本申请涉及医药技术领域，具体而言，涉及trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途。
背景技术：
帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群pd的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,da)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体da含量显著性减少而致病。目前，常见药物有抗胆碱类药物、金刚烷胺药物、mao-b抑制剂、dr激动剂等等。
目前尚未有文献报道trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3能够作用于帕金森病的治疗。
技术实现要素：
本申请的主要目的在于提供trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途，以解决相关技术中的问题。
为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途。
根据本申请的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途：将trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3用于制备预防和治疗帕金森病药物的应用。
进一步的，将所述抑制剂用于制备预防和治疗帕金森病药物的应用时，本申请发现所述抑制剂能够改善黑质多巴胺能神经元的缺失。
另一方面，本申请发现所述抑制剂的浓度为0.15mg/kg，对于预防和治疗帕金森病的效果最佳。
综合上述技术方案，为帕金森病的预防和治疗提供了新的药物，具有良好的市场价值和临床应用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本发明trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的化学结构图；
图2为帕金森小鼠制备及给药时间；
图3为ml-si3联合给药明显改善帕金森模型小鼠的爬杆运动障碍；
图4为ml-si3联合给药明显改善帕金森模型小鼠的转棒运动障碍；
图5为ml-si3联合给药明显改善帕金森模型小鼠的矿场试验运动障碍；
图6为ml-si3联合给药明显改善小鼠的多巴胺能神经元缺失情况荧光检测图；
图7为ml-si3联合给药明显改善小鼠的多巴胺能神经元缺失情况荧光检测分析图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本申请中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“中”、“竖直”、“水平”、“横向”、“纵向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、组件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。
并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。
另外，术语“多个”的含义应为两个以及两个以上。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本申请发现的trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途，将该抑制剂用于制备预防和治疗帕金森病药物的应用。具体地将将所述抑制剂用于制备预防和治疗帕金森病药物的应用时，所述抑制剂能够改善黑质多巴胺能神经元的缺失。所述抑制剂的最佳浓度为0.15mg/kg。
我们前期的研究表明溶酶体阳离子通道trpml1是调控自噬的一个特异性靶点，通过运用trpml1的激动剂或抑制剂改变trpml1通道的活性可以特异性地调控自噬活动。而自噬的缺陷可能是致帕金森病的神经退行性改变的因素之一。所以，以下为本申请为了证实trpml1的特异性小分子抑制剂ml-si3(其化学结构参见图1)对帕金森病具有预防和治疗效果的试验：
首先使用c57b/l小鼠制备帕金森小鼠模型，共分为4组，分别为对照组(control)、1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(mptp)组[4]、mptp联合ml-si3组、ml-si3组。干预方法如下(图2)：
开始实验三天前开始对各组老鼠进行行为学训练，训练时间为3天。对照组、mptp组、ml-si3组分别给予小鼠腹腔注射(ip.)pbs、1-methyl-4-(2′-methylphenyl)-1,2,3,6-tetrahydropyridine(mptp；30mg/kg)、ml-si3(0.15mg/kg)，持续5天。mptp(30mg/kg)联合ml-si3(0.15mg/kg)组提前2天每天给予小鼠ml-si3预处理(0.15mg/kg)，之后再与mptp同时进行腹腔注射，持续5天。各组小鼠于第6、7天分别进行行为学、免疫荧光测试。行为学测试包括爬竿实验(图3)、转棒实验(图4)、及旷场实验(图5)来检测小鼠的运动神经功能。行为学检测结束后我们将小鼠黑质取出，进行免疫荧光实验检测分别黑质区多巴胺能神经元(图6和图7)。
爬杆实验(图3结果所示)所用方法：将一直径为2.5cm的泡沫小球固定于一根长60cm、粗1cm的木杆顶端，然后将小鼠放置在长杆圆球上,记录头朝上转为头向下的时间、爬到杆底时间；我们使用爬杆实验的方法评估各组小鼠的运动功能。mptp给药组小鼠爬到杆底的时间明显大于对照组(p<0.001)，说明使用mptp干预引发小鼠运动障碍，帕金森病小鼠模型制备成功。当mptp联合ml-si3进行干预时，小鼠爬到杆底的时间与mptp组相比有明显减短(p<0.01)，表明联合ml-si3组帕金森病模型小鼠的运动障碍得到有效改善。ml-si3单独给药组老鼠爬到杆底时间与对照组未见明显变化。
转棒实验(结果见图4)所用方法：用xr1514型号的大小鼠转棒疲劳测试仪(购自上海欣软信息科技有限公司)进行检测，设置转速为24r/min，时间为5min。记录大鼠在转棒上的运动时间，测试3次取平均值。在模型制作前要对大鼠进行转棒训练3次。我们使用转棒实验评估各组小鼠的运动能力。mptp给药组小鼠在跌落之前持续在转棒上运动时间明显短于对照组(p<0.001)，说明使用mptp干预引发小鼠运动障碍，帕金森病小鼠模型制备成功。当mptp联合ml-si3进行干预时，小鼠在转棒上持续运动的时间与mptp组小鼠相比有明显增加(p<0.001)，表明联合ml-si3组帕金森病模型小鼠的运动障碍得到有效改善。ml-si3单独给药组小鼠持续在转棒上运动时间与对照组未见明显变化。
矿场实验(结果见图5)所用方法：用xr-xz301型号的4通道旷场视频分析系统和高通量动物行为学视频分析系统supermaze 软件(均购自上海欣软信息科技有限公司)进行检测。测试时间为3min，主要记录大鼠的运动路程及静止时间。图5是使用矿场实验方法评估各组小鼠的运动功能。mptp干预后小鼠在矿场中的运动距离、运动速度明显差于对照组(p<0.001)，说明mptp诱发小鼠的运动障碍，制备帕金森病模型成功。当联合ml-si3后小鼠在矿场中的运动距离、运动速度与mptp组小鼠相比均有显著改善(p<0.001)。ml-si3单独干预组与对照组相比，在矿场中的运动距离、速度未见明显变化。
黑质多巴胺能神经元损伤情况：脑片制备：灌注、固定、切片：小鼠麻醉后经心脏灌注4％paraformaldehyde，取脑后固定，相继用20％和30％的蔗糖平衡，用冷冻切片机切片，厚度为12um，挑选含有黑质核团的脑片进行免疫学染色。
免疫荧光：用兔抗酪氨酸轻化酶(tyrosinehydroxylase，th)抗体(购自sigma公司)和荧光二抗对上述脑片进行染色。主要实验步骤如下：切片用0.0lmol/lpbs洗片3次，每次l0min；试剂盒中含5％羊血清的pbs缓冲液室温下孵育2h；兔抗th抗体(1:1000)40c孵育24h；0.0lmo1/lpbs洗片3次，每次l0min；二抗室温下孵育2h；0.0lmol/lpbs洗片3次，每次l0min；进行荧光显微镜拍摄，计数绿色神经元数量进行统计。
图6和图7我们将行为学评估后的各组小鼠取黑质，进行酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元标记物)免疫荧光检测(绿色)，观测各组小鼠黑质多巴胺神经元缺失情况。与对照组相比，mptp给药组小鼠黑质多巴胺能神经元显现出绿色标记的多巴胺能神经元缺失状况(p<0.001)，说明帕金森病模型小鼠制备成功。当联合ml-si3后，多巴胺能神经元缺失状况与mptp组相比得到一定改善(p<0.001)，表现为绿色标记的多巴胺能神经元与mptp组相比明显增加，说明ml-si3给药可医明显改善帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元缺失现象。
与mptp组帕金森病模型小鼠的运动障碍相比，我们发现与mptp联合ml-si3给药组小鼠的运动神经障碍明显得到改善(图3-图5)。同时我们使用免疫荧光方法检测了黑质区多巴胺能神经元，发现ml-si3给药组的多巴胺能神经元的缺失明显好于mptp组(图6和图7)。
通过以上实验结果证明：ml-si3小分子化和物可以明显改善帕金森病模型小鼠的各项运动障碍及黑质多巴胺能神经元缺失情况。本发明为帕金森病的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
1.trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途，其特征在于，将该抑制剂用于制备预防和治疗帕金森病药物的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，将所述抑制剂用于制备预防和治疗帕金森病药物的应用时，所述抑制剂能够改善黑质多巴胺能神经元的缺失。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂的浓度为0.15mg/kg。
技术总结