本发明涉及生物医药，具体涉及橙花醇在制备防治阴道炎药物中的应用。
背景技术：
白色念珠菌是人类口腔、上呼吸道、肠道和阴道常见的微生物，它是一种常见的条件性致病真菌，具有完全免疫系统的人不会被白色念珠菌感染(1)。但是对于免疫力低下的病人来说，白色念珠菌的感染往往可能会引起严重的致死性系统感染。目前，白色念珠菌引起的阴道炎是当今社会中比较常见的一种妇科疾病。据资料统计大约70％的处在生育年龄的女性都患过至少1次或者以上的白色念珠菌阴道炎，而且有部分患者治愈后再次发作白色念珠菌引起的阴道炎，其中有一小部分患者会在1年内发生4次或者以上的白色念珠菌引起的阴道炎(2)。这类疾病典型的症状表现为外阴瘙痒和阴道分泌物增多，通常会伴有阴道疼痛、外阴灼热、性交困难和尿痛等症状，并且这种疾病会由性交传染(3)。近年来,临床上往往是采用广谱的抗真菌药物(如氟康唑等)对白色念珠菌引起的阴道炎进行治疗。但是由于广泛使用广谱抗生素及免疫抑制剂等，白色念珠菌引起的阴道炎发病率呈逐年上升的趋势。临床上采用的局部或全身的抗真菌药物,常常会引起阴道的微生态失调，黏膜屏障破坏，停止用药后的复发率又极高，且随着新型抗真菌药物的相继问世临床上也出现了大量的耐药菌株。因此开发安全高效，低毒有效的抗真菌药物成为临床上治疗真菌感染的首要方法。
我国地域辽阔，植被种类丰富，拥有着丰富的中草药资源，并且在长期的研究中发现，一些中药以及草本植物挥发油都有着抗真菌的活性。药用植物作为一种具有治疗潜力的资源已经得到了历史的证明。目前，国内外关于植物精油抗不同的耐药病原菌也有了大量的研究。橙花醇(nerol,nel)是一种从天然植物橙花中提取出的绿色单萜化合物。目前，针对橙花醇抗菌活性的研究报道只有少量关于其抗金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等细菌的描述，而对于橙花醇抗白色念珠菌的研究鲜有报道，且迄今为止，国际上未见有橙花醇对防治阴道炎的研究。本发明将揭示橙花醇对阴道炎的防治作用，为进一步开发临床抗真菌药物做出相应的努力。
相关参考文献如下：
1.bermanj,sudberype.2002.candidaalbicans:amolecularrevolutionbuiltonlessonsfrombuddingyeast.natrevgenet3:918-30.doi:10.1038/nrg948
2.dovnika,gollea,novakd,arkod,
3.
技术实现要素：
本发明的目的在于提供橙花醇的新用途，具体为橙花醇在制备防治阴道炎药物中的应用。
进一步的，所述药物是以橙花醇为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。
进一步的，所述药物中，橙花醇的浓度为1.54μl/ml～6.16μl/ml。
进一步的，所述药物是外用制剂、口服制剂或注射制剂。
进一步的，所述外用制剂为洗剂、涂抹剂或搽剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了橙花醇的一种新用途，即用于制备制备防治阴道炎的药物，通过药物中的橙花醇对白色念珠菌的抑制作用，可以有效防治阴道炎。
附图说明
图1为本发明体外抑制白色念珠菌生长的靶点探究，其中，a图为白色念珠菌在0μl/ml，1.54μl/ml和6.16μl/ml橙花醇处理后生长曲线的测定；b图为0μl/ml，1.54μl/ml和6.16μl/ml橙花醇对白念珠菌生物膜上麦角甾醇合成的影响；c图为0μl/ml，1.54μl/ml和6.16μl/ml橙花醇处理白念珠菌细胞后麦角甾醇的表达量；d图为0μl/ml，1.54μl/ml和6.16μl/ml橙花醇处理后白色念珠菌细胞外液ph的变化；
图2为本发明对体内白色念珠菌载菌量影响，其中，wt组为不感染白色念珠菌的生长对照组；ca组为感染白色念珠菌，且不给药组；2.7mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给2.7mg/kg橙花醇治疗组；10.8mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给10.8mg/kg橙花醇治疗组；20mg/kgfcz组为感染白色念珠菌并每日按体重给20mg/kg氟康唑治疗组。a图为体内接种白色念珠菌的方法；b图为各组小鼠阴道白色念珠菌载菌量结果；c图为造模效果评价图；
图3为本发明对小鼠子宫及阴道表观影响，其中，wt组为不感染白色念珠菌的生长对照组；ca组为感染白色念珠菌，且不给药组；2.7mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给2.7mg/kg橙花醇治疗组；10.8mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给10.8mg/kg橙花醇治疗组；20mg/kgfcz组为感染白色念珠菌并每日按体重给20mg/kg氟康唑治疗组。a图为各组小鼠子宫的表观观察结果；b图为各组小鼠的阴道口观察结果；
图4为本发明对小鼠阴道组织病理检测结果，其中，wt组为不感染白色念珠菌的生长对照组；ca组为感染白色念珠菌，且不给药组；2.7mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给2.7mg/kg橙花醇治疗组；10.8mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给10.8mg/kg橙花醇治疗组；20mg/kgfcz组为感染白色念珠菌并每日按体重给20mg/kg氟康唑治疗组。a图为各组小鼠阴道在40倍镜下碘酸雪夫(pas)染色结果；b图为各组小鼠阴道组织涂布结果。
具体实施方式：
下面将结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：橙花醇对白色念珠菌麦角固醇合成影响测定
用无菌的sdb培养基将新鲜的白色念珠菌进行稀释，通过血球计数板将细胞悬浮液的浓度调整为1×107cfu/ml。将100μl的细胞悬浮液与19ml的sdb培养基以及900μl的橙花醇溶液进行混合培养，使得橙花醇的终浓度0μl/ml，1.54μl/ml和6.16μl/ml(橙花醇溶液用无菌0.1％吐温80配制)。将混合液置于恒温摇床上37℃，200rpm振荡培养12h。培养后5000g离心5min收集白色念珠菌细胞，用无菌水洗涤两次后加入5ml的25％氢氧化钾乙醇溶液，涡旋震荡10min。85℃恒温水浴1h后加入正庚烷水溶液4ml(水：正庚烷＝1:3)，涡旋震荡2min。室温静置至溶液出现稳定的分层后，将上层的正庚烷溶液转移至干净的容器中，于-20℃放置24h。将正庚烷溶液稀释5倍后于全波长紫外分光光度计扫描(λ＝230～300nm)。麦角固醇和去氢麦角固醇[24(28)dhe]，都在波长281.5nm处有吸收峰，但去氢麦角固醇在波长230nm处有也强吸收峰。
麦角固醇含量计算公式：
麦角固醇％ 24(28)dhe％＝[(a281.5/290)xf]/菌丝重量；
24(28)dhe％＝[(a230/518)xf]/菌丝重量；
麦角固醇％＝[(a281.5/290)xf]/菌丝重量-24(28)dhe％；
f：稀释倍数；290和518为常数。
实验结果
如图1b和1c所示，橙花醇抑制了白色念珠菌细胞膜中麦角甾醇的合成，从而破坏了白色念珠菌的细胞膜，导致随着时间的推移白色念珠菌的生长繁殖受到抑制。通过柱状统计图我们可以明显发现对照组的白色念珠菌细胞膜上麦角甾醇的合成较多，而药物治疗组的白色念珠菌细胞膜上的麦角甾醇合成受到破坏。特别是在6.16μl/ml橙花醇处理组中，白色念珠菌细胞膜上的麦角甾醇合成被完全破坏。
实施例2：橙花醇对阴道炎的防护作用验证
1.实验分组
小鼠装笼后被随机分为5组，wt组为不感染白色念珠菌的生长对照组；ca组为感染白色念珠菌，且不给药组；2.7mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给2.7mg/kg橙花醇治疗组；10.8mg/kgnel组为感染白色念珠菌并每日按体重给10.8mg/kg橙花醇治疗组；20mg/kgfcz组为感染白色念珠菌并每日按体重给20mg/kg氟康唑治疗组。
2.模型的构建
免疫抑制模型的构建：本实验选取6周龄大的balb/c(22±2g)雌性小鼠。经适应性饲养一周后，随机分为5组，除wt组外其余组均进行免疫抑制造模。将造模组小鼠在接种前5天开始皮下注射0.2mg苯甲酸雌二醇，每隔一天注射，一直注射至接种后的第一天。在接种当天，首先给小鼠腹腔注射1.2mg/kg的阿托品，然后腹腔注射1.25mg/kg的乌拉坦对小鼠进行麻醉。之后，将20μl的浓度为6×108cfu/ml的白色念珠菌孢子悬浮液注入小鼠阴道腔，以完成小鼠阴道造模。然后根据它们的组别用20μl的药物盥洗阴道，一天两次。于接种4天后，对造模组小鼠阴道进行真菌检验，确保每只小鼠阴道感染白色念珠菌。并在建模后的第六天处死小鼠，用于后续检测。
3.载菌量的测定
小鼠在感染后第六天处死，取小鼠的阴道组织涂布，进行载菌量的检测。将各组织稀释200倍后取100μl涂布于20ml含有20μg/ml氯霉素的sda平板上，sda培养基由葡萄糖40g、蛋白胨10g、琼脂20g溶于1l水后灭菌配制。将涂布后的平板放入37℃的培养箱中培养两天，每组进行3组平行实验，对载菌量进行记数。
4.组织病理检测
造模后第6天处死小鼠，取小鼠阴道组织在4％的多聚甲醛溶液(ph＝7.4)中4℃下浸泡4h，进行组织固定。之后将所有组织浸泡在30％(v/v)的葡萄糖溶液中过夜。然后将组织预冷并制备冷冻切片。将冷冻切片直接入蒸馏水30～60s，使得蒸馏水润湿整个组织。自来水冲洗2～3min，再用蒸馏水浸洗2次。入过碘酸溶液，室温放置5～8min。自来水冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次。入schiffreagent，置于室温阴暗处浸染18min。自来水冲洗10min。入苏木素染色液，染细胞核1～2min。酸性乙醇分化液分化2～5s。自来水冲洗10～15min，更换蒸馏水清洗，使其反蓝。逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，用40倍显微镜观察菌丝的形成和组织形态学的变化。
5.实验结果
5.1橙花醇减少小鼠阴道中白色念珠菌的含量
如图2c所示，白色念珠菌阴道炎的模型造模成功，小鼠阴道盥洗液中可观察到白色念珠菌。如图2b所示，与高浓度橙花醇治疗组和氟康唑处理组相比，接种了白色念珠菌且不予治疗的ca组小鼠阴道中白色念珠菌富集较多，而低浓度及高浓度橙花醇治疗组小鼠阴道的载菌量都大大降低(p<0.001)。尤其是高剂量治疗组小鼠阴道载菌量低于氟康唑治疗组。
5.2橙花醇对小鼠阴道及子宫表观的影响
如图3a所示，ca组小鼠子宫肿胀严重，子宫胀大并呈现透亮状态。而治疗组小鼠的子宫都有所好转，尤其是高浓度橙花醇治疗组，小鼠子宫基本恢复正常。此外与接种不给药的ca组相比，低浓度及高浓度橙花醇治疗组小鼠的阴道分泌物都明显减少(图3b)。小鼠表观观察结果显示了橙花醇在治疗白色念珠菌引起的阴道炎方面是高效的。
5.3橙花醇改善小鼠阴道内组织损伤
通过pas染色我们发现wt组小鼠阴道腔壁较为完整，并且无白色念珠菌的富集。而在ca组中我们能够在阴道腔中发现大量的白色念珠菌的富集，并且腔壁受到破坏。相反，橙花醇处理组的小鼠阴道腔中的白色念珠菌富集有所减少，腔壁也保持了其完整性。pas染色结果显示了橙花醇在治疗白色念珠菌引起的阴道炎方面是高效的。
研究结果证明了橙花醇对白色念珠菌引起的阴道炎有明显的治疗作用。
本发明中橙花醇对白色念珠菌具有显著地抑制作用，且对阴道炎有较好的治疗效果，可用于制备防治白色念珠菌阴道炎的药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.橙花醇在制备防治阴道炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是以橙花醇为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中，橙花醇的浓度为1.54μl/ml～6.16μl/ml。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药剂是外用制剂、口服制剂或注射制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外用制剂为洗剂、涂抹剂或搽剂。
技术总结