本发明属于生物医学领域，涉及甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物在制备治疗和/或预防hcmv药物中的应用。
背景技术：
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,hcmv)属疱疹病毒β亚科，在人群中感染普遍，在健康个体中，hcmv的原发感染多表现为隐性感染，感染缓解后，病毒不能被完全清除，而是长期潜伏在体内。hcmv的感染在免疫活性正常人群中影响不大，但是在免疫功能不全的人中，如艾滋病人和器官移植病人中则是致命的；在孕妇中，由于内分泌和代谢机能的改变，容易激活处于潜伏期的hcmv，造成hcmv复发感染，是造成新生儿先天性疾病的主要病原体，引起黄疸性肝炎、智力低下、失明、耳聋等多器官、多系统病变。膦甲酸钠、西多福韦、福米韦生以及更昔洛韦及其前体缬更昔洛韦等抗病毒药物是目前获准用于治疗hcmv感染的首选药物，但是这些药物主要发挥抑制dna聚合酶的作用，针对病毒侵入靶细胞后的复制翻译阶段起作用，且具有明显的不良反应，如骨髓抑制、肾毒性和引起电解质紊乱等。虽然近年来hcmv疫苗的研发有所进展，但至今尚无hcmv疫苗获准上市。因此，目前市场上仍然缺少安全有效的抗hcmv感染的药物。
寡糖具有多种作用，如影响机体肠道生态和生理的作用，抗凝血、抗老年痴呆、预防帕金森病等功效。但是到目前为止，还未有关于甘露葡萄糖醛酸寡糖在制备预防和/或治疗hcmv药物中的应用。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种毒副作用小，安全有效的抑制hcmv的药物。
本发明提供了甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物在制备抑制hcmv感染的药物中的应用，所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖的结构式为下述一般式(i)或(ii)中的一种或二种；
式中，r为h、na或k中的一种或二种以上，n为0-40之间的整数
(i)
式中，r为h、na或k中的一种或二种以上，n为0-40之间的整数(ii)。
进一步，所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖具有如下特征：
(1)组成糖：甘露糖和葡糖糖醛酸或其盐；
(2)2-连接的甘露糖和4-连接的葡萄糖醛酸或其盐交替连接。
进一步，甘露葡萄糖醛酸寡糖的衍生物为甘露葡萄糖醛酸寡糖的硫酸化衍生物。
进一步，所述甘露葡萄糖醛酸寡糖的硫酸化衍生物为高硫酸化衍生物。
进一步，所述高硫酸化衍生物为高硫酸化的甘露葡萄糖醛酸四糖和/或高硫酸化的甘露葡萄糖醛酸六糖。
进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。
进一步，所述药物制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。
本发明提供了一种抑制hcmv的方法，所述方法为施用有效量的甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物。
进一步，所述甘露葡萄糖醛酸寡糖的结构式为下述一般式(i)或(ii)中的一种或二种；
式中，r为h、na或k中的一种或二种以上，n为0-40之间的整数(i)
式中，r为h、na或k中的一种或二种以上，n为0-40之间的整数(ii)。
进一步，所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖具有如下特征：
(1)组成糖：甘露糖和葡糖糖醛酸或其盐；
(2)2-连接的甘露糖和4-连接的葡萄糖醛酸或其盐交替连接。
进一步，所述衍生物为硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖。
进一步，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖为硫酸化甘露葡萄糖醛酸四糖或硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖。
进一步，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸四糖或硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖为高硫酸化甘露葡萄糖醛酸四糖或甘露葡萄糖醛酸六糖。
进一步，所述甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物可以有效的抑制立即早期蛋白ie1/2和早期蛋白ppul44。
本发明的优点及有益效果：
甘露葡萄糖醛酸寡糖对hcmv具有预防和治疗作用，毒副作用小，安全有效，可以用于hcmv的感染。
附图说明
图1是mtt法测定甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物对wi-38细胞活力的影响图，
其中，
1-甘露葡萄糖醛酸寡糖glcaman(so3h)3-5；
2-甘露葡萄糖醛酸寡糖glcaman(so3h)1-3；
3-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca2man2(so3h)8-11；
4-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca2man2(so3h)5-9；
5-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca2man2(so3h)1-5；
6-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca3man3(so3h)8-15；
7-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca3man3(so3h)4-10；
8-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca3man3(so3h)1-6；
9-甘露葡萄糖醛酸寡糖glcaman；
10-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca2man2；
11-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca3man3；
12-甘露葡萄糖醛酸寡糖glca4man4。
图2是甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物对hcmv感染人胚肺成纤维细胞wi-38后引起的细胞病变影响图，其中，
1-对照组细胞(control)，不感染hcmv；
2-hcmv(moi0.01)感染细胞5天后(5dpi)；
3-膦甲酸(pfa，200μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
4-glcaman(so3h)3-5(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
5-glcaman(so3h)1-3(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
6-glca2man2(so3h)8-11(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
7-glca2man2(so3h)5-9(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
8-glca2man2(so3h)1-5(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
9-glca3man3(so3h)8-15(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
10-glca3man3(so3h)4-10(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
11-glca3man3(so3h)1-6(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
12-glcaman(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
13-glca2man2(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
14-glca3man3(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
15-glca4man4(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)。
图3western-blot法测定甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物对hcmv立即早期蛋白ie1/2和早期蛋白ppul44的影响(gapdh为内参)；其中，
1-阴性对照组细胞(control)，不感染hcmv，没有寡糖处理；
2-hcmv(moi0.01)单独感染细胞5天后(5dpi)；
3-膦甲酸钠(pfa，200μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
4-glcaman(so3h)3-5(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
5-glcaman(so3h)1-3(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
6-glca2man2(so3h)8-11(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
7-glca2man2(so3h)5-9(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
8-glca2man2(so3h)1-5(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
9-glca3man3(so3h)8-15(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
10-glca3man3(so3h)4-10(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
11-glca3man3(so3h)1-6(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)。
图4是western-blot法测定不同浓度的glca2man2(so3h)8-11和glca3man3(so3h)8-15对hcmv立即早期蛋白ie1/2和早期蛋白ppul44的影响图，(gapdh为内参)；其中，
a图：1-阴性对照组细胞(control),不感染hcmv，没有寡糖处理；
2-hcmv(moi0.01)单独感染细胞5天后(5dpi)；
3-膦甲酸(pfa，200μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
4-glca2man2(so3h)8-11(10μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
5-glca2man2(so3h)8-11(50μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
6-glca2man2(so3h)8-11(100μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
7-glca2man2(so3h)8-11(200μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
8-glca2man2(so3h)8-11(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
9-glca2man2(so3h)8-11(1000μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
b图：1-阴性对照组细胞(control),不感染hcmv；
2-hcmv(moi0.01)单独感染细胞5天后(5dpi)；
3-glca3man3(so3h)8-15(10μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
4-glca3man3(so3h)8-15(50μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
5-glca3man3(so3h)8-15(100μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
6-glca3man3(so3h)8-15(200μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
7-glca3man3(so3h)8-15(500μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
8-glca3man3(so3h)8-15(1000μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)；
9-膦甲酸(pfa，200μg/ml) hcmv感染细胞5天后(5dpi)。
图5是qpcr法测定不同浓度的glca2man2(so3h)8-11和glca3man3(so3h)8-15对hcmvdna扩增的影响图，其中，
a图：纵坐标-hcmvdna拷贝数含量(设定单独hcmv感染细胞的阳性对照组为1.0)，横坐标-glca2man2(so3h)8-11不同浓度处理；b图：纵坐标-hcmvdna拷贝数含量(设定单独hcmv感染细胞的阳性对照组为1.0)，横坐标-glca3man3(so3h)8-15不同浓度处理。与hcmv组比较，*p<0.05。
具体的实施方式
本发明通过将甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物作用于hcmv感染的人胚肺成纤维细胞wi-38细胞，研究甘露葡萄糖醛酸寡糖对hcmv的作用及其作用机制，进而探讨甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物抑制hcmv感染的可能性。
在本发明中，术语“治疗”通常涉及治疗和理疗人或动物(例如，在兽医应用中)，其中实现一些期望的治疗效果，例如抑制疾病进展，并包括降低进展率、停止进展率、减轻疾病症状、改善疾病和治愈疾病。也包括作为预防性手段(即，预防)的治疗。在本发明中，例如降低hcmv的感染率、减轻或消灭病毒感染引起的症状等。
本文中所用的术语“有效量”涉及当根据期望的治疗方案给药时，对产生一些期望的治疗效果有效，与合理的收益/风险比率匹配的化合物或材料，包含化合物的组合物或剂型的量。
本发明的药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。药学上可接受的载体包括与药物施用相容的任意和所有物质，包括溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延缓剂，和与药物施用相容的其它物质和化合物。除非到了某一常规介质或试剂与活性化合物不相容的程度，否则考虑其在本发明组合物中的用途。补充的活性化合物也可以整合入组合物。
用于制备其组合物的有用的药物载体可以是固体，液体或气体；因此，所述组合物可以采用片剂、丸剂、胶囊、栓剂、粉末剂、肠包衣的或其它保护的制剂(例如结合于离子交换树脂或包装在脂蛋白泡囊中)、缓释制剂、溶液、混悬剂、酏剂、气溶胶等的形式。所述载体可以选自不同油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如，花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。水，盐水，含水葡萄糖，和乙二醇是优选的液体载体，特别是(当与血液等渗时)用于可注射溶液。例如，用于静脉施用的制剂包括活性成分的无菌水溶液，其通过将固体活性成分溶解于水来产生水溶液，并使得所述溶液无菌来制备。合适的药物赋形剂包括淀粉，纤维素，滑石，滑石，明胶，麦芽，大米，面粉，白垩，硅石，硬脂酸镁，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸酯，氯化钠，无水脱脂乳，甘油，丙二醇，水，乙醇等。组合物可以加入常规药物添加剂比如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂等。合适的药物载体和它们的制剂在e.w.martin的remington′spharmaceuticalsciences中描述。在任何情况中，这种组合物将含有与合适的载体一起的有效量活性化合物，以制备适当剂型用于适当施用于接受者。
在本发明方法的实践中，有效量的本发明的药物(寡糖)及其衍生物通过本领域已知的任何常用和可接受方法进行施用。所述药物可以因此口服(例如，口腔)，舌下，肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、或皮下)，或通过吸入(例如，通过气溶胶)，并且以固体、液体或气体剂型，包括片剂和悬浮液施用。所述施用可以以单个单位剂型以连续治疗或以单个剂量随意治疗进行。
可以以任何方便的施用形式施用本发明的药物，例如，片剂、粉末剂、胶囊、溶液、分散液、混悬剂、糖浆、喷雾、凝胶、乳状液、凝胶、贴片等。这种组合物可以含有药物制剂中常规的成分，例如，稀释剂，载体，ph调节剂，甜味剂，填充剂和其它活性剂。
为了以非肠道给药之外给予本发明的甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物，可能需要用防止其失活的材料对甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物包衣或与甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。
本发明的制剂可以制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。
以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种。
作为一种可选择的方式，所述剂型可以是粉针剂，粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一种或几种。
作为一种可选择的方式，本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物，加或不加赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。
作为本发明的一种可选择的方式，所述剂型可以是小针剂，小针剂的制备以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。
甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该甘露葡萄糖醛酸寡糖或其衍生物加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及的人胚肺成纤维细胞株wi-38和人巨细胞病毒(hcmv)towne株均来自于美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection，atcc)。
实施例1甘露葡萄糖醛酸寡糖的制备
将干海带采用30倍质量的蒸馏水100℃下提取3小时，提取液经过过滤，浓缩后，加乙醇至终浓度为75％沉淀，静置12小时后收集沉淀，沉到经真空干燥得到海带多糖。将海带多糖样品溶于质量浓度为4％的硫酸溶液中(料液比为60mg/ml)加热回流5小时，用氢氧化钡中和至ph＝6-7，离心，上清液浓缩至原始体积的五分之一，浓缩液上活性炭柱层析，首先用蒸馏水平衡，然后用50％-90％乙醇梯度洗脱，将50％-90％乙醇洗脱液浓缩至原始体积的五分之一，蒸去乙醇，直接上bio-gelp4柱层析，分离得到g1、g2、g3、g4，对收集得到的样品进行esi-ms和hplc分析，进一步确认寡糖的结构。结果显示，g1-g4分别为甘露葡萄糖醛酸八糖(glca4man4，gm8)，六糖(glca3man3，gm6)，四糖(glca2man2，gm4)和二糖(glcaman，gm2)。其结构均符合下式所示的结构式：
其中，
g1为甘露葡萄糖醛酸八糖(gm8)，式中n＝3，
g2为甘露葡萄糖醛酸六糖(gm6)，式中n＝2，
g3为甘露葡萄糖醛酸四糖(gm4)，式中n＝1，
g4为甘露葡萄糖醛酸二糖(gm2)，式中n＝0。
实施例2硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖的制备
将实施例1中得到的甘露葡萄糖醛酸寡糖单体gm2、gm4、gm6(甘露葡萄糖醛酸二糖、四糖、六糖)在氮气保护条件下溶于dmf(0.05g/ml)中，再加入不同质量的三氧化硫吡啶盐，室温搅拌24小时。将反应液倒入4倍冰蒸馏水中，中和，sephadexg10脱盐。将洗脱液浓缩，bio-gelp4分离纯化得到glcaman(so3h)1-3、glcaman(so3h)3-5、glca2man2(so3h)8-11、glca2man2(so3h)5-9、glca2man2(so3h)1-5、glca3man3(so3h)4-10、glca3man3(so3h)1-6、glca3man3(so3h)8-15。
实施例3甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物单独处理对wi-38细胞增殖活力的影响
通过mtt法检测细胞活力，方法如下：pd30的人胚肺成纤维细胞wi-38细胞以每孔3000个接种于96孔细胞培养板中，培养24h后加入不同浓度的甘露葡萄糖醛酸寡糖，每一浓度设3个平行孔，并设不加药物的空白对照组和无细胞的溶解对照组。培养48小时后，每孔加入20μlmtt(5mg/ml，用无血清的dmem培养液配制)，37℃、5％co2条件下培养4h，小心吸净孔内液体，每孔加150μldmso，在摇床上轻轻振荡10min，使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度，计算相对细胞活力，以不加药物的空白组细胞活力为100％。实验结果见图1。
实施例4hcmv的接种以及甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物处理
采用pd30的人胚肺成纤维细胞wi-38细胞，用含10％fbs的培养基按照2×104/cm2的细胞量铺板六孔细胞培养板，24小时后更换0.2％fbs的培养基继续培养48小时，通过此种血清饥饿的方法，细胞此时g0/g1同步化，有利于hcmv的感染。之后进行hcmv病毒(towne病毒株)的接种，接种剂量为0.01moi(感染复数)，继续培养至指定时间进行相关检测。进行甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物抗hcmv活性检测时，提前2小时将一定浓度的甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物加至培养基中，而后接种0.01moihcmv，进而观察不同时间细胞形态学变化以及病毒蛋白表达和dna扩增等的变化。
实施例5甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物对hcmv接种后wi-38细胞形态的影响
wi-38细胞接种0.01moihcmv后，三天后可以看到细胞的病变效应，到第五天，病变现象显著；而甘露葡萄糖醛酸寡糖及其硫酸化衍生物能够降低由hcmv引起的细胞病变效应，其中高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11和高硫酸化的六糖glca3man3(so3h)8-15的减弱病变效应最为显著，与阳性药物膦甲酸(pfa，200μg/ml)处理的细胞形态类似，没有出现严重的细胞病变结果(图2)。
实施例6甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物对hcmv病毒蛋白表达的影响
为了确认甘露葡萄糖醛酸寡糖及衍生物的抗hcmv作用，我们进一步检测了其对hcmv立即早期蛋白1/2(ie1/2)和早期蛋白ppul44的表达。细胞培养、寡糖处理以及接种hcmv处理同上述实施例3所述。设立不接种hcmv和没有寡糖处理的阴性对照组(control)，只接种hcmv和没有寡糖处理的病毒对照组，以及各种寡糖及衍生物预处理(500μg/ml)和接种hcmv的实验组。接种hcmv后5天，弃去上清，用pbs洗细胞三次，用中等强度的ripa裂解液裂解细胞后收集细胞样品，测定蛋白浓度后采用相应的ie1/2和ppul44抗体进行western-blot检测，结果显示高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11和高硫酸化的六糖glca3man3(so3h)8-15可以显著抑制hcmv病毒蛋白ie1/2和ppul44的表达(图3)。接下来，选择抗hcmv活性最好的高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11和高硫酸化的六糖glca3man3(so3h)8-15进行抗病毒的浓度梯度检测。细胞培养、寡糖处理以及接种hcmv处理同上述实施例3所述，分别设置六个高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11和高硫酸化的六糖glca3man3(so3h)8-15浓度梯度(10ugμg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml)，按照上述的时间和方法收集细胞样品进行western-blot检测，结果显示高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11在100μg/ml，高硫酸化的六糖glca3man3(so3h)8-15在50μg/ml时就能显著抑制ie1/2和ppul44的表达，并且这种抑制作用呈现明显的浓度梯度依赖性(图4)。
实施例7高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11和高硫酸化的六糖glca3man3(so3h)8-15显著抑制hcmv在宿主细胞中的dna扩增
细胞培养、寡糖处理以及接种hcmv处理同上述实施例3所述。采用qpcr法测定hcmvdna的拷贝数，取10ng总dna，按照iqsybrgreensupermixkit(bio-rad)试剂盒说明进行，所用引物为：上游5′-tctgccaggacatctttctc-3′(seqidno.1)和下游5′-gtgaccaaggccacgacgtt-3′(seqidno.2)。扩增条件：95℃5min，(95℃5sec，60℃30sec)×40循环，经2-△△ct法计算，以接种hcmv的样品的dna拷贝数设置为1，结果如图5所示，glca2man2(so3h)8-11和glca3man3(so3h)8-15能够显著抑制病毒dna的拷贝数，并且呈现明显的剂量依赖性。该实验结果进一步确认高硫酸化的四糖glca2man2(so3h)8-11和六糖glca3man3(so3h)8-15具有较高的抗hcmv活性。
以上描述了本发明的具体实施例，然并非用以限定本发明，本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110>浙江医院
<120>甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物在制备治疗和/或预防hcmv药物中的应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tctgccaggacatctttctc20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gtgaccaaggccacgacgtt20
1.甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物在制备抑制hcmv感染的药物中的应用，其特征在于，所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖的结构式为下述一般式(i)或(ii)中的一种或二种：
式中，r为h、na或k中的一种或二种以上，n为0-40之间的整数
(i)
式中，r为h、na或k中的一种或二种以上，n为0-40之间的整数
(ii)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的甘露葡萄糖醛酸寡糖具有如下特征：
(1)组成糖：甘露糖和葡糖糖醛酸或其盐；
(2)2-连接的甘露糖和4-连接的葡萄糖醛酸或其盐交替连接。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，甘露葡萄糖醛酸寡糖的衍生物为甘露葡萄糖醛酸寡糖的硫酸化衍生物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述甘露葡萄糖醛酸寡糖的硫酸化衍生物为高硫酸化衍生物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述高硫酸化衍生物为高硫酸化的甘露葡萄糖醛酸四糖和/或高硫酸化的甘露葡萄糖醛酸六糖。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。
7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。
8.一种体外抑制hcmv的方法，其特征在于，施用有效量的甘露葡萄糖醛酸寡糖及其衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述衍生物为硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸寡糖为硫酸化甘露葡萄糖醛酸四糖或硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖，优选的，所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸四糖或硫酸化甘露葡萄糖醛酸六糖为高硫酸化甘露葡萄糖醛酸四糖或甘露葡萄糖醛酸六糖。
技术总结