本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种钾离子通道开放剂的医药新用途。
背景技术：
脑卒中(stroke)又称脑中风，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病。上个世纪70年代，世界卫生组织对脑卒中的定义为脑血管病变引起的神经功能的缺失(worldhealthorganisation，1978)。目前脑卒中是指供应脑组织的血流减少或血管破裂而导致的脑组织的供氧量降低，进而导致脑细胞、组织的死亡/脑梗死。其病因为各种诱发因素引起的脑内动脉狭窄、闭塞或破裂而造成的急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中作为世界三大高发病之一，有很高的致死率和致残率，严重威胁了人民的生命和健康生活质量。近年来，随着我国人口老龄化趋势的不断加剧，脑血管疾病的发病率和患病率逐年上升，据统计中国每年发生脑卒中病人达200万，发病率120-180/10万，致残率高达75％。目前脑卒中在中国的发病率正以每年近9％的速度上升，已成为位居第一的致死病因，而且超过一半患者遗留严重脑功能障碍，带来了巨大的经济负担和社会负担。
根据病因，脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。出血性脑卒中是因为供应脑组织氧和营养的血管破裂出血，限制了血流流向脑组织而导致，它包括脑内血肿和蛛网膜下腔出血。缺血性脑卒中是脑卒中最主要的形式，约占全部脑卒中的87％。缺血性脑卒中血流减少的原因包括血栓形成、栓塞和低灌注压等。血栓形成、栓塞导致的是局灶性或多发局灶性的病变，而低灌注压导致的是全脑的病变。在血管内膜损伤如动脉粥样硬化基础上的血栓形成和栓塞是导致颅内、外动脉狭窄/闭塞性的病变的主要因素。流行病学研究显示，在亚洲，颅内动脉狭窄/闭塞性的病变的比例约占缺血性脑卒中50％。脑卒中病人临床治疗的黄金法则：有效时间窗内(通常为起病6小时内)达到责任血管的再通是成功治疗的关键。静脉溶栓治疗的有效性和安全性虽然得到多项大型临床试验的证实，但存在选择性差、大血管闭塞再通率低等缺点。目前临床上对于缺血性中风的治疗选择框架包括五个治疗领域，即一级预防；再通和溶栓(包括抗血小板疗法、静脉溶栓、血管内血栓切除术)；神经保护；二级预防和神经修复。近年来人们开始探索血管内治疗联合标准静脉溶栓治疗，对改善急性颅内大血管闭塞引起缺血性卒中患者的临床治疗起到较为显著的效果。通过多模式ct或mri等影像学检查，一旦明确存在大血管闭塞及缺血半暗带，应积极争取开展动脉溶栓、取栓等血管内治疗。但是，仍有接近一半的颅内大血管急性闭塞病人基于血流代偿不良等种种原因即使手术也不能明显改善，甚至愈后较差。最新研究表明，在脑组织可挽救的缺血性卒中患者中，在卒中发生后4.5-9小时内使用阿替普酶溶栓剂治疗，可以适当降低和减缓患者的神经功能缺损，但同时诱发的脑出血病例明显高于安慰剂组。因此，对于错过“有效治疗时间窗”以及大部分术后治愈效果不显著的患者，更需要我们从卒中的整体预防着手，控制各种危险因素，积极寻找发病机制，以及针对发病机制展开的药物靶向治疗，从根本和源头上探索和挖掘脑卒中的疾病防治策略。
木犀草素(luteolin)是3’,4’,5,7-四羟基黄酮类化合物，其化学结构式如下，主要存在于菊花、络石藤、羊乳、透骨草、金银花等植物中,具有很高的生物活性。
木犀草素具有较强的通透血脑屏障的能力，通过给实验大鼠灌胃、腹腔注射两种不同的方式测量木犀草素的药代动力学。研究结果显示：(1)灌胃药动学(30mg/kg)的特点是木犀草素的达峰时间(tmax)为0.732h,说明木犀草素在大鼠体内吸收分布较快，显效快。(2)腹腔注射(20mg/kg)药动学的特点是木犀草素的达峰时间(tmax)为0.5h,说明腹腔注射木犀草素在大鼠体内同样吸收分布较快，显效快。现研究发现木犀草素在临床上主要有抗肿瘤、免疫调节的作用。
离子通道是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，它通过残基侧链选择性的与离子相互作用,发挥专一的通透屏障功能，钾离子通道是存在最广泛的一类离子通道,与多种生命活动密切相关。内向整流钾离子通道(kir)是钾离子通道的主要类型之一，它由两次穿膜螺旋和夹于其间的h段构成，是四跨膜结构单孔道。
技术实现要素：
本发明要解决目前缺乏有效安全的脑中风药物的技术问题，提供一种钾离子通道开放剂在制备治疗和/或预防脑中风疾病的药物中的用途。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种钾离子通道开放剂在制备治疗和/或预防脑中风疾病的药物中的用途。
优选的，所述钾离子通道为kir4.1钾离子通道。
优选的，所述脑中风疾病为缺血性脑中风疾病。
优选的，所述钾离子通道开放剂包括木犀草素或其衍生物。在本发明的一个具体实施例中，所述钾离子通道开放剂为木犀草素。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于治疗和/或预防脑中风疾病的药物组合物，所述组合物包含安全有效量的钾离子通道开放剂或其可药用盐、和药学上可接受的载体。
上述可接受的载体是无毒的、能辅助施用并且对钾离子通道开放剂或其可药用盐的治疗效果无不利影响。此类载体可以是本领域的技术人员通常能得到的任何固体赋形剂、液体赋形剂、半固体赋形剂或者在气雾剂组合物中可以是气体赋形剂。
本发明的钾离子通道开放剂(如木犀草素)或其可药用盐以治疗上的有效量施用，其施用方式可以是口服、头部施用(例如，透过皮肤的、鼻吸入的制剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。优选的施用方式是口服，它可根据疾病程度调节。
本发明的钾离子通道开放剂(如木犀草素)或其可药用盐的实际施用量(即活性组分)依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、治疗对象的年龄和相对健康程度、所使用的化合物的效能、施用途径和形式，以及其他因素。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使该钾离子通道开放剂(如木犀草素)与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等等。
在本发明的另一方面，还提供了上述药物组合物与至少一种溶栓剂联用在制备治疗脑中风疾病的药物中的用途。
在本发明的另一方面，还提供了一种筛选治疗和/或预防脑中风疾病的候选药物的方法，包括以下步骤：
检测待测化合物对kir4.1钾离子通道的影响，选出对该钾离子通道有开放作用的待测化合物，作为初筛化合物；
检测所述初筛化合物对脑中风疾病的治疗或缓解效果，选出具有疗效的化合物，作为候选药物。
本发明的钾离子通道开放剂(如木犀草素)，经脑缺血小鼠实验证实，可以减小tmcao(缺血性脑卒中疾病小鼠模型)小鼠的脑梗死面积，并能明显改善缺血性脑卒中后小鼠的运动能力，有望成为临床缺血性脑中风疾病的治疗和预防药物，应用前景非常广阔。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的ng2胶质细胞在脑缺血小鼠疾病模型中首先出现kir4.1离子通道缺损的实验结果图；
图2是本发明实施例2的ng2胶质细胞kir4.1缺损是导致脑缺血小鼠模型中神经元脱髓鞘的重要因素的实验结果图；
图3是本发明实施例3的缺血性脑卒中患者脑组织样本kir4.1、mbp等相关蛋白的细胞生化检测结果图；
图4是本发明实施例4的木犀草素可以有效引起kir4.1钾离子通道开放的实验结果图；
图5是本发明实施例5的木犀草素可以减小tmcao后小鼠的大脑梗死面积的实验结果图；
图6是本发明实施例6的木犀草素可以改善tmcao后小鼠的运动能力的实验结果图；
图7是本发明实施例7的木犀草素可以促进tmcao后小鼠的髓鞘恢复的实验结果图。
具体实施方式
本发明通过实验发现，在脑缺血(缺血性脑卒中)疾病中，表达在神经胶质细胞的kir4.1钾离子通道(又称内向整流钾离子通道4.1亚型)受损，引起神经功能损伤和神经元脱髓鞘。通过这类钾离子通道的开放剂(例如：木犀草素)可以使通道功能恢复正常，从而使损伤的神经元功能恢复。本发明的kir4.1钾离子通道，使木犀草素等钾离子通道开放剂药物通过对神经胶质细胞的作用，达到神经元功能恢复的效果。
下面通过实施例详细描述以木犀草素为例的钾离子通道开放剂药物作用于胶质细胞kir4.1钾离子通道(又称内向整流钾离子通道4.1亚型)，对脑缺血疾病的神经功能进行修复。
实施例1ng2胶质细胞在脑缺血小鼠疾病模型中首先出现kir4.1离子通道缺损
利用大脑中动脉栓塞小鼠脑缺血疾病模型(tmcao)，分别检测海马区缺血损伤侧和对照侧的ng2胶质细胞和星形胶质细胞基本膜电学特性。结果发现ng2胶质细胞的静息膜电位明显去极化，膜阻抗也明显增加，提示胞膜表达的离子通道受损。而星形胶质细胞两侧均无明显差异(图1a-d)。进一步通过钡离子阻断kir4.1通道电流，发现在tmcao模型中，损伤侧ng2细胞主要引起kir4.1通道电流的显著缺失，但ng2细胞数量并没有明显改变(图1e-f)。对星形胶质细胞进一步分析，其kir4.1通道电流及细胞数量在两侧并没有显著变化(图1g-h)。
实施例2ng2胶质细胞kir4.1缺损是导致脑缺血小鼠模型中神经元脱髓鞘的重要因素
通过免疫组织荧光化学实验，结果表明在脑缺血小鼠的梗死侧，ng2胶质细胞kir4.1通道蛋白的缺损引起髓鞘蛋白osp的染色明显降低，这一结果在kir4.1条件性敲除小鼠上得到重复验证(图2a和b)。透射电镜结果进一步证明，在脑缺血小鼠模型的梗死侧，神经元髓鞘的厚度和g-raito都发生了明显改变，而在kir4.1条敲的小鼠中，同样引起了神经元髓鞘的丢失(图2c和d)。由此证明，ng2胶质细胞表达kir4.1通道的缺损在脑缺血损伤中可能是引起神经元髓鞘损伤的重要病理因素。
实施例3缺血性脑卒中患者脑组织样本kir4.1、mbp等相关蛋白的细胞生化检测
为验证以上ng2胶质细胞表达的kir4.1离子通道是引起神经元髓鞘损伤的关键因素，本发明进一步在缺血性脑卒中临床患者术中切取的脑组织样本中，对kir4.1通道及相关蛋白进行了细胞生化检测。图3a为脑缺血患者及非缺血患者(阴性对照组)的mri影像学检测，可见patient2脑缺血患者有明显的缺血梗死灶(如红色箭头所示)。图3b为脑缺血患者及非脑缺血病人脑组织样本的kir4.1通道蛋白、ng2蛋白、gfap以及mbp髓鞘蛋白的免疫印迹实验。结果表明，在脑缺血患者的脑组织样本中，kir4.1、ng2、mbp明显降低。提示表达在ng2胶质细胞的kir4.1离子通道更可能发生了损伤和丢失，同时，患者轴突髓鞘蛋白mbp也几乎全部丢失。
实施例4木犀草素(luteolin)可以有效引起kir4.1钾离子通道的开放
为检测木犀草素是否可以作为kir4.1钾离子通道的有效开放剂，本发明首先构建了plvx-cmv-kcnj10-ires-mcherry质粒，图4a为构建图谱。分别记录转染plvx-ires-mcherry作为对照质粒的hek293细胞和转染plvx-cmv-kcnj10-ires-mcherry的hek293细胞，如图4b，c所示，膜片钳电生理记录的电流-电压(i-v)曲线图，结果显示当电压钳制在-140mv时，kir4.1通道可产生近-2.5na的内向电流。图4d为运用同样的实验记录方法，在给予不同剂量luteolin时引起的电流增加值。结果提示在lut100μm浓度时，会引起kir4.1通道电流近20％的增加。由此证明，木犀草素可以有效地作为kir4.1通道开放剂，以进行下一步的脑缺血疾病干预治疗研究。
实施例5木犀草素可以减小tmcao(缺血性脑卒中疾病小鼠模型)小鼠的脑梗死面积
为了研究木犀草素是否可以减小tmcao后小鼠的脑梗死面积，先建立缺血性脑卒中疾病小鼠模型。由上海交通大学医学院实验动物中心订购c57背景的实验小鼠，并对小鼠进行tmcao造模和假手术，梗死时长均为40min，随机分组为saline组(对照组，n＝6)，木犀草素组(n＝7)和sham组(假手术组，n＝9)，对木犀草素组小鼠每天腹腔注射木犀草素30mg/kg，mri影像学观察小鼠脑梗后1，3，6，9天的脑部梗死面积并对其进行统计学分析。
检测结果如图5所示，图5-a为小鼠经过治疗后的mri(magneticresonanceimaging)示意图，其中红色越深代表的是梗死的核心区域，颜色变浅变蓝则是代表的水肿区域，梗死免疫的统计包含了梗死的核心区域和水肿区域。图5-b为该项实验的基本流程图。图5-c为梗死面积的统计图。研究结果表明经过木犀草素治疗的脑缺血小鼠在给药后第3天起，其脑部梗死面积逐渐减小，至给药第6和第9天，脑梗死面积较对照组、假手术组均达到明显统计学差异。
实施例6木犀草素可以改善tmcao后小鼠的运动能力
通过对小鼠的gridwalking(网格步行)、cornertest(转角实验)、rotarodtest(转棒实验)以及mnss(改良神经功能损伤评分)等一系列行为学分析，结果如图6所示，经过木犀草素治疗的小鼠，其运动功能在治疗后6天均得到了明显改善。图6-a为网格步行实验，是检测动物脑损伤后是否精确控制后爪放置能力的一种评价方法，是评价中风后脑功能恢复的重要指标，可以看到，与saline组小鼠相比，木犀草素组小鼠在第6天的精确控制后爪放置能力有了显著改善；图6-b显示的是cornertest(转角实验)，检测小鼠脑损伤后不对称感觉功能运动障碍，是评价中风后功能恢复的重要指标，同样可以看到与saline组小鼠相比，木犀草素组小鼠不对称感觉功能障碍自给药第6天起有了明显恢复；图6-c为rotarodtest(转棒实验)，是检测小鼠运动功能的指标，在第6天时，与saline组小鼠相比，木犀草素组小鼠运动功能也开始有了一定程度的恢复；图6-d为改良版神经学功能评分，主要是评价小鼠中风后一系列神经功能恢复的综合指标，自第6天起，木犀草素组小鼠与saline组小鼠相比，神经功能的综合恢复能力有了明显的提升和改善。
实施例7木犀草素可以促进tmcao小鼠的髓鞘修复
先前研究已经报道tmcao脑缺血小鼠可引起中枢神经系统的轴突脱髓鞘。为了研究木犀草素是否可以通过促进髓鞘的再生恢复小鼠运动功能，作了如下实验。首先从上海交通大学医学院实验动物中心订购c57背景的小鼠，并进行tmcao造模和假手术，梗死时长均为40分钟，随机分组为saline组(n＝3)，木犀草素组(n＝3)，对木犀草素组小鼠每天腹腔注射木犀草素30mg/kg，在第9天的时候，用2.5％的戊二醛灌流，取出脑组织并分离大脑皮层，4℃避光过夜固定于2.5％的戊二醛。24h后去除修整为1x1x2mm3的组织块，送样至浙江大学冷冻电镜平台中心处理观察。实验结果如图7所示：图7-a、d分别为23000x显微放大倍数的透射电镜拍摄的saline组和木犀草素组的小鼠的梗死侧和对侧皮层的髓鞘图片；图7-b、e为saline组和木犀草素组的小鼠两者之间双侧皮层髓鞘的g-ratio拟合曲线图；图7-c为g-ratio统计分析图，图7-f为髓鞘厚度统计分析图。以上结果显示木犀草素对于tmcao后小鼠的髓鞘修复有明显的促进作用。
综上所述，在脑缺血小鼠及临床患者脑组织标本中，胶质细胞kir4.1离子通道有了严重功能缺损，并继而引起神经元髓鞘丢失和神经功能损伤。木犀草素或其小分子化学提纯物可以靶向kir4.1通道使其开放和功能恢复，通过对脑缺血小鼠的各项功能恢复实验指标分析，木犀草素或其小分子化学提纯物对该疾病的预防和治疗可达到显著疗效，可以作为临床缺血性脑卒中的潜在新药靶标。鉴于该中药制剂已经在临床其它疾病中开展辅助治疗，其毒性和副作用已达到临床用药的评估标准，因而对于推动该药在脑卒中疾病的临床普及治疗将更为简便、快捷。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.钾离子通道开放剂在制备治疗和/或预防脑中风疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钾离子通道为kir4.1钾离子通道。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脑中风疾病为缺血性脑中风疾病。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述钾离子通道开放剂包括木犀草素或其衍生物。
5.一种用于治疗和/或预防脑中风疾病的药物组合物，所述组合物包含安全有效量的钾离子通道开放剂或其可药用盐、和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述钾离子通道为kir4.1钾离子通道。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述钾离子通道开放剂包括木犀草素或其衍生物。
8.权利要求5至7中任一项所述药物组合物与至少一种溶栓剂联用在制备治疗脑中风疾病的药物中的用途。
9.一种筛选治疗和/或预防脑中风疾病的候选药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
检测待测化合物对kir4.1钾离子通道的影响，选出对该钾离子通道有开放作用的待测化合物，作为初筛化合物；
检测所述初筛化合物对脑中风疾病的治疗或缓解效果，选出具有疗效的化合物，作为候选药物。
技术总结