本发明涉及没食子酸的新药理用途，尤其涉及没食子酸在逆转猪链球菌对抗生素耐药性中的用途，属于没食子酸的新药理用途领域。
背景技术：
：猪链球菌(streptococcussuis)属于球菌科、链球菌属，是一种球状细菌。多数成短链或成对排列，不形成芽孢，能形成荚膜，革兰氏染色呈阳性。其主要引起脑膜炎、关节炎、心内膜炎、蜂窝织炎以及败血症等症状，严重时甚至引起病猪死亡(韩强.抗s.suisbf中药的筛选及大黄素对毒力基因和luxs的影响[d].东北农业大学,2014.)。猪链球菌分布范围广，在中国曾多处暴发流行，是中国养猪业重要传染病之一。根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，猪链球菌被分为35个血清型(1/2型，1型～34型)。对猪和人致病性较强的猪链球菌主要是1型、2型、1/2型、7型和9型。其中2型猪链球菌致病性强、流行广，是世界范围内被广泛报道的最主要的致病性血清型(wisselinkhj,smithhe,stockhofe-zurwiedenn,etal.distributionofcapsulartypesandproductionofmuramidase-releasedprotein(mrp)andextracellularfactor(ef)ofstreptococcussuisstrainsisolatedfromdiseasedpigsinseveneuropeancountries[j].veterinarymicrobiology,2000,74(3):237-48；gottschalkm,higginsr,jacquesm,etal.characterizationofsixnewcapsulartypesofstreptococcussuis[j].journalofclinicalmicrobiology,1991,29(11):2590-4；higginsr,gottschalkm,boudreaum,etal.descriptionofsixnewcapsulartypesofstreptococcussuis[j].journalofveterinarydiagnosticinvestigation:officialpublicationoftheamericanassociationofveterinarylaboratorydiagnosticians,inc,1995,7(3):405-6.)。细菌耐药性是21世纪的热点问题，即抗菌药物在杀灭或者抑制病原微生物时，病原微生物为了生存，逐渐降低对药物的敏感性，使其更加难以治愈，甚至产生对绝大多数抗菌药物耐药的超级细菌。病原微生物通常通过突变、外排和转移耐药基因等多种方式实现对抗菌药物的敏感性下降(ozt,guveneka,yildizs,etal.strengthofselectionpressureisanimportantparametercontributingtothecomplexityofantibioticresistanceevolution[j].molecularbiologyandevolution,2014,31(9):2387-401.)。目前，随着抗菌药物临床和非临床的普遍应用，猪链球菌耐药率逐年上升(吕媛,郑波,李耘,etal.卫生部全国细菌耐药监测(基础网)报告(2009年度)；proceedingsofthe第8届全国抗菌药物临床药理学术会议暨北京大学临床药理研究所成立三十周年,中国北京,f,2010[c].)，并出现严重的多重耐药现象(jinhuh,jialem,kexins,etal.evolutionanddiversityoftheantimicrobialresistanceassociatedmobilomeinstreptococcussuis:aprobablemobilegeneticelementsreservoirforotherstreptococci[j].frontiersincellularandinfectionmicrobiology,2016,6.)。o-乙酰丝氨酸硫化氢解酶cysm是半胱氨酸生物合成中的关键酶之一，它催化o-乙酰丝氨酸与硫代硫酸盐或硫酸盐共同反应合成l-半胱氨酸(lithgowjk,hayhurstej,coheng,etal.roleofacysteinesynthaseinstaphylococcusaureus[j].journalofbacteriology,2004,186(6):1579-1590.)。因为哺乳动物不直接合成半胱氨酸，没有cysm等半胱氨酸合成酶，所以cysm具有天然药物靶点研发的优势(mozzarellia,costantinog,pecchinic,etal.inhibitorsofthesulfurassimilationpathwayinbacterialpathogensasenhancersofantibiotictherapy[j].currentmedicinalchemistry,2015,22(2))。也有研究表明cysm抑制剂具有抗菌作用(brunnerk,marics,reshmars,etal.inhibitorsofthecysteinesynthasecysmwithantibacterialpotencyagainstdormantmycobacteriumtuberculosis[j].journalofmedicinalchemistry,2016:acs.jmedchem.6b00674.)。本发明人前期研究结果显示cysm是影响猪链球菌泰乐菌素耐药性的潜在的蛋白靶标。计算机辅助药物设计已成为当今研发新药一个有效的手段，被越来越多的学者所重视，可以利用这一技术对已知药物和蛋白靶点进行筛选，从而高效的得到治疗药物。有研究表明多酚类化合物以多种方式发挥其抑菌活性，如抑制核酸合成、破坏细胞膜、中断能量代谢等(cushnietpt,lambaj.antimicrobialactivityofflavonoids[j].internationaljournalofantimicrobialagents,2005,26(5):343-356.)。没食子酸，即3，4，5-三羟基苯甲酸，是一种天然多酚类化合物，其分子量小、毒性低，国内外对其研究主要涉及抗氧化、抗肿瘤、抗突变等。也有研究证明没食子酸对很多细菌，如鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等具有抑菌活性，但相对于抗生素其抑菌效果较低，迄今为止未见其逆转泰乐菌素耐药性的报道。技术实现要素：本发明的主要目的是提供没食子酸在逆转猪链球菌对抗生素耐药性中的用途；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明利用计算机辅助药物设计技术，通过计算机分子模拟对接的手段准确地预测了没食子酸与cysm之间的作用关系，没食子酸与lys44、gly176、gly178、thr179、gly180发生相互作用，形成氢键，作用力极强，由此推测没食子酸作用于cysm，会抑制cysm与其底物的结合，从而使半胱氨酸合成受阻，影响猪链球菌对氧化应激环境的适应，最终影响泰乐菌素的耐药性。本发明进一步诱导了猪链球菌的泰乐菌素耐药菌并进行体外试验。体外试验共检测17种药物，这17种测试药物中仅有没食子酸可以有效逆转猪链球菌对泰乐菌素耐药性：未添加没食子酸时，泰乐菌素对猪链球菌的泰乐菌素诱导株的mic为320μg/ml，添加没食子酸时，泰乐菌素对猪链球菌泰乐菌素诱导株的mic为0.625μg/ml，逆转了512倍。试验证明没食子酸具有良好的逆转猪链球菌泰乐菌素耐药性的作用。本发明进一步提供了一种逆转猪链球菌泰乐菌素耐药性的药物组合物，该药物组合物由有效量的没食子酸和药学上可接受的载体或稀释剂组成。将有效量的没食子酸与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物制剂；通常该药物制剂适合于口服给药和注射给药，也适合其它的给药方法；该药物制剂可以是液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选为10-60％重量的没食子酸。所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在药物组合物中加入其它辅助剂，譬如香味剂和甜味剂。所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)。所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％，最佳用量为0.5-0.7％。所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10－30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％，与总重量比)。本发明以cysm为研究对象，使用计算机辅助药物设计(computer-aideddrugdesign，cadd)技术，通过计算机分子模拟的手段来预测没食子酸与cysm之间的作用，并辅以体外验证实验，揭示cysm对猪链球菌泰乐菌素耐药性的逆转机理，发现没食子酸对猪链球菌的泰乐菌素耐药性具有良好的逆转作用，为治疗猪链球菌相关感染提供科学依据，本发明为解决猪链球菌耐药性问题提供新方向，也为进一步的临床应用奠定了基础。附图说明图1cysm蛋白结构。图2没食子酸与cysm蛋白相互作用图。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验例1没食子酸逆转猪链球菌对泰乐菌素耐药性的试验1材料与方法1.1菌株及试剂猪链球菌atcc700794，购自美国模式培养物集存库；没食子酸(上海陶素生物科技有限公司)；dmso(天津市科密欧化学试剂有限公司)；酒石酸泰乐菌素(上海源叶生物科技有限公司)；thb(青岛高科园海博生物技术有限公司)；cysm蛋白的氨基酸序列(通过序列搜索网站uniprot获得猪链球菌的cysm蛋白的氨基酸序列)；scifinder、swissmodel(来自互联网官方网站)；酶标仪(美国epoch公司)；扫描电子显微镜s-3400n(日本日立公司)。1.2同源模建及筛选通过swissmodel官方网站，得到cysm同源蛋白，构建cysm的三级结构。利用discoverystudio3.0软件用于进行模建蛋白cysm与模板蛋白2egu的结构叠合，以rmsd值为指标进行评价。确定活性中心后，以上述方法得到的配体为活性中心，源于陶素生物公司的天然小分子库作为待筛数据库，使用基于charmm的cdocker方法用于分子对接，cdocker是一个在charmm脚本中编写的蛋白质配体分子对接程序。1.3菌种复苏、传代将猪链球菌atcc700794复苏后接种到thb培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养12h。以相同接种方法对猪链球菌进行传代纯化培养后，即可备用。1.4酒石酸泰乐菌素对猪链球菌最小抑菌浓度的测定(mic)试验操作及结果按照美国临床和实验室标准协会(clsi)推荐的标准微量稀释法进行判定。实验重复三次。1.5猪链球菌泰乐菌素耐药株的诱导根据已测出的mic浓度，用去离子水配制4mic、2mic、mic、1/2mic、1/4mic和1/8mic六个浓度梯度的酒石酸泰乐菌素。取平皿加入6ml无菌thb液体培养基，取猪链球菌标准株接种到无菌thb液体培养基中，将培养基稀释至大约5×106cfu/ml，混匀，依次加入无菌96孔板中，每孔180μl，分别加入为4mic、2mic、mic、1/2mic、1/4mic和1/8mic的泰乐菌素，同时设置阳性对照菌悬液和阴性对照空白培养基于37℃的恒温摇床中200r/min培养24h。选取肉眼可见细菌生长的最大药物浓度进行连续诱导。1.6药物的配制准确称取没食子酸8.5g，溶于10ml50％dmso，药物浓度为850mg/ml，作为储备液。分别取1ml储备液过0.22μm有机相滤膜，再用水稀释后供测量mic使用。准确称取酒石酸泰乐菌素1.28g，溶于10ml水，进行倍比稀释，共稀释12个梯度，药物最大浓度为128mg/ml，最小浓度为0.0625mg/ml，作为储备液。分别取1ml储备液过0.22μm无机相滤膜，再用水稀释后供测量mic使用。1.7菌液的配制取试管置于麦氏比浊仪中，先加一定量的生理盐水，调比浊仪显示100，再加传代后的猪链球菌，调菌液的浓度显示到85。然后用培养液对菌做1000倍稀释备用(约1.0×105cfu/ml)。1.8筛选药物对猪链球菌泰乐菌素耐药性逆转作用的测定设置添加筛选药物(终浓度如表1所示)组、未添加筛选药物组测定猪链球菌的泰乐菌素诱导株对泰乐菌素的最小抑菌浓度(mic)，mic测定试验操作及结果按照美国临床和实验室标准协会(clsi)推荐的标准微量稀释法进行判定。实验重复三次。表1筛选药物终浓度2试验结果2.1同源模建及筛选结果数据显示，与猪链球菌cysm蛋白同源性最高的蛋白编号是2egu，特征相似性高达66.45％，而其他蛋白相似性均低于2egu(≥30％即可进行同源模建)，选择蛋白2egu作为同源模建的模板蛋白，获得蛋白结构，见图1。筛选结果及cas号如表2所示，共筛出17种药物。其中由图2分子对接的相互作用2d及3d图可知，没食子酸与lys44、gly176、gly178、thr179、gly180发生相互作用，形成氢键，作用力强。证明没食子酸与2egu存在相互作用。表2筛选药物及cas号2.2酒石酸泰乐菌素对猪链球菌最小抑菌浓度的测定酒石酸泰乐菌素对猪链球菌atcc700794的mic为0.05μg/ml。2.3筛选药物对猪链球菌泰乐菌素耐药性逆转作用的测定表3筛选药物对猪链球菌泰乐菌素耐药性逆转作用的测定结果名称对泰乐菌素的mic未添加筛选药物320μg/ml绿原酸320μg/ml海藻糖320μg/ml秦皮甲素320μg/ml根皮苷320μg/ml白蜡树苷320μg/ml褪黑糖320μg/ml岩白菜素320μg/ml桃叶珊瑚苷320μg/ml天麻素320μg/ml没食子酸0.625μg/ml,莽草酸320μg/ml豆腐果素320μg/ml肌苷320μg/ml5-羟色胺酸320μg/ml鞣花酸320μg/ml虫草素320μg/ml茶碱乙酸320μg/ml本试验共检测17种测试药物，其中仅有没食子酸可以逆转猪链球菌对泰乐菌素耐药性。未添加没食子酸时，泰乐菌素对猪链球菌的泰乐菌素诱导株的mic为320μg/ml，添加没食子酸时，泰乐菌素对猪链球菌泰乐菌素诱导株的mic为0.625μg/ml，逆转了512倍。当前第1页1 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技术特征：1.没食子酸在制备逆转猪链球菌对抗生素耐药性药物中的用途。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗生素是泰乐菌素。
3.一种逆转猪链球菌对抗生素耐药性的药物组合物，其特征在于，由有效量的没食子酸和药学上可接受的载体或稀释剂组成。
4.按照权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，将有效量的没食子酸与药学上可接受的载体或辅料配合后按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物制剂。
5.按照权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物制剂为口服给药制剂或注射给药制剂。
6.按照权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有0.1％-99％重量的没食子酸，优选为10％-60％重量的没食子酸。
7.按照权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的载体或辅料包括稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂或表面活性剂。
8.按照权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的抗生素是泰乐菌素。
技术总结本发明公开了没食子酸在逆转猪链球菌对抗生素耐药性中的用途。本发明利用计算机辅助药物设计技术通过计算机分子模拟对接手段准确预测了没食子酸与CysM之间的作用关系，由此推测没食子酸作用于CysM会抑制CysM与其底物的结合，使半胱氨酸合成受阻影响猪链球菌对氧化应激环境的适应从而影响泰乐菌素的耐药性。本发明进一步诱导了猪链球菌的泰乐菌素耐药菌进行体外试验，试验证明没食子酸具有良好的逆转猪链球菌泰乐菌素耐药性的作用，没食子酸通过占据CysM酶活性中心来影响泰乐菌素的耐药性。本发明发现没食子酸对猪链球菌的泰乐菌素耐药性具有良好的逆转作用，为解决猪链球菌耐药性问题提供新方向，为进一步的临床应用奠定基础。
技术研发人员：李艳华;董春柳;陈墨;于菲;唐阳;张岳峰;吴桐;刘艳艳
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2020.02.18
技术公布日：2020.06.09
