分布最为广范的天然的生物材料2，它是绿色植物细胞壁中重要的结构性组分，并且有些种类的细菌也可以生产纤维素(也就是生物合成纤维素)。生物合成纤维素的优势在于它不像植物纤维素那样，需要采取化学处理去获取纯净的纤维素3。另外，未修饰的生物合成纤维素具有其他生物材料所没有的独特的物理和机械性能，例如高纯度，超细纤维网络结构，以及孔洞结构。生物合成纤维素具有可以吸附超过其自重100倍的水的吸水能力，高结晶度(结晶度达84-89％)，广泛的物理和化学修饰能力和可塑性。
然而，生物合成纤维素作为一个潜在的组织工程领域中可应用的生物材料并没有被充分的利用。目前多数针对于生物合成纤维素的研发努力大多聚焦于生物合成纤维素的性能改进上，例如通过优化细菌培养条件去控制所培养的生物合成纤维素支架的多孔性，在生物合成纤维素基质上引入官能基团，和增加生物合成纤维素的降解速率等，但是对于生物合成纤维素本身的成型加工和处理缺乏相关的探索。譬如生物合成纤维素作为生物材料的药物装载能力受到了灭菌消毒这一关键步骤的局限，使得所装载的药物，特别是蛋白质基的各种生长因子的生物活性无法很好地保持，很大程度上限制了生物合成纤维素作为药物释放载体材料的发展和应用。因此，如何实现制备一种可以解决上述缺陷并以生物合成纤维素为基质材料的药物释放载体，是技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供了一种生物合成纤维素膜的制备方法，该制备方法可制备得到作为药物载体的生物合成纤维素膜。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
s01、将菌株a接种至hestrin-schram培养基中，在26℃的温度条件下，静态培养7天，提取得到原始生物合成纤维素膜。
s02、将得到的原始生物合成纤维素膜转移至50℃、浓度为0.1m的氢氧化钠溶液中，搅拌洗涤后，得到初步纯净的生物合成纤维素膜。
s03、将由上述步骤得到的初步纯净的生物合成纤维素膜经蒸馏水洗涤，即可得到生物合成纤维素膜。
s04、取得到的生物合成纤维素膜，加蒸馏水混合，粉碎，得到纸浆。
s05、上述纸浆经buchner多孔圆盘过滤器过滤，过滤时间为40分钟，即可得到混合型生物合成纤维素膜。
s06、将得到的混合型生物合成纤维素膜在-20℃的温度条件下冷冻24小时，冷冻干燥后，得到最终的混合型生物合成纤维素膜，可置于真空干燥皿保存。
作为优选，在步骤s04之后，该制备方法还包括如下步骤：
s04.1、称取定量的纸浆，抽滤40分钟，得到初始样品的质量；
s04.2、设初始样品的质量为m，mx表示第x次实验测量得到的初始样品质量，x＝1,2,3…；
设步骤s06中得到的混合型生物合成纤维素膜的质量为n，nx表示第x次实验测量得到的混合型生物合成纤维素膜的质量，x＝1,2,3…；
通过将mx与对应的nx进行数据统计和回归，得到如下关系式：
nx＝mx*0.1518；
s04.3、将待测初始样品的质量代入上述关系式进行计算，得到生产所要求的混合型生物合成纤维素膜(n)对应所需纸浆的质量(m)；
s04.4、称取由步骤s04.3中计算得到的纸浆质量，即是步骤s05中的纸浆，用于进行第s05步骤。
作为优选，所述菌株a为汉氏葡糖酸醋杆菌。
作为优选，在步骤s01中，培养温度为26℃，静态培养时间为7天。
作为优选，在步骤s04中，生物合成纤维素膜和蒸馏水的质量比为1克：15毫升。
作为优选，在步骤s05中，过滤时间为40分钟。
作为优选，混合型生物合成纤维素膜置于-20℃进行冷冻，时间为24小时。
本发明还提供一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法制备得到的混合型生物合成纤维素膜经高温、高压消毒后，制备以生物纤维素膜为基底的药物释放载体系。
本发明的有益效果为：
在本发明中，我们首先将由细菌培养所得到的生物合成纤维素膜与水混合进行粉碎，再将粉碎所得的纸浆进行抽滤,冷冻干燥,高温消毒后获得最终成品产物。由于纸浆抽滤成型工艺的引入，巧妙地将生物纤维素膜的成型加工环节与药物装载环节分离进行。与传统的纤维素膜药物载体的制备方法相比(传统工艺往往将药物装载环节和纤维素膜成型环节合并，致使其后的消毒环节会导致已经装载的药物失活)，这项新工艺很好地协调了消毒和药物装载环节的关系，特别是将一些易失活药物的装载工艺与其消毒工艺之间可能存在的矛盾得以很好的解决，使得纤维素作为药物载体的应用的潜力得到了进一步的提升。应用新的工艺，在消毒混合型生物纤维素膜之后，我们将水溶性的生长因子(已灭菌)通过移液枪转移到所制得的混合型生物纤维素膜表面(已消毒)，进而使生长因子水溶液完全被混合型生物纤维素膜吸收从而完成药物装载。实验数据表明，以此方法装载的牛血清白蛋白可以达到最多长达十二天的可持续性释放。进一步地证明了所制得的混合型生物合成纤维素膜在药物装载上的简易性。
附图说明
图1是测试例1中的混合型生物合成纤维素溶胀率变化曲线图。
图2是测试例2中的混合型生物合成纤维素膜样品的机械性能测试图。其中，(a)代表样品bbc1-5的应力vs应变曲线；(b)代表各样品杨氏模量；(c)代表各样品极限抗拉强度；(d)代表各样品断裂延伸率。
图3是测试例3中的原态生物合成纤维素(bc)与混合型生物纤维素(bbc)的扫描电镜图像。
图4是测试例4中的混合型生物纤维素膜样品bbc5的药物释放曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种技术方案：
一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，该可控纤维素膜质量的制备方法包括如下步骤：
s01、将菌株a接种至hestrin-schram培养基中，在26℃的温度条件下，静态培养7天，提取得到原始生物合成纤维素膜。
s02、将得到的原始生物合成纤维素膜转移至50℃、浓度为0.1m的氢氧化钠溶液中，搅拌洗涤后，得到初步纯净的生物合成纤维素膜。
s03、将由上述步骤得到的初步纯净的生物合成纤维素膜经蒸馏水洗涤，即可得到生物合成纤维素膜。
s04、取得到的生物合成纤维素膜，加蒸馏水混合，粉碎，得到纸浆。
s05、称取定量的纸浆，抽滤40分钟得到初始样品的质量。
s06、设初始样品的质量为m，mx表示第x次实验测量得到的初始样品质量，x＝1,2,3…。
设步骤s010中得到的混合型生物合成纤维素膜的质量为n，nx表示第x次实验测量得到的混合型生物合成纤维素膜的质量，x＝1,2,3…；
通过将mx与对应的nx进行数据统计和回归，得到如下关系式：
nx＝mx*0.1518。
s07、将待测初始样品的质量代入上述关系式进行计算，得到生产所要求的混合型生物合成纤维素膜(n)对应所需纸浆的质量(m)。
s08、称取由步骤s07中计算得到的纸浆质量m,即是步骤s05中的纸浆，用于进行第s05步骤。
s09、上述纸浆经buchner多孔圆盘过滤器过滤，过滤时间为40分钟，即可得到混合型生物合成纤维素膜。
s010、得到的混合型生物合成纤维素膜在-20℃的温度条件下冷冻24小时，冷冻干燥后，得到最终的混合型生物合成纤维素膜，可置于真空干燥皿保存。
测试例1
如图1所示，本测试例对混合型生物合成纤维素膜的溶胀性能进行了测试，测试包括以下步骤：
(1)制备五个纤维素含量不同的混合型生物合成纤维素膜，质量依次递增，
分别命名为样品bbc1，bbc2，bbc3，bbc4，和bbc5；
(2)干燥的样品首先进行称量(wdry)，将其浸泡在37℃的pbs缓冲液中(ph7.4)；随后在特定的不同的时间点，将溶胀的纤维素膜取出再次称量(wswo)。样品的溶胀率通过下列公式进行计算；
其中，由图1中的数据可以得出，样品bbc1-5的溶胀率随质量依次增加呈下降趋势。例如样品1展现出了最高的溶胀率而样品5展现了最低的溶胀率。值得一提的是，所有样品的溶胀率都在前五个小时之内快速上升并且在四十八小时之后基本保持恒定。由于药物的包埋是基于混合型生物纤维素膜对被包埋药物的水溶液的吸附原理，这说明水溶性的药物可以顺利的包埋在制得的纤维素膜里。
测试例2
如图2所示，本测试例为了表征混合型生物合成纤维素膜的机械性能，对实施例1溶胀后的纤维素膜进行了抗拉伸测试。测试包括以下步骤：
(1)实施例1中的五个样品被剪裁成尺寸一致的长方形(尺寸：25mmx10mm)；
(2)测试的环境参数为25±2摄氏度，相对湿度为45±5％；
(3)将测试的样品在instronelectropulstme3000all-electricdynamictestinstrument(norwood,ma)仪器上进行拉伸测试。拉伸测试速度设置为5mm/min且负载单元动态率被设定为±250n。样品测试数据通过
由数据图2知，随着样品中纤维素质量的增加，所制得的纤维素膜样品的杨氏模量和极限抗拉强度也随之提高。这个变化趋势同时说明混合型纤维素膜的机械强度是可以通过调节纤维素膜中的纤维素的质量实现。例如样品bbc5的杨氏模量为0.37±0.02mpa且极限抗拉强度为0.96±0.02mpa；这两项指标数值分别高于对应bbc1样品指标的大约9倍和6倍。然而，样品bbc5的断裂延伸率为3.90±0.75％，与其他样品无显著性差异。
测试例3
如图3所示，为了对比未经本制备工艺处理的(即原态)生物合成纤维素膜与经过本工艺处理的混合型生物合成纤维素膜的微观结构差异，我们对这两种膜的微观结构进行了扫描电镜(sem)的观察，具体包括以下步骤：
将冷冻真空干燥后的生物合成纤维素膜和混合型生物合成纤维素膜分别剪裁成合适的尺寸大小，暴露出横截面，随后用sem(phoenix,az)进行观察。选取样品的上层(原细菌培养中与空气接触的一侧)，下层(原细菌培养中与培养基接触的一侧)，横截面进行观察。上层与下层的放大倍数为300倍，横切面放大倍数为2000倍。
由图3得知，原始生物合成纤维素膜由高度缠绕的纤维素网络组成，且纤维素纤维结构在膜/空气的一侧的密度高于在膜/液体一侧的密度。与之形成反差，混合型生物合成纤维素膜在膜的两侧呈现均匀的纤维素网络结构。此外，通过比较样品bbc1与样品bbc5的sem图像可以得知，随着样品中纤维素含量的增加，样品中的纤维素密度也随之增加并且所得样品中纤维素结构更加致密。这个变化趋势同时说明混合型生物合成纤维素膜的微观结构是可以通过调节膜中的纤维素的质量而实现。
测试例4
为了研究混合型生物合成纤维素膜作为药物载体的可能性，我们对混合型生物合成纤维素膜进行了药物释放的表征，具体包括以下步骤：
(1)表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor,egf)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,fgf2)被用作模型药物来研究混合型生物合成纤维素膜作为药物载体的可能性。
(2)样品bbc5被选为药物载体。
(3)具体装载药物的步骤是：用移液枪吸取70微升分别含有430±10ngegf和fgf2的pbs(ph7.4)溶液，小心地滴在冻干且经过高温消毒后的bbc5上。
(4)加载egf和fgf2的bbc5样品在超净工作台中被静置两个小时确保egf和fgf2溶液完全被bbc5膜吸收；
(5)随后样品bbc5被完全浸末到2ml的pbs(ph7.4)释放液中，温度保持在37℃。
(6)根据预先设置好的取样时间点，每次小心从bbc5释放液中抽取0.32ml样品溶液并保存于-80c，且随后向bbc5释放液中补充相同体积的pbs(ph7.4)释放液。
(7)收集到不同时间点的样品中的egf和fgf2的浓度通过相应的elisa试剂盒测定出来。
由图4得知，bbc5对于egf和fgf2具有相似的释放曲线。两种生长因子在第一天之内都表现有突释效应，且在之后直至第十天均呈现均匀的释放；而在十天之后，释放曲线开始趋平。我们的数据表明egf和fgf2前十天的累计释放量基本相同，分别为397.4±6.9ng和393.6±9.2ng，即分别为原始载药量的92.4％和91.5％。以上数据充分证明了混合型生物合成纤维素作为缓释药物载体的潜在可能性。
1.一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
s01、将菌株a接种至hestrin-schram培养基中，在20～32℃温度条件下，静态培养5-12天，提取得到原始生物合成纤维素膜；
s02、将得到的原始生物合成纤维素膜转移至50℃、浓度为0.1m的氢氧化钠溶液中，搅拌洗涤后，得到初步纯净的生物合成纤维素膜；
s03、将由上述步骤得到的初步纯净的生物合成纤维素膜经蒸馏水洗涤，即可得到生物合成纤维素膜；
s04、取得到的生物合成纤维素膜，加蒸馏水混合，粉碎，得到纸浆；
s05、上述纸浆经buchner多孔圆盘过滤器过滤，过滤时间为30-45分钟，即可得到混合型生物合成纤维素膜；
s06、得到的混合型生物合成纤维素膜在-20℃的温度条件下冷冻24小时，冷冻干燥后，得到最终的混合型生物合成纤维素膜，可置于真空干燥皿保存。
2.根据权利要求1所述的一种生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，在步骤s04之后，还包括如下步骤：
s04.1、称取定量的纸浆，在多孔玻璃过滤器中抽滤40分钟得到初始样品的质量；
s04.2、设初始样品的质量为m，mx表示第x次实验测量得到的初始样品质量，x＝1,2,3…；
设步骤s06中得到的混合型生物合成纤维素膜的质量为n，nx表示第x次实验测量得到的混合型生物合成纤维素膜的质量，x＝1,2,3…；
通过将mx与对应的nx进行数据统计和回归，得到如下关系式：
nx＝mx*0.1518
s04.3、将待测初始样品的质量代入上述关系式进行计算，得到生产所要求一定质量(n)的混合型生物合成纤维素膜对应所需纸浆的质量(m)；
s04.4、称取由步骤s04.3中计算得到的纸浆质量，即是步骤s05中的纸浆，用于进行第s05步骤。
3.根据权利要求1所述的一种生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述菌株a为汉氏葡糖酸醋杆菌。
4.根据权利要求1所述的一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，在步骤s01中，培养温度为26℃，静态培养时间为7天。
5.根据权利要求1所述的一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，在步骤s04中，生物合成纤维素膜和蒸馏水的质量比为1克：15毫升。
6.根据权利要求1所述的一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，在步骤s05中，过滤时间为40分钟。
7.根据权利要求1所述的一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法，其特征在于，混合型生物合成纤维素膜置于培养皿中的温度为-20℃，时间为24小时。
8.如权利要求1～7任一所述的由一种混合型生物合成纤维素膜的制备方法制备得到的混合型生物合成纤维素膜经过121摄氏度，15磅/平方英寸的压力下35分钟消毒后，制备以生物纤维素膜为基底的药物释放载体系。
技术总结