本发明涉及绞股蓝皂苷xlix在改善肝肝脏脂肪代谢及预防和治疗肝肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病中的应用，属于生物医药的
技术领域：
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背景技术：
：肝脏是脂肪合成、运转及利用的主要场所。肝脏能不断地将进入肝内的脂肪酸合成甘油三酯，合成的甘油三酯很快以脂蛋白的形式释放入血液。当储存的脂肪物质过多，血浆中自由脂肪酸水平上升，肝内甘油三酯的合成超过了作为运转工具的脂蛋白的合成，即肝内脂肪的合成与运转平衡失调，就可使肝内脂肪堆积而形成脂肪肝。非酒精性脂肪肝病(nafld)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征。病理学上表现为以肝细胞脂肪变性为主要特征的系列性病变谱，其病变是从单纯的肝脏脂质沉积到脂肪变性继发为脂肪性肝炎，最后导致肝纤维化和肝硬化。nafld对人体的危害性不仅局限于肝脏病变，也是2型糖尿病和心血管疾病等的独立危险因素。随着生活水平的提高，该病在全球呈流行趋势，分布广泛。在我国，nafld已成为继病毒性肝炎后第二位常见肝病，严重威胁人类的健康，但由于其病理机制尚不清楚，故缺乏特异性的药物治疗。目前人们对于nafld的治疗普遍存在认识上的误区，认为临床上降血脂的药物可同样适用于nafld的治疗。其实不然，这是因为高脂血症与nafld其实是完全不同的两种概念，高脂血症是指血液中的甘油三酯和(或)胆固醇含量超过正常值的一种疾病，而nafld是指肝脏内过度的脂质沉积，其成因相对来说更为复杂，除高血脂之外，肥胖、糖尿病、药物及遗传因素也有可能会引起脂质在肝脏的过度沉积，即诱发脂肪肝的形成，所以降低血脂的药物不一定会起到降低肝中脂质含量即治疗脂肪肝的作用。临床研究甚至还发现，许多nafld患者在服用降血脂药物治疗之后，脂肪肝症状反而加重，这是因为许多降血脂药物具有“驱脂”作用，如临床中常用的苯扎贝特(必降脂)、非诺贝特(力平之)，会将血液中的脂类“驱赶”到肝脏之中进行代谢排泄，因肝脏内本来就已有脂肪堆积和脂质代谢障碍，故对大量涌来的脂类难以进行处理，造成更多的脂肪堆积于肝脏，使脂肪肝程度加重。另外，许多降血脂类药物具有肝毒性，如临床上常用的他汀类降脂药物，会导致肝内胆汁淤积，引起黄疸或药物性肝损伤，甚至导致肝硬化和肝功能衰竭，这大大限制了它们在临床上的广泛使用，因此有必要去研发有效且安全的针对nafld治疗的药物。绞股蓝(gynostemmapentaphyllum(thunb)makino)为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，在民间应用广泛，被称为“南方人参”。绞股蓝中含有皂苷、多糖、黄酮、甾醇类、氨基酸及微量元素等多种化学成分。目前普遍认为绞股蓝中主要活性成分为皂苷和黄酮等，已知含有包括绞股蓝皂苷a、绞股蓝皂苷xlix等140余种绞股蓝皂苷以及商陆素、芦丁、槲皮素等10余种黄酮类成分，现代研究表明其具有多重药理学活性，如降糖、降脂、抗炎、抗氧化、免疫调节作用。绞股蓝皂苷xlix(gypenoside-xlix,gyp-xlix)为绞股蓝总皂苷中主要活性成分之一，其结构式如下：而现有技术中对绞股蓝皂苷xlix的主要研究集中于有抗炎、降低血脂、抑制肿瘤生长。迄今尚未见绞股蓝皂苷xlix对改善肝脏脂肪代谢及防治非酒精性脂肪肝相关作用的研究。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了绞股蓝皂苷xlix调控肝脏内甘油三酯含量，调控肝脏内脂肪堆积，调控肝脏内脂肪代谢相关分子表达的作用机制，从而改善肝脏内脂肪代谢的用途。绞股蓝皂苷xlix通过改善肝脏内脂肪代谢，从而可作为预防和治疗非酒精性脂肪性肝病的药物。根据本申请的一个方面，提供了一种绞股蓝皂苷xlix在制备用于改善肝脏脂肪代谢药物中的应用。绞股蓝及绞股蓝总皂苷虽然已被证实具有改善脂肪肝的作用，但绞股蓝及绞股蓝总皂苷均为混合物，组成成分非常复杂。具体有效成分不明确，这就导致了其不良反应不可知、质量控制标准不易控、药理机制阐释不明等诸多问题，从而对其深入的研究、临床上的广泛普及和国际上的认可造成了很大的障碍，所以对包括绞股蓝在内的中药的研究，有必要实现有效成分单体化。绞股蓝总皂苷中的主要成分有140多种，本发明人通过大量的创造性实验发现，绞股蓝总皂苷xlix具有改善肝脏脂肪代谢的作用，从而为预防和治疗肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病提供了新的策略和研究思路。进一步的，所述药物用于预防和/或治疗肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病。肝脏脂肪代谢紊乱，会使得肝脏内脂肪的合成和运转平衡失调，造成肝细胞内脂肪的变性和脂肪堆积。优选的，所述肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病包括非酒精性脂肪肝病、肥胖症和代谢综合征中的至少一种；更优选的，所述肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病为非酒精性脂肪性肝病。进一步的，所述药物用于抑制肝细胞内甘油三酯含量的升高，和/或抑制肝细胞内脂肪堆积。优选的，所述肝细胞内甘油三酯含量的升高为棕榈酸诱导的肝细胞内甘油三酯含量的升高，和/或所述肝细胞内脂肪堆积为棕榈酸诱导的肝细胞内脂肪堆积。进一步的，所述药物的剂型为液体剂型。在本发明的一个实施例中，将绞股蓝皂苷xlix溶解于二甲基亚砜中，能改善非酒精性脂肪肝细胞模型中的脂肪代谢。根据本申请的另一个方面，提供了一种绞股蓝皂苷xlix在调控肝脏甘油三酯含量中的应用，优选的，所述调控肝脏甘油三酯含量为降低肝脏甘油三酯含量。根据本申请的另一个方面，提供了一种绞股蓝皂苷xlix在调控肝脏脂肪堆积中的应用，优选的，所述调控肝脏脂肪堆积为减少肝脏脂肪堆积。根据本申请的再一个方面，提供了一种绞股蓝皂苷xlix在调控肝脏脂肪代谢相关分子表达中的应用。进一步的，所述肝脏脂肪代谢相关分子选自硬脂酰辅酶a去饱和酶、脂肪酸合酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶1、脂肪甘油三酯脂肪酶、脂肪酸转运蛋白和脂肪酸转运蛋白2中的至少一种。优选的，所述肝脏脂肪代谢相关分子为硬脂酰辅酶a去饱和酶。进一步的，所述调控硬脂酰辅酶a去饱和酶表达为调控硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达。优选的，所述调控硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达为下调硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达。优选的，所述转录水平为mrna转录水平。本发明的有益效果为：(1)本发明通过构建非酒精性脂肪肝病的细胞模型，证实了绞股蓝皂苷xlix具有明显改善肝脏脂肪代谢的作用；研究了绞股蓝皂苷xlix可以通过调控肝细胞内甘油三酯，肝细胞内脂肪堆积和肝脏脂肪代谢相关分子表达来改善肝脏脂肪代谢，因此绞股蓝皂苷xlix可应用于预防和治疗脂肪代谢紊乱引起的相关疾病。(2)本发明通过试验发现了绞股蓝皂苷xlix可以降低肝细胞内甘油三酯含量，减少肝细胞内脂肪堆，下调硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达，从而改善肝脏脂肪代谢紊乱，由此可见，绞股蓝皂苷xlix对预防和治疗非酒精性脂肪肝病具有重要的作用。附图说明图1为绞股蓝皂苷xlix对肝细胞内甘油三酯(tg)含量的影响；图2为本发明各实验组细胞的油红染色图；图3为绞股蓝皂苷xlix对硬脂酰辅酶a去饱和酶(scd1)基因表达量的影响；图4为绞股蓝皂苷xlix对脂肪酸合酶(fasn)基因表达量的影响；图5为绞股蓝皂苷xlix对甘油-3-磷酸酰基转移酶1(gpat1)基因表达量的影响；图6为绞股蓝皂苷xlix对脂肪甘油三酯脂肪酶(atgl)基因表达量的影响；图7为绞股蓝皂苷xlix对脂肪酸转运蛋白2(fatp2)基因表达量的影响；图8为绞股蓝皂苷xlix对脂肪酸跨膜转运载体蛋白(cd36)基因表达量的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。下列实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。本发明中，绞股蓝皂苷xlix(纯度>98％)购自成都曼斯特生物科技有限公司，wme培养基购自美国gibco公司，胎牛血清(fbs)购自美国hyclone公司，胰蛋白酶购自美国gibco公司，棕榈酸和油红o购自美国sigma公司，，牛血清白蛋白(bsa)购自瑞士roche公司，甘油三酯(tg)试剂盒购自北京普利莱公司，二甲基亚砜(dmso)(分析纯)购自南京化学试剂有限公司，bca蛋白浓度测定试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司。其它所采用的试剂、原料和设备如未指定，均可从市场购得或是本领域常用的。实施例1非酒精性脂肪肝细胞模型的建立和处理目前对非酒精性脂肪肝病(nafld)的研究常采用的是动物模型，但动物模型存在个体差异大，影响因素多，实验条件不易发控制等不利因素，而细胞模型能较好地克服上述因素，有针对性地研究非酒精性脂肪肝病(nafld)发病的细胞机制，且能进一步缩短药物干预的进程，因此在科研实践当中，尤其在非酒精性脂肪肝病(nafld)的治疗药物上的筛选方面，细胞模型越来越受到研究者的重视及应用，为防治非酒精性脂肪肝病(nafld)提供了新的有希望的选择。肝细胞是一种分化程度很高的细胞，一旦失去体内生存环境，则很快失去分化再生的能力，它的一些生化功能也很快丧失，目前，多采用原代肝细胞培养技术，主要是由于原代肝细胞在一定条件下，在一定的培养期间仍具有体内肝细胞的功能及活性，也最接近和反映体内生长特点，因此，我们在本实验中选择了小鼠肝原代细胞作为研究对象。肝细胞发生脂肪变性是脂肪肝形成的最初变化和基础，本实验采用棕榈酸(pa)(游离脂肪酸的一种)进行脂变诱导，增多的游离脂肪酸(ffa)进入肝细胞内，超过肝脏的氧化能力时，剩余的游离脂肪酸(ffa)酯化为甘油三酯(tg)，从而导致脂质在肝内蓄积形成肝脂肪变化，从而建立非酒精性脂肪肝病的细胞模型。建立和处理非酒精性脂肪肝细胞模型的具体操作如下：(1)小鼠肝原代细胞提取将小鼠麻醉后固定在无菌手术台上，沿腹正中线剪开小鼠皮肤，打开小鼠腹腔，暴露门静脉，用套管针刺入门静脉，用平衡液灌流，冲出肝组织中的血液，血水冲出之后灌入肝消化液，使肝脏中的间质消化，待肝脏消化完全之后，取出肝脏，在大平皿中撕碎后过滤，再经过离心，将小鼠肝原代细胞以密度3～5×105/ml放入到含20％胎牛血清(fbs)的wme培养基中培养。(2)细胞培养案例小鼠肝原代细胞置于含20％fbs的wme培养基中(wme培养基包含地塞米松20ng/ml、胰岛素5mg/l、转铁蛋白5mg/l、青链霉素双抗50iu/ml、谷氨酰胺2nm)，在37℃，体积分数为5％co2细胞培养箱中孵育24h后，得到肝细胞培养液。(3)采用浓度为0.4mmol/l的棕榈酸(pa)诱导小鼠肝原代细胞，诱导时间为20小时；空白对照组采用与pa等体积的牛血清白蛋白(bsa)处理，bsa为溶解pa的溶剂，处理时间为20小时。先将绞股蓝皂苷xlix溶于溶剂dmso中，得到浓度为6mmol/l绞股蓝皂苷xlix溶液，将50μl的绞股蓝皂苷xlix溶液加入到1ml的肝细胞培养液中；同样，将相同体积不含绞股蓝皂苷xlix的dmso加入到肝细胞培养液中作为阴性对照，处理时间为24小时，即在加入pa或bsa处理之前先加入绞股蓝皂苷xlix或dmso干预4小时，然后加入48μl的pa或bsa处理20h，得到四个处理组：空白对照组(dmso bsa)，模型对照组(dmso pa)组，xlix bsa组，xlix pa组。研究绞股蓝皂苷xlix对肝细胞内甘油三酯(tg)、脂肪堆积和脂肪代谢相关分子的影响。使用spss22.0软件分析数据，数据用表示，采用t检验，***代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05，p<0.05有统计学意义，ns表示没有显著性差异。实施例2绞股蓝皂苷xlix对肝细胞tg含量的影响按照甘油三酯(tg)试剂盒提供的说明书操作，先收集细胞，加入裂解液，震荡裂解，放置冰上10分钟，取出适量液体用于测蛋白浓度(bca法)，剩余液体部分70℃加热10分钟，然后室温2000转离心5分钟，取上层清液采用甘油-3-磷酸氧化酶法测tg含量：依试剂说明书加样、混匀，37℃反应10分钟，空白管调零，然后测定各管光密度(opticaldensity,od)值，绘制标准曲线并计算tg浓度，最后，以总蛋白浓度去校正tg含量，得到的检测结果如图1所示。由图1的结果可知，相比于空白对照组(dmso bsa)，加入pa处理后，模型对照组(dmso pa)组细胞内tg含量明显上升，说明肝细胞脂肪堆积模型成功建立。xlix pa组较dmso pa组tg含量明显下降，即绞股蓝皂苷xlix干预则会减轻pa所导致的升脂影响。与空白对照组(dmso bsa)相比，xlix bsa组tg含量无明显变化，说明单独加入绞股蓝皂苷xlix则对肝细胞内tg含量无明显影响。实施例3绞股蓝皂苷xlix对肝细胞脂肪堆积的影响使用油红o染色法研究绞股蓝皂苷xlix对肝细胞内脂肪堆积的影响油红o工作液配制：油红o溶于异丙醇配制成0.5％油红o贮备液，以6:4比例将贮备液与蒸馏水混匀后过滤2次，至液体澄清为止，得油红o工作液。将小鼠肝原代细胞接种12孔板，孵育24小时后，按照上述方法分皿及处理，即分为dmso bsa组、dmso pa组、xlix bsa组、xlix pa组，各组加入相应处理，所加培养基同前所述，继续孵育24小时后去除培养液，油红o工作液对各组细胞染色30分钟，蒸馏水洗两次，在倒置显微镜下观察染色效果，倒置显微镜对油红o染色的细胞进行形态学观察，结果如图2所示。由图2的结果所示，与空白对照dmso bsa组相比，模型组dmso pa组细胞出现大量红色脂滴，脂滴数量非常多，并发生相互撞合现象，说明原代肝细胞脂肪堆积模型成功建立，而加入绞股蓝皂苷xlix干预后，xlix pa组原代肝细胞红色脂滴数量减少，脂滴明显变小，颜色明显变浅，说明绞股蓝皂苷xlix明显改善了pa所导致的脂肪堆积现象。实施例4绞股蓝皂苷xlix对肝细胞脂肪酸代谢相关分子表达的影响为了探讨绞股蓝皂苷xlix降低肝原代细胞甘油三酯含量的具体机制，我们进行了聚合酶链反应(polymerasechainreaction,pcr)试验，通过标志性基因的表达量来观察甘油三酯合成、甘油三酯分泌及脂肪酸摄取三大途径的变化，从而揭示肝原代细胞中甘油三酯含量下降的确切途径及具体参与的基因。硬脂酰辅酶a去饱和酶(scd1)、脂肪酸合酶(fasn)为脂肪酸从头合成的关键基因，甘油-3-磷酸酰基转移酶1(gpat1)为甘油磷脂途径的关键基因；脂肪甘油三酯脂肪酶(atgl)为甘油三酯分解的关键基因；脂肪酸跨膜转运载体蛋白(cd36)、脂肪酸转运蛋白2(fatp2)为脂肪酸摄取的关键基因，cd36是参与脂肪酸代谢的各种组织表面重要的脂肪酸转运体(fat)，介导这些组织对脂肪酸的摄取。scd1、fasn为脂肪酸从头合成的关键基因，gpat1为甘油磷脂途径的关键基因，atgl为甘油三酯分解的关键基因，cd36和fatp2为脂肪酸摄取的关键基因。pcr实验的具体步骤如下一、rna的提取(1)吸掉旧的培养基，使用冷pbs洗屏平皿2～3次，加入trizol500μl,冰上静置5分钟后，用枪吹打数次以使细胞尽量破碎，“井”字形将细胞刮下，移液器将混合液吸至ep管。(2)分别加100μl氯仿,剧烈震荡30，室温静置15分钟，再次剧烈震荡30s，室温静置15分钟。(3)离心：12000转，15分钟，4℃。离心后分三层：上—白色透亮，含rna；中—白色，含蛋白和dna；下—同中层以及红色苯酚和氯仿。(4)沉淀：小心吸取上层白色透亮液体至新的ep管中，再加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置5～10分钟。(5)离心：12000转，10min，4℃离心结束后，管底可见白色沉淀。(6)洗涤：用黄枪头外带小白枪头，尽量吸去上层清液，沉淀不要被带出，加入与trizol量相等体积的75％乙醇,轻轻吹打洗涤.(7)离心：12000转，5min，4℃。(8)重复步骤7～8。(9)离心结束后，用黄枪头带小白枪头，尽量吸去上层清液，沉淀不要被带出。(10)干燥：通风厨内，不盖盖。室温下5～10分钟，不能彻底干燥，至沉淀物呈湿润的半透明白色即可。(11)稀释：逐步小量(15～30μl)depc水稀释沉淀，至完全溶解，要均一。置于冰上，若不用则-80℃保存，备用。二、rna逆转录为dna使用takara反转录试剂盒，按照其说明书，加入不同的试剂，配成相应体系后，然后通过pcr仪完成操作。三、荧光定量反应体系(20μl)的配制所加引物分别为scd1、fasn、gpat1、atgl、fatp2、cd36的上下游引物，如表1所示。表1pcr扩增所用的上下游引物相关基因上游引物下游引物scd15’-aagacatccgtcctgaaatg-3’5’-agggcactgataaggtagtaaaa-3’fasn5’-attccgggccaagttctac-3’5’-gcgcatgtacagctcgtg-3’gpat15’-cctctgaactggagaagtga-3’5’-agacagtatgtggcactctc-3’atgl5’-tgctacccgtctgctctttc-3’5’-gacctgatgaccaccctttc-3’fatp25’-ggacctctgtcttagcctcact-3’5’-cgcatccttcagtctttgttct-3’cd365’-ttcctgcagcccatggt-3’5’-gtcagcctctgttccaactgatag-3’测定基因表达量，基因的表达量通过2-△△ct表示，结果如图3～8所示。由图3～8的结果所示，相对于空白对照组(dmso bsa)，加入棕榈酸后，dmso pa组基因表达变化最为明显的为scd1，而通过绞股蓝皂苷xlix的干预，xlix pa组部分逆转了pa所致的scd1表达的升高。因此可以推测绞股蓝皂苷xlix是通过降低scd1基因的表达量从而发挥降低肝中甘油三酯含量的作用。scd1是催化细胞中饱和脂肪酸(sfa)转化为单不饱和脂肪酸(mu-fa)的限速酶，主要在肝组织表达，在肝酯合成过程中发挥重要作用。scd1催化生成的mufa具有多种重要的生理功能，它是膜磷脂、甘油三酯、胆固醇酯和蜡酯生物合成优先利用的底物。加入棕榈酸刺激后，scd1表达量升高，mufa底物增多进而促使甘油三酯合成增多，而绞股蓝皂苷xlix干预通过降低scd1的表达使得甘油三酯合成的底物减少，从而降低了肝细胞内甘油三酯的含量和改善了肝脏脂肪酸代谢。以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.绞股蓝皂苷xlix在制备用于改善肝脏脂肪代谢药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病；
优选的，所述肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病包括非酒精性脂肪肝病、肥胖症和代谢综合征中的至少一种；
更优选的，所述肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病为非酒精性脂肪性肝病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制肝细胞内甘油三酯含量的升高，和/或抑制肝细胞内脂肪堆积。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝细胞内甘油三酯含量的升高为棕榈酸诱导的肝细胞内甘油三酯含量的升高，和/或所述肝细胞内脂肪堆积为棕榈酸诱导的肝细胞内脂肪堆积。
5.根据权利要求1～4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为液体剂型。
6.绞股蓝皂苷xlix在调控肝脏甘油三酯含量中的应用，优选的，所述调控肝脏甘油三酯含量为降低肝细胞内甘油三酯含量。
7.绞股蓝皂苷xlix在调控肝脏脂肪堆积中的应用，优选的，所述调控肝脏脂肪堆积为减少肝细胞内脂肪堆积。
8.绞股蓝皂苷xlix在调控肝脏脂肪代谢相关分子表达中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肝脏脂肪代谢相关分子选自硬脂酰辅酶a去饱和酶、脂肪酸合酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶1、脂肪甘油三酯脂肪酶、脂肪酸跨膜转运载体蛋白和脂肪酸转运蛋白2中的至少一种；
优选的，所述肝脏脂肪代谢相关分子为硬脂酰辅酶a去饱和酶。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述调控硬脂酰辅酶a去饱和酶表达为调控硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达；
优选的，所述调控硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达为下调硬脂酰辅酶a去饱和酶转录水平表达；
优选的，所述转录水平为mrna转录水平。
技术总结本发明提供了绞股蓝皂苷XLIX在制备用于改善肝脏脂肪代谢药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肝脏脂肪代谢紊乱引起的相关疾病。本发明通过构建非酒精性脂肪肝病的细胞模型，证实了绞股蓝皂苷XLIX具有明显改善肝脏脂肪代谢的作用；并通过试验发现了绞股蓝皂苷XLIX可以降低肝细胞内甘油三酯含量，减少肝细胞内脂肪堆积，下调硬脂酰辅酶A去饱和酶转录水平表达，从而改善肝脏脂肪代谢紊乱，可见，绞股蓝皂苷XLIX对预防和治疗非酒精性脂肪肝病具有重要的作用。
技术研发人员：赵家军;高聆;陈文斌;石书龙
受保护的技术使用者：山东省立医院
技术研发日：2020.02.27
技术公布日：2020.06.09
