本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用。
背景技术：
：随着人类生活方式和习惯的改变，疾病谱正悄然发生变化，代谢性疾病增多，导致皮肤溃疡发生率不断上升，甚至出现慢性难愈性创面，典型代表如糖尿病足。糖尿病足是糖尿病的严重并发症，迁延不愈，发病率较高，修复难度较大，严重威胁人类健康。有关资料表明糖尿病足国外的发病率为15％，国内的发病率为8.1％，其致残率和致死率较高。目前研究表明，糖尿病足血管生成障碍和血供不足是导致伤口经久不愈甚至加重的主要原因。针对此类代谢性疾病病症，目前临床上常规使用的治疗方法是表皮生长因子凝胶和成纤维细胞生长因子凝胶，但其未能从根本上解决问题，疗效有限。人体内的内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，epcs)是一类具有游走特性、能定向增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，主要来源于骨髓，在成人外周血中少量存在。大量研究表明epcs一方面通过分泌血管生长因子，促进缺血组织的血管新生，另一方面通过动员、迁移、归巢和分化为血管内皮细胞参与损伤血管的再内皮化和血管新生。目前有动物实验研究显示，内皮祖细胞移植到病损区域可明显促进血管新生，以达到修复病灶的目的。可见epcs的开发和应用为慢性难愈性创面的修复带来了福音。研究表明epcs分泌的血管生长因子主要有血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血管生成素-1(ang-1)。进一步深入研究表明，vegf是促进血管生成特异性最高、功能最强的调控因子，其中vegfa可以调节内皮反应，如内皮细胞的增殖和迁移、血管通透性等，是vegf家族最主要的因子；vegfb具有诱导冠状动脉生长和心肌肥大的潜能，可以调节心脏中血管和心肌细胞生长、组织代谢，并提高心肌细胞活性；vegfc可以通过p38mapk-creb-dll4/notch1轴促进内皮细胞增殖和迁移，从而参与血管生成。而fgf可促进毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移、增殖和成管；ang-1能降低内皮细胞通透性，并调节vegf的效应，维持内皮细胞稳态，同时还可以促进胚胎发育以及创伤愈合过程中血管的生成。以上5个血管生长因子在血管新生过程中各司其职，调节血管新生的各个环节，为血管新生保驾护航；缺乏任何一个因子，机体血管新生功能将受阻或功能不全，不能正常发挥血管新生的作用。但是由于人体内的血管内皮祖细胞数有限，即使被从骨髓动员到外周血循环中，其转移、迁徙、进入受损组织的数量及其分泌的血管生长因子远远不能满足临床治疗的需求。内皮祖细胞分泌的外泌体(epc-exos)是一种纳米级细胞外膜泡，其分子结构小，生物相容性高，可作为细胞间通信和遗传物质的重要转移载体，携带各种生物活性分子(如蛋白质、mrna和mirnas等)，转移到靶细胞内，从而发挥血管新生的作用，其中mirnas分子在血管新生的调节中起关键作用。但人体内epcs的数量有限，发挥作用的epc-exos亦受到限制。因此，在epcs数量有限的前提下，要使epcs更好的发挥作用，修复受损组织，快速促进血管新生，关键是促进epcs分泌外泌体和血管生长因子。寻找具有该效果的组分对于治疗由于机体新生血管能力不足甚至丧失导致的缺血性疾病具有重要意义，是亟待解决的问题。黄芪甲苷(astragalosideiv，as-iv)，又名黄芪苷ⅳ，是一种从黄芪上提取出来的高纯度药物，有“超级黄芪多糖”之称,是我国传统中药豆科植物黄芪的主要活性成分。目前对于黄芪甲苷的研究主要集中在其增强机体免疫力、提高机体的抗病能力，其促进血管新生的研究国内外鲜有报道。技术实现要素：为了解决现有技术存在的如何促进内皮祖细胞分泌外泌体和血管生长因子的问题，本发明提供了黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用。本发明所采用的技术方案为：黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用；所述的促进血管新生是通过促进人内皮祖细胞分泌外泌体和血管生长因子实现的。本发明所述黄芪甲苷促进人内皮祖细胞分泌外泌体和血管生长因子的方法包括：s1、从细胞库中选取p3-p6代的人内皮祖细胞复苏，将复苏后的epcs培养于包被有人纤维连接蛋白的培养板，采用m199培养基预培养epcs24h；m199培养基含20％胎牛血清、血管内皮生长因子(vegf)10mg/l、青霉素100ku/l和链霉素100ku/l；s2、取贴壁细胞，用消化酶消化离心后重悬，待epcs再次贴壁后，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞后，采用含有人血清替代物的去胎牛血清(fbs)的egm-2mv培养基培养，在培养瓶中加入黄芪甲苷与epcs进行联合培养48h；s3、收集细胞培养上清液，先离心l0min去除残存细胞，再离心20min以去除细胞碎片；s4、收集离心后的细胞上清液，浓缩得到富含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的细胞悬液。进一步限定，所述步骤s2培养瓶中黄芪甲苷的浓度为100～400mg/l。本发明加入黄芪甲苷与epcs混合培养，并且当培养瓶中黄芪甲苷的浓度为100mg/l时，epcs分泌功能达到最佳，得到的epc-exos和血管生长因子的量达到最大。本发明所述消化酶为胰蛋白酶。本发明所述促进血管新生的药物为含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的水凝胶。水凝胶中起作用的成分是由中药活性成分黄芪甲苷干预人内皮祖细胞后收集到富含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子，人内皮祖细胞外泌体中负载有与血管新生相关的mir-126-3p、mir-126-5p、mir-21、mir-146a、mir-210、mir-155、mir-214；血管生长因子包括vegfa、vegfb、vegfc、fgf以及ang-1。人内皮祖细胞外泌体的粒径为88.7-123.5nm，浓度为100-1000mg/ml。本发明所述水凝胶还包括稳定剂、保湿剂、水凝胶基质、ph调节剂和等渗剂。优选的，水凝胶中vegfa的浓度为700-1400pg/ml，vegfb的浓度为700-1400pg/ml，vegfc的浓度为500-1200pg/ml，水凝胶中fgf的浓度为50-400pg/ml，水凝胶中ang-1的浓度为50-400pg/ml。优选的，水凝胶的ph值为6.2-7.8。优选的，步骤s2中黄芪甲苷的浓度为100～400mg/l。优选的，所述的稳定剂为透明质酸钠或羟乙基淀粉。优选的，所述的保湿剂为丙三醇。优选的，所述的水凝胶基质为卡波姆。优选的，所述的等渗剂为质量浓度为0.9％的氯化钠或pbs溶液。目前针对糖尿病足等此类代谢性疾病，主要的治疗方法是表皮生长因子凝胶和成纤维细胞生长因子凝胶，但其未能从根本上解决问题，疗效有限。研究发现epcs分泌的外泌体和血管生长因子能够促进血管新生，但是epcs数量有限，其分泌的外泌体和血管生长因子也有限，因此epcs不能很好的发挥作用，修复受损组织，将其用于治疗由于机体新生血管能力不足甚至丧失导致的疾病的效果有限，因此需要提高epcs分泌外泌体和血管生长因子。寻找具有该效果的组分对于治疗此类疾病具有重要意义，是亟待解决的问题。本发明通过研究发现黄芪甲苷在促进epcs分泌血管生长因子(vegfa、vegfb、vegfc、fgf、ang-1)和外泌体的新应用，且所分泌的外泌体中富含有促血管新生的mirnas分子，同时血管生长因子和epc-exos被内皮细胞摄取后可增强其成管功能。目前针对创面使用的敷料主要是传统敷料和新型合成敷料，传统敷料如纱布、棉垫等，其因来源广泛，质地柔软，成本低本广泛使用。但传统敷料止血效果不佳，并且没有保湿效果，敷料浸透时容易导致外源性感染，造成二次损伤；且传统敷料容易与创面发生粘连，去除时可能导致创面再次受损。新型的合成型敷料具有良好的弹性和透气性，但吸湿性不良，可能导致创面处形成积液而引起细菌的繁殖。应用于临床的组织工程产品存在一定的排斥免疫反应，治疗效果欠佳。本发明将促进血管新生的药物制成水凝胶，其具有良好的生物相容性，不影响生命体的代谢过程，并且代谢产物可以通过水凝胶排出，能够克服传统敷料和新型合成敷料存在的缺陷。本发明的有益效果：1、本发明发现黄芪甲苷在促进epcs分泌epc-exos和血管生长因子的新用途，epc-exos和血管生长因子具有明显的促进血管新生作用，与目前的常规治疗手段相比，具有原料易获得、给药方法简单、安全、成本低廉等优点，并且能从根本上解决血管新生障碍疾病问题，治疗效果显著。2、本发明发现黄芪甲苷能提升epcs的细胞活性，改善epcs的增殖、黏附、迁移和成管等生物学功能；有助于血管快速的再生和修复，可应用于各种血管需要修复的领域中，应用范围广。3、epcs分泌的外泌体中包含了蛋白质、mrna以及mirnas分子，尤其是mirnas，其对调节血管新生起关键性的作用；黄芪甲苷通过促进epc-exos分泌血管生成相关的mirnas发挥促进血管生成的作用，并且不会引起其他功能的缺失。4、本发明制成的含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的水凝胶外用于伤口/创面可以有效解决伤口/创面血管新生的问题，改善创面血运，加速创面愈合，尤其适用于慢性难愈性创面。附图说明图1是外泌体组培养至第7天时光镜下原代人epcs的形态学特征图；图2是原代人epcs细胞cd31免疫荧光染色鉴定结果图；图3是原代人epcs细胞双荧光染色鉴定结果图；图4是western检测正常情况下人epc-exos(对照组)和黄芪甲苷干预人epc-exos(实验组)中标记蛋白cd9、cd63和cd81的表达状况图；图5是两组人epc-exos标记蛋白cd9表达的对比研究图；图6是两组人epc-exos标记蛋白cd63表达的对比研究图；图7是两组人epc-exos标记蛋白cd81表达的对比研究图；图8是对照组epc-exos的电镜观察图；图9是实验组epc-exos的电镜观察图；图10是对照组epc-exos通过nta技术检测得到的粒径结果图；图11是实验组epc-exos通过nta技术检测得到的粒径结果图；图12是epc-exo表达的od值检测标准浓度曲线；图13是bca试剂盒检测两组epc-exos的浓度对比研究图；图14是两组epc-exos总rna琼脂糖凝胶电泳图；图15是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-126-3p表达对比研究图；图16是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-126-5p表达对比研究图；图17是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-21表达对比研究图；图18是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-210表达对比研究图；图19是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-214表达对比研究图；图20是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-155表达对比研究图；图21是rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关的mir-146a表达对比研究图；图22是对照组pbs液介导epcs所形成的细胞上清液干预huvecs体外成管的显微镜电镜图；图23是实验组黄芪甲苷介导epcs所形成的细胞上清液干预huvecs体外成管的显微镜电镜图；图24是两组epcs所形成的细胞上清液分别干预huvecs体外成管功能的对比研究图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，有的结构或器件未作具体描述的，理解为现有技术中有能实现的结构或器件。实施例1体外血管新生促进实验1.试验试剂和试验设备1.1材料试验试剂：黄芪甲苷(上海吉至公司)，胎牛血清(美国gibco公司)，m199培养基、pbs液(美国gibco公司)，胰蛋白酶(美国amresco公司)，细胞培养箱(美国thermoscientific公司)，anti-cd31抗体(ab28364)、山羊抗兔iggh&l(fitc)(ab6717)、人vegfaelisa试剂盒:(ab119566)、人anti-vegfbantibody(ab233503)、人vegfcelisa试剂盒:(ab100664)、人fgfbasicelisa试剂盒(fgf2)(ab99979)、人angiopoietin1elisa试剂盒(ang1)(ab99972)、(英国abcam公司)，dapi溶液(北京中科瑞泰公司)，bca蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝，pc0020)；磷钨酸负染液(索莱宝，g1872)；anti-cd9antibody[epr2949](abcam,ab92726,1:2000)；anti-cd63antibody[ts63](abcam,ab59479,1:1000)；anti-cd81antibody[m38](abcam,ab79559,1:1000)；trnzol总rna提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司)；primescripttmrtreagentkitwithgdnaerasertakara、premixextaqtmii(tlirnasehplus),roxplustakara、dl2,000dnamarkertakara(宝生物)；引物合成(invitrogen)；基因引物。试验设备：涡旋振荡仪ql-902(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；离心机centrifuge5415d(eppendorf)；分光光度计nanodrop2000(thernoscientific)；凝胶成像系统tanon1600(上海天能科技有限公司)荧光定量pcr仪abi7500(appliedbiosystems)；荧光显微镜(olympus-bx51)(北京同舟同德公司)，thermo热电mk3酶标仪(美国thermofisherscientific公司)；射电子显微镜(日本jeol公司，jem1230型)；zetaview(品牌：particlemetrix)2.实施方法2.1epcs的分离与培养取成足月新生儿脐带血10ml，用密度梯度离心法获取单个核细胞，将单个核细胞铺在包被有人纤维连接蛋白的培养板，用m199培养基(含20％胎牛血清，vegf10mg/l，青霉素100ku/l，链霉素100ku/l)在37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养4天，用pbs溶液洗掉非贴壁细胞，换培养液继续培养至7天，光镜观察细胞的形态，结果如图1所示，从图中可以看出光镜下可观对数生长期的细胞，细胞边缘清晰，呈铺路石样排列，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形。再次用pbs溶液洗掉非贴壁细胞，贴壁细胞供实施用。细胞融汇度达到80％时，按1:3进行传代。2.2epcs的鉴定参考cd31免疫磁珠分选法和fitc-uea-i和dil-ac-ldl双荧光染色法共同对人内皮祖细胞进行鉴定。cd31抗体联合dapi核染鉴定：p3代细胞用4％多聚甲醛固定15min；0.5％tritonx-100(pbs配制)室温通透20min；pbs浸洗后滴加山羊血清，室温封闭30min；滴加anti-cd31抗体并放入湿盒，4℃孵育过夜，在荧光显微镜下观察采集图像，如图2中的a图所示，图中明亮区域为染色区域。pbst浸洗后滴加山羊抗兔igg(h&l)抗体，20-37℃湿盒孵育1h；再用pbst浸洗后滴加dapi避光孵育5min进行染核，pbst洗去多余的dapi，加50％甘油，在荧光显微镜下观察采集图像，如图2中的c图所示，图中亮区域为双重染色区域；从上述细胞中提取dapi，在荧光显微镜下观察采集图像，如图2中的b图所示，图中亮区域为染色区域。fitc-uea-i和dil-ac-ldl双荧光染色鉴定：将p3代细胞接种于盖玻片上使细胞爬片，加入2.4g/l的dil-ac-ldl，于37℃避光孵育1h，使用20g/l多聚甲醛固定10min，在荧光显微镜下观察采集图像，如图3中的b图所示，图中亮区域为染色区域；pbst浸洗后加入10g/l的fitc-uea-i，于37℃避光孵育1h，pbst洗涤，在荧光显微镜下观察采集图像，如图3中的a图所示，图中亮区域为染色区域；细胞结合fitc-uea-i并摄取dil-ac-ldl后双重染色，在荧光显微镜下观察采集图像，如图3中的c图所示，图中亮区域为染色区域。从图2-3可知，鉴定细胞为epcs。2.3给药s1、从细胞库中选取p3-p6代的人内皮祖细胞(epcs)复苏，将复苏后的epcs培养于包被有人纤维连接蛋白的培养板，采用m199培养基预培养epcs24h；m199培养基含20％胎牛血清、血管内皮生长因子(vegf)10mg/l、青霉素100ku/l和链霉素100ku/l；s2、取贴壁细胞，采用消化液消化离心后重悬，待epcs重新贴壁后，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞后，用含有人血清替代物的去胎牛血清(fbs)的egm-2mv培养基培养，将培养获得的epcs随机分为黄芪甲苷组和对照组，黄芪甲苷组在培养瓶中加入黄芪甲苷与epcs进行联合培养48h，黄芪甲苷的浓度为100mg/l；对照组用等量的pbs液处理48h；control为对照组；as-iv为黄芪甲苷组；s3、收集细胞培养上清液，先离心l0min去除残存细胞，再离心20min以去除细胞碎片；s4、收集离心后的细胞上清液，浓缩得到两组含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的细胞悬液。3.结果3.1黄芪甲苷对内皮祖细胞分泌外泌体的影响3.1.1内皮祖细胞外泌体(epc-exos)的分离与鉴定采用超速离心法结合超滤法提取早期培养阶段(p3-p6代)epcs分泌的外泌体即epc-exos，提取的epc-exos转移到无菌ep管中，放入-80℃冰箱中保存备用，利用western技术进行epc-exos特征性标志物cd9、cd63和cd81的检测，结果如图4所示；由图4可知：western免疫印迹结果显示特征性内皮祖细胞外泌体标记蛋白(cd9、cd63和cd81)阳性，证实了已成功提取了外泌体。3.1.2两组epc-exos中标记蛋白组分的表达两组epcs中分离得到的epc-exos标记蛋白cd9、cd63和cd81表达进行对比，结果如表1所示，对两组epc-exos标记蛋白cd9、cd63和cd81表达的对比研究图分别为图5、图6以及图7。表1两组epc-exos标记蛋白cd9、cd63和cd81表达的对比研究组别cd9cd63cd81as-iv0.078±0.0190.422±0.0420.214±0.013control0.050±0.0020.097±0.0040.098±0.006t值2.60313.45613.684p0.1180.0000.000从表1和图5、图6以及图7可知，黄芪甲苷组epc-exos标记蛋白cd9、cd63和cd81的相对表达均高于对照组，两者具有差异，说明黄芪甲苷能够促进epcs分泌包含cd9、cd63和cd81特征物的外泌体。并且说明黄芪甲苷促进epcs分泌的囊泡就是epc-exos。3.1.3两组epc-exos的形态将直径2nm的载样铜网固定于支架上，滴加20μl的epc-exos悬液，室温静置3min；用滤纸从铜网侧边吸干液体，加入30μl3％磷钨酸溶液，室温下负染epc-exos5min；用滤纸吸干负染液，将铜网置于透射电镜的样品室内，观察epc-exos的形态并拍摄电镜照片，结果如图8和图9所示，由图8和图9可知，黄芪甲苷组和对照组的分离和提纯的epc-exos呈圆形膜囊泡，两组形态无显著性差异，说明两组外泌体均来自内皮祖细胞。3.1.4两组epc-exos的粒径取1μlepc-exos悬液，用pbs稀释1000倍，采用nta技术检测黄芪甲苷组和对照组中epc-exos的粒径，结果如图10和图11所示，由图10和图11可知：黄芪甲苷组中98.7％的人epc-exos的直径在84.7-143.1nm之间，体积略有增大；对照组中98％的人epc-exos的直径在88.7-123.5nm之间，为圆形囊泡，体积略有增大。通过两组粒径大小分析可知，黄芪甲苷干预后epc-exos中的内容物(mirnas和蛋白等)增多。3.1.5两组epc-exos的浓度严格按照bca蛋白定量试剂盒说明书检测黄芪甲苷组和对照组中epc-exos的浓度。取10μl蛋白标准液(bsa：5mg/ml)，以pbs稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。bsa溶液-20℃长期保存。按体积比50:1(bca试剂a:bca试剂b)配置bca工作液5.1ml。bca工作液室温24h稳定。将bsa溶液按0、2.5、5、10、20μl依次加入到96孔板的a1-a5孔中，pbs溶液补足到20μl；依次加入各组exosomes悬液2μl至b1-b3孔中，pbs溶液18μl补足至20μl；各孔依次加入200μl的bca工作液，37℃温箱中静置30min；酶标仪测562nm处的吸收值a562，根据标准曲线计算出蛋白浓度，标准曲线如图12所示。独立实施重复2次，取平均值；两组细胞中检测出的epc-exos的浓度如表2所示，bca试剂盒检测两组细胞epc-exos的浓度对比研究图如图13所示。表2bca试剂盒检测两组细胞epc-exos的浓度由图12、表2以及图13可知，黄芪甲苷组epc-exos的平均浓度为(0.363±0.023)mg/ml，对照组epc-exos的平均浓度为(0.184±0.015)mg/ml，p﹤0.01，有统计学意义，因此，黄芪甲苷组产生的epc-exos明显多于对照组，进一步说明黄芪甲苷能促进epc分泌外泌体。3.1.6两组epc-exos中与血管新生相关的mirnas分子分析设计目的基因引物(mir-126-3p、mir-126-5p、mir-21、mir-210、mir-214、mir-155、mir-146a)，如表3所示，将两组epc-exos总rna琼脂糖凝胶电泳，结果如图14所示；经rt-pcr检测as-iv组epc-exos中与血管生成相关的mir-126-3p、mir-126-5p、mir-21、mir-210、mir-214、mir-155以及mir-146a的表达较对照组明显增多，具有显著性差异，p﹤0.01，具有统计学意义，说明黄芪甲苷通过促进epc-exos分泌血管生成相关的mirna发挥促进血管生成的作用，如表4所示；mir-126-3p、mir-126-5p、mir-21、mir-210、mir-214、mir-155以及mir-146a的表达对比研究图分别如图15-21所示。从表4中数据和图15-21可知，黄芪甲苷组较对照组各目的基因表达明显增多，具有显著性差异，p﹤0.05，具有统计学意义，说明黄芪甲苷介导内皮祖细胞分泌的外泌体中负载有血管新生相关的mirnas分子。表3与血管新生相关的mirnas分子扩增反应所用引物序列表4rt-pcr检测两组epc-exos中与血管生成相关mirnas分子的表达3.2黄芪甲苷对内皮祖细胞分泌血管生长因子的影响按照elisa试剂盒说明操作，经elisa试剂盒检测血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血管生成素-1(ang-1)的吸光度，分别检测标准孔中的各血管生长因子的od值，以空白孔od值调零计算od值差值，再以血管生长因子浓度(pg/ml)为横坐标，以od值差值为纵坐标绘制标准曲线，最终将待测样品孔中的实际测得od值代入计算获得各个血管生长因子浓度；两组细胞分泌的血管生长因子浓度见表5，对比研究as-iv干预对epcs表达血管生长因子的影响，黄芪甲苷组vegfa、vegfb、vegfc、fgf和ang-1的浓度分别高于对照组相应血管生长因子浓度。由表5中的数据可知，5组数据组间比较差异有显著性统计学意义(p<0.01)，说明黄芪甲苷能促进内皮祖细胞分泌血管生长因子。表5elisa方法检测培养基中两组细胞血管生长因子浓度浓度(pg/ml)vegfavegfbvegfcfgfang-1control744.24±31.84738.53±14.93669.36±26.5550.75±7.02117.39±14.63as-iv1356.26±102.891366.29±18.861150.23±50.91127.06±19.87201.14±16.53t值9.8445.2414.516.276.57p值0.0010.0000.0000.0030.0033.3黄芪甲苷干预内皮祖细胞分泌的细胞上清液促进人血管内皮细胞(huvecs)成管实验分别对经黄芪甲苷和pbs干预24h后的内皮祖细胞提取细胞上清液，得到as-iv干预epcs后提取的细胞上清液和pbs干预epcs后提取的细胞上清液。matrigel基质胶4℃过夜溶解，枪头盒、ep管、96孔板均4℃过夜预冷；次日在冰盒上进行铺胶，先用m200无血清及生长因子补充物的培养基1:1稀释matrigel基质胶，混匀后，50μl/孔加入12孔板(12孔板提前预冷)，避免产生气泡，37℃孵箱放置30min；当huvecs细胞长到80-90％时，消化下来，并用含10％fbs的dmem培养基重悬，调整细胞密度至1×105/个，每孔加入1ml重悬液，待细胞贴壁加入含有controlepc-exos的f12-dmem完全培养基，其中对照组中一半的孔板加入pbs干预epcs后提取的细胞上清液进行干预，重复三孔，37℃孵箱孵育，24小时后在倒置显微镜下观察并拍照，结果如图22；黄芪甲苷组中一半的孔板加入as-iv干预epcs后提取的细胞上清液进行干预，重复三孔，37℃孵箱孵育，24小时后在倒置显微镜下观察并拍照，结果如图23所示；每孔随机选取4个视野计算小管形成长度，并取平均值，结果如图24所示，controlgroup代表pbs干预epcs后提取的细胞上清液干预huvecs体外成管，experimentalgroup代表as-iv干预epcs后提取的细胞上清液干预huvecs体外成管。从图22和23可知，黄芪甲苷组干预后提取的细胞上清液促进人血管内皮细胞(huvecs)体外成管能力高于对照组；从图24中可以看出，as-iv干预epcs后提取的细胞上清液成管数目增多，成管能力强，表明黄芪甲苷干预epcs后提取的细胞上清液能够促进人内皮细胞(huvecs)成管。综上所述，可证实黄芪甲苷具有促进epcs分泌外泌体和血管生长因子的效果，具有促进血管再生和修复的潜能。本发明将内皮祖细胞在含有黄芪甲苷的体外培养基中培养分离得到内皮祖细胞分泌的外泌体和血管生长因子，可将这些外泌体和血管生长因子制备成水凝胶，该水凝胶是无毒无害，可以安全使用的，可直接用于人体皮肤溃疡创面，促进血管新生，改善创面血运，加速创面/创伤修复。本发明所述黄芪甲苷促进人内皮祖细胞分泌外泌体和血管生长因子的方法包括：s1、从细胞库中选取p3-p6代的人内皮祖细胞复苏，将复苏后的epcs培养于包被有人纤维连接蛋白的培养板，采用m199培养基预培养epcs24h；m199培养基含20％胎牛血清、血管内皮生长因子(vegf)10mg/l、青霉素100ku/l和链霉素100ku/l；s2、取贴壁细胞，采用消化液消化离心后重悬，待epcs长满细胞培养瓶80％后，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞后，用含有人血清替代物的去胎牛血清(fbs)的egm-2mv培养基培养，在培养瓶中加入黄芪甲苷与epcs进行联合培养48h；黄芪甲苷的浓度为100mg/l；s3、收集细胞培养上清液，先离心l0min去除残存细胞，再离心20min以去除细胞碎片；s4、收集离心后的细胞上清液，浓缩得到富含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的细胞悬液。本发明所述促进血管新生的药物为含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的水凝胶。水凝胶中起作用的成分是由中药活性成分黄芪甲苷干预人内皮祖细胞后收集到富含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子，人内皮祖细胞外泌体中负载有与血管新生相关的mir-126-3p、mir-126-5p、mir-21、mir-146a、mir-210、mir-155、mir-214；血管生长因子包括vegfa、vegfb、vegfc、fgf以及ang-1。人内皮祖细胞外泌体的粒径为88.7-123.5nm，浓度为500mg/ml。本发明所述水凝胶还包括稳定剂、保湿剂、水凝胶基质、ph调节剂和等渗剂。优选的，水凝胶中vegfa的浓度为700-1400pg/ml，vegfb的浓度为700-1400pg/ml，vegfc的浓度为500-1200pg/ml，水凝胶中fgf的浓度为50-400pg/ml，水凝胶中ang-1的浓度为50-400pg/ml。针对本发明来说，用于促进血管新生的水凝胶除了人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子之外，还包括：稳定剂、保湿剂、水凝胶基质、ph调节剂和等渗剂，需要明确的是，上述的稳定剂、保湿剂、水凝胶基质、ph调节剂和等渗剂不起药用作用，为常规的水凝胶配备材料，相当于水凝胶的溶剂部分。本发明采用现有技术制备水凝胶，人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子为起药用作用的有效成分，相当于水凝胶的溶质部分。具体的，ph调节剂用于调节水凝胶的ph值，使水凝胶的ph值为6.2-7.8。稳定剂为透明质酸钠或羟乙基淀粉。保湿剂为丙三醇。水凝胶基质为卡波姆。等渗剂为0.9％氯化钠或pbs液。本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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技术特征：1.黄芪甲苷(as-iv)在制备促进血管新生药物中的应用。
2.如权利要求1所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述的促进血管新生是通过促进人内皮祖细胞(epcs)分泌外泌体(exos)和血管生长因子实现的。
3.如权利要求2所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述黄芪甲苷促进人epcs分泌外泌体和血管生长因子的方法包括：
s1、从细胞库中选取p3-p6代的人内皮祖细胞复苏，将复苏后的epcs培养于包被有人纤维连接蛋白的培养板，采用m199培养基预培养epcs24h；
s2、取贴壁细胞，用消化酶消化离心后重悬，待epcs再次贴壁后，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞后，采用含有人血清替代物的去胎牛血清(fbs)的egm-2mv培养基培养，加入黄芪甲苷与epcs进行联合培养48h；
s3、收集细胞培养上清液，先离心l0min去除残存细胞，再离心20min以去除细胞碎片；
s4、收集离心后的细胞上清液，浓缩得到富含人内皮祖细胞外泌体(epc-exos)和血管生长因子的细胞悬液。
4.如权利要求3所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述步骤s2中黄芪甲苷的浓度为100～400mg/l。
5.如权利要求3所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述步骤s2中黄芪甲苷的浓度为100mg/l。
6.如权利要求3所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，步骤s1中m199培养基含20％胎牛血清、血管内皮生长因子(vegf)10mg/l、青霉素100ku/l和链霉素100ku/l。
7.如权利要求1或2所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述促进血管新生药物为含人内皮祖细胞外泌体和血管生长因子的水凝胶。
8.根据权利要求7所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述水凝胶中人内皮祖细胞外泌体中负载有与血管新生相关的mir-126-3p、mir-126-5p、mir-21、mir-146a、mir-210、mir-155、mir-214，外泌体的粒径为88.7-123.5nm，浓度为100-1000mg/ml。
9.根据权利要求7所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述血管生长因子包括vegfa、vegfb、vegfc、fgf和ang-1。
10.根据权利要求7所述黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，其特征在于，所述水凝胶还包括稳定剂、保湿剂、水凝胶基质、ph调节剂和等渗剂。
技术总结本发明提供了黄芪甲苷(Astragaloside IV，AS‑IV)在制备促进血管新生药物中的应用，所述的促进血管新生是通过促进人内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)分泌外泌体(Exosomes)和血管生长因子实现的，所述促进血管新生的药物为含人内皮祖细胞外泌体(EPC‑Exos)和血管生长因子的水凝胶。本发明首次公开了黄芪甲苷在制备促进血管新生药物中的应用，提升EPCs的细胞活性，改善EPCs的增殖、黏附、迁移和成管等生物学功能；促进EPCs分泌外泌体和血管生长因子，有助于血管快速再生和修复，可应用于各种血管损伤修复的领域中，应用范围广。
技术研发人员：熊武;周忠志;彭阿建;朱芙蓉
受保护的技术使用者：湖南中医药大学第一附属医院((中医临床研究所))
技术研发日：2020.03.13
技术公布日：2020.06.09
