本发明属于生物医药领域，涉及圣草酚的应用，具体涉及圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用。
背景技术：
胶质瘤具有侵袭性强、恶性进展迅速、治愈率极低等特点，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅脑肿瘤的81％，中位生存期不足一年，发生率和死亡率均排在中枢神经系统肿瘤中的首位。由于胶质瘤高浸润性生长的生物学特性，手术几乎无法保证肿瘤的完全切除，术后复发率近100％，且恶性程度也会迅速升高，因此化疗在胶质瘤的综合治疗中仍有重要地位。烷化剂替莫唑胺(temozolomide,tmz)是目前临床治疗胶质瘤的一线化疗药物，但仍难以达到遏制肿瘤生长复发的目的，约有30-40％的胶质瘤患者初始耐药，更多患者会对tmz获得性耐药，或不耐受tmz的血液毒性而被迫停药，成为胶质瘤治疗失败的主要原因。因此，寻求高效低毒的药物是目前胶质瘤治疗亟需解决的问题。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题是提供圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，圣草酚具有抗人脑胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及促近凋亡的作用，且毒副作用小，可作为一种新型的治疗神经胶质瘤药物应用于临床实践中。
为达到上述目的，本发明提出了以下技术方案：圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用。
采用上述技术方案，技术原理以及有益效果为：圣草酚，又名北美圣草素，为一种黄酮类物质，广泛存在于柑橘类水果皮及部分中草药。圣草酚单体为淡黄色结晶粉末，易溶于甲醇，微溶于沸水、热乙醇及冰醋酸。发明人研究发现，圣草酚可以抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进人脑胶质瘤细胞凋亡，可作为一种新型的治疗神经胶质瘤药物应用于临床实践中。
现有技术中，圣草酚的研究领域主要集中在抗氧化、抗炎、抗阿尔茨海默症等药理作用上。圣草酚可激活沉默信息调节因子1(silentinformationregulator1,sirt1)途径，从而阻断nf-κb的下游易位，抑制其活化，从而减轻脂多糖引起的小鼠神经胶质过度活化，减轻脑细胞淀粉样形成，改善小鼠的记忆障碍。现有技术中尚未有使用圣草酚进行神经胶质瘤治疗的报道。并且由于黄酮类化合物在植物界分布很广，甚至在人们日常生活中用到的蔬菜、水果中有相当大的含量，正是由于黄酮类物质的广泛存在，让人们忽视了圣草酚这一种黄酮类物质作为抗癌物质的潜能。
发明人在筛选新型抗癌药物的研究中，通过大量研究和筛选，发明人从众多物质中意外发现，圣草素对人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭均有抑制作用，并且能够促进人脑胶质瘤细胞凋亡。发明人利用cck-8实验、细胞平板克隆实验、细胞免疫荧光实验、流式细胞术检测细胞凋亡及周期实验，划痕愈伤实验、transwell迁移及侵袭实验评估了圣草酚的抗人恶性脑胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移和促凋亡的活性，发现了圣草酚的新性质，并拓宽了圣草酚的应用范围。
许多天然产物通过多靶点、多途径、多环节来发挥抗肿瘤作用，因此，从分子水平出发，阐明天然药物抗肿瘤的机制，对于开发抗肿瘤药物、提高临床治疗效果具有重要意义。为明确圣草酚的分子作用机制，发明人对圣草酚进行了深入研究，通过westernblot检测等研究手段，研究了凋亡相关信号通路pi3k/akt/nf-κb的表达情况，表明圣草酚促胶质瘤细胞凋亡机制与下调pi3k/akt/nf-κb信号通路有关。
进一步，圣草酚的结构式为：
采用上述技术方案，圣草酚是b环上具有邻二酚羟基的黄酮，体内代谢途径清晰，安全可靠。
进一步，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞增殖抑制剂。
采用上述技术方案，圣草酚具有抑制人脑胶质瘤细胞增殖的作用，可以作为一种细胞增殖抑制剂来实现抗癌效果(数据见实施例1和2)。在本方案中，肿瘤细胞增殖是指肿瘤细胞以细胞分裂的方式产生新的细胞。
进一步，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞迁移抑制剂。
采用上述技术方案，圣草酚具有抑制人脑胶质瘤细胞迁移的作用，可以作为一种细胞迁移抑制剂来实现抗癌效果(数据见实施例3和4)。在本方案中，肿瘤细胞的转移是指肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔部位，肿瘤细胞被血流、淋巴流带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。
进一步，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞侵袭抑制剂。
采用上述技术方案，圣草酚具有抑制人脑胶质瘤细胞侵袭的作用，可以作为一种细胞侵袭抑制剂来实现抗癌效果(数据见实施例4)。在本方案中，肿瘤细胞的侵袭是指肿瘤细胞从原发瘤或继发瘤向邻近的宿主组织侵犯或占领。
进一步，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞凋亡促进剂。
采用上述技术方案，圣草酚具有促进人脑胶质瘤细胞凋亡的作用，可以作为一种细胞凋亡促进剂来实现抗癌效果(数据见实施例5)。在本方案中，肿瘤细胞凋亡是指由基因控制的肿瘤细胞自主的有序的死亡。
进一步，圣草酚体外抑制人恶性胶质瘤细胞增殖的浓度为10-40μm。
采用上述技术方案，使用10-40μm的圣草酚处理人恶性胶质瘤细胞12天，人恶性胶质瘤细胞的增殖可被显著抑制。
进一步，圣草酚体外抑制人恶性胶质瘤细胞迁移的浓度为25-100μm。
采用上述技术方案，使用25-100μm的圣草酚处理人恶性胶质瘤细胞12-24小时，可显著的抑制胶质瘤细胞的迁移。
进一步，圣草酚体外抑制人恶性胶质瘤细胞侵袭的浓度为25-100μm。
采用上述技术方案，使用25-100μm的圣草酚处理人恶性胶质瘤细胞24小时，可显著的抑制胶质瘤细胞的侵袭。
进一步，圣草酚体外促进人恶性胶质瘤细胞凋亡的浓度为25-100μm。
采用上述技术方案，使用25-100μm的圣草酚处理人恶性胶质瘤细胞48小时，可以将肿瘤细胞的细胞周期阻滞在s期，并促进细胞凋亡。
附图说明
图1为实施例1中的cck-8法检测结果(u87mg)。
图2为实施例1中的cck-8法检测结果(chg-5)。
图3为实施例2中的平板克隆法检测结果。
图4为实施例2中的平板克隆法检测计数结果(u87mg)。
图5为实施例2中的平板克隆法检测计数结果(chg-5)。
图6为实施例3中的细胞划痕实验检测结果(u87mg)。
图7为实施例3中的细胞划痕实验检测结果(chg-5)。
图8为实施例3中的细胞划痕实验的划痕愈合率柱状图(u87mg)。
图9为实施例3中的细胞划痕实验的划痕愈合率柱状图(chg-5)。
图10为实施例4中的transwell实验检测结果(细胞染色)。
图11为实施例4中的transwell实验细胞迁移计数结果(u87mg)。
图12为实施例4中的transwell实验细胞侵袭计数结果(u87mg)。
图13为实施例4中的transwell实验细胞迁移计数结果(chg-5)。
图14为实施例4中的transwell实验细胞侵袭计数结果(chg-5)。
图15为实施例5中的流式细胞术检测结果(展示圣草酚对细胞周期的影响)。
图16为实施例5中的流式细胞术检测结果(u87mg在g1、g2和s期的分布情况)。
图17为实施例5中的流式细胞术检测结果(chg-5在g1、g2和s期的分布情况)。
图18为实施例5中的流式细胞术检测结果(展示对细胞凋亡的影响)。
图19为实施例5中的流式细胞术检测细胞凋亡率的统计结果(u87mg)。
图20为实施例5中的流式细胞术检测细胞凋亡率的统计结果(chg-5)。
图21为实施例5中的使用荧光染料检测细胞凋亡的结果。
图22为实施例5中的westernblot检测细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的实验结果。
图23为实施例5中的westernblot检测pi3k/akt/nf-κb通路相关蛋白的实验结果。
具体实施方式
在各实施例中，使用到的圣草酚均购自大连美仑生物，纯度≥98％，化学结构如下：
实施例1：圣草酚体外抑制人胶质瘤细胞增殖实例
利用cck8试剂盒分别检测不同浓度梯度的圣草酚处理后的不同胶质瘤细胞，评价圣草酚的体外抗肿瘤活性。供试的胶质瘤细胞株为u87mg和chg-5，均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。实验步骤如下：
1)接种细胞于96孔板并使之生24h，然后加入不同浓度的圣草酚(0,25,50,100,200,400μm)，分别孵育24h、48h和72h，然后开始检测。
2)在细胞培养液中直接加入1/10体积的cellcountingkit-8(cck-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，但不可有气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。
3)继续培养1-4h至颜色变为橙色。
4)用酶标仪读取450nm光吸收值。
5)细胞活力计算，计算方法如下：
细胞活力(％)＝[a(药物 )—a(空白)]/[a(药物-)—a(空白)]×100％
a(药物 )：具有细胞、cck-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；
a(药物-)：具有细胞、cck-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度；
a(空白)：具有培养基和cck-8溶液而没有细胞的孔的吸光度。
实验结果如图1和图2所示，图中展示了不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg48h后对细胞增殖的影响。由实验结果可知：圣草酚对胶质瘤细胞的抑制随着浓度的增加而增加，并且孵育时间越长，对肿瘤细胞的杀伤力越强，对u87mg和chg-5胶质瘤细胞的抑制作用非常明显，圣草酚能够以时间和浓度依赖的形式显著的抑制胶质瘤细胞的增殖。
实施例2：圣草酚体外抑制人胶质瘤细胞增殖实例
通过细胞在细胞培养板上的克隆形成能力来评价细胞的增殖能力，主要实验步骤如下：于6孔板培养板中各实验组接种500个细胞，然后给予含有不同浓度的圣草酚(0,10,20,40μm)共培养12d，每三日换一次培养基，12d后加入4％多聚甲醛于4℃固定1h，然后用结晶紫染色15min，用超纯水清洗后拍照，计数，实验结果如图3、图4和图5所示。图3为细胞染色洗净后的照片，图4和图5为细胞计数结果的柱状图，中反映了不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg12d后对细胞增殖的影响(其中，*、**、***分别表示与对照组相比p＜0.05、0.01、0.001)。实验数据表明，圣草酚能够以浓度依赖的形式显著的抑制胶质瘤细胞的增殖，经过12d的培养，圣草酚已经能显著地抑制chg-5和u87mg细胞的增殖。
实施例3：圣草酚体外抑制人胶质瘤细胞迁移实例
通过在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，然后在不同时间观察划痕“愈合”的情况评价肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。主要实验步骤为：将铺满细胞的六孔板用200μl的枪头划痕，然后加入还有不同浓度圣草酚(0,25,50,100μm)的培养基，孵育12、24h后观察划痕“愈合”的情况。实验结果如图6、图7、图8和图9所示，图6和图7展示了不同培养时间和圣草酚处理浓度的划痕照片，图中用竖直线标记了细胞层的生长边界。图8和图9的柱状图展示的是划痕愈合率，展示了不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg12或24h后对细胞迁移的影响(其中，*、**、***分别表示与对照组相比p＜0.05、0.01、0.001)。实验数据表明，圣草酚阻碍了划痕的修复，浓度越大和作用时间越长抑制效果越强，圣草酚能够以时间和浓度依赖的形式显著的抑制胶质瘤细胞迁移。
实施例4：圣草酚体外抑制人胶质瘤细胞迁移和侵袭实例
使用transwell法评价圣草酚对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响：将transwell小室放入培养板中，小室称上室，培养板称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。在侵袭实验中，在聚碳酸酯膜上涂布基质胶，用以模仿细胞外基质，从而检测肿瘤细胞的侵袭能力。实验中，使用chg-5和u87mg作为供试肿瘤细胞，使用不同浓度的圣草酚(0,25,50,100μm)处理供试细胞，使用圣草酚处理细胞24h后，检测其迁移和侵袭情况。实验结果如图10、图11、图12、图13和图14所示，图10通过细胞染色图片展示两种细胞的迁移和侵袭情况，图11、图12、图13和图14分别展示了不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg24h后对细胞迁移和侵袭的影响(其中，*、**、***分别表示与对照组相比p＜0.05、0.01、0.001，通过测量和计算发生迁移和侵袭的细胞数量来展示圣草酚的对细胞的影响)。实验数据表明，圣草酚能够以浓度依赖的形式显著的抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
实施例5：圣草酚体外影响人胶质瘤细胞的细胞周期和凋亡实例
将胶质瘤细胞(chg-5和u87mg)于六孔板中培养24h，然后给与不同浓度(0,25,50,100μm)的圣草酚处理，48h后用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。实验结果如图15-图20所示，图15-图17中展示了不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg48h后对细胞周期的影响，图18-图20中展示了不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg48h后对细胞凋亡的影响(其中，*、**、***分别表示与对照组相比p＜0.05、0.01、0.001)。实验数据表明，随着圣草酚浓度的增大，两种细胞停留在s期的细胞数量明显增多，形成s期阻滞，通过阻滞了dna合成来阻碍癌细胞分裂增殖，并且圣草酚能够以浓度依赖的形式显著的诱导胶质瘤细胞凋亡。
将胶质瘤细胞(chg-5和u87mg)置于24空板中培养24h，然后将培养基替换为含不同浓度(0,25,50,100μm)的圣草酚的培养基，共培养48h，然后每孔加入hochest33342试剂于37℃孵育10min，用荧光显微镜放大200倍观察细胞凋亡情况。实验结果如图21所示，不同浓度圣草酚作用人胶质瘤细胞chg-5和u87mg48h后对细胞凋亡的影响，图中箭头表示发生凋亡的细胞，随着圣草酚浓度的增加，发生凋亡的细胞明显增多。
对照组和与低、中、高浓度圣草酚共培养后(0,25,50,100μm)，利用westernblot法检测各组胶质瘤细胞中细胞周期蛋白和细胞凋亡相关蛋白(caspase3、8、9，bcl-2，bcl-xl，bax，parp)的表达；同时通过westernblot法检测各组胶质瘤细胞中pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、nf-κb等pi3k/akt/nf-κb通路相关蛋白和基因的表达。capase3、8、9，prrp，bcl-2、bcl-xl、pi3k、p-pi3k等的抗体购自美国cellsignaling公司，使用β-actin作为内参，本实验的供试细胞为chg-5和u87mg。实验结果如图22和图23所示，圣草酚可以明显增加活化的capase3(cleavedcapase3)等蛋白的量，从而触发两种肿瘤细胞的凋亡。随着圣草酚的浓度的增加，磷酸化的pi3k(p-pi3k)的量明显降低，说明圣草酚可以抑制pi3k/akt/nf-κb信号通路。实验数据说明圣草酚诱导胶质瘤细胞凋亡的机制与pi3k/akt/nf-κb信号通路有关。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
1.圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用。
2.根据权利要求1所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，圣草酚的结构式为：
3.根据权利要求2所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞增殖抑制剂。
4.根据权利要求2所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞迁移抑制剂。
5.根据权利要求2所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞侵袭抑制剂。
6.根据权利要求2所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，所述治疗脑胶质瘤药物为人脑胶质瘤细胞凋亡促进剂。
7.根据权利要求3所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，圣草酚体外抑制人恶性胶质瘤细胞增殖的浓度为10-40μm。
8.根据权利要求4所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，圣草酚体外抑制人恶性胶质瘤细胞迁移的浓度为25-100μm。
9.根据权利要求5所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，圣草酚体外抑制人恶性胶质瘤细胞侵袭的浓度为25-100μm。
10.根据权利要求6所述的圣草酚作为治疗脑胶质瘤药物的应用，其特征在于，圣草酚体外促进人恶性胶质瘤细胞凋亡的浓度为25-100μm。
技术总结