本发明属于中药新用途技术领域，具体涉及黄芪甲苷在抑制局部炎症反应和治疗动脉再狭窄方面的应用。
背景技术：
我国心血管病现患人数2.9亿，其中冠心病(coronaryheartdisease，chd)约1100万。pci技术的普及是chd治疗的一大历史突破，它的普及显著改善了chd患者的预后。然而，随之而来的并发症支架内再狭窄(in-stentrestenosis，isr)，却严重制约了这一技术的应用。isr如今公认的是指支架植入后6～9个月内冠脉造影发现其管腔净丢失率≥50％。裸金属支架植入后isr的临床发生率为20％-35％，尽管药物洗脱支架已广泛应用，但isr的发生率仍然高达10％。isr是pci术后失败的最常见原因，降低了支架植入的长期有效性。目前对于isr主要治疗方案多采用球囊成形术、支架内再狭窄的药物洗脱支架、近距离放射疗法、药物涂层球囊成形术、准分子激光血管成形术等治疗方法，但这些治疗手段并不非常有效。国内外做了大量的临床及实验研究，然而对再狭窄的发生机制仍未完全明了。目前普遍认为isr的主要发生机制是vsmcs的过度增殖与迁移、内皮细胞损伤、血管弹性回缩、持续存在的炎症反应和血管重构。因此寻找能够早期控制vsmcs的增殖、迁移并抑制支架局部炎症反应的发生的新型药物，对于预防或阻断isr的发生发展具有重要意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供黄芪甲苷在抑制局部炎症反应和治疗动脉再狭窄方面的应用，黄芪甲苷(as-iv)能够抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞(vsmcs)的增殖，发挥抗血管再狭窄的作用；as-iv可抑制心肌纤维化改善心功能，明确as-iv在体内对于vsmcs增殖及炎症的抑制作用，进而为pci术后再狭窄的预防和治疗提供一种新的并且安全、有效的解决方案。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了黄芪甲苷在制备预防和/或治疗动脉支架内再狭窄药物中的应用。
本发明还提供了黄芪甲苷在制备抑制局部炎症反应药物中的应用。
优选的，所述局部炎症反应由il-6、tgf-β1、tgf-β2、tnf-α和/或il-1β引起。
本发明还提供了黄芪甲苷在制备抑制ang-ii刺激的vsmcs的表型转换和增殖的药物中的应用。
本发明还提供了黄芪甲苷在制备逆转炎症因子tnf-a对vsmcs增殖的促进作用的药物中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗动脉支架内再狭窄的药物，所述药物以黄芪甲苷为有效成分。
本发明还提供了一种改善内皮细胞诱导的粘附和增殖效果的药物，所述药物以黄芪甲苷为有效成分。
本发明提供了黄芪甲苷在抑制局部炎症反应和治疗动脉再狭窄方面的应用，通过建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型来模拟经皮冠状动脉介入治疗(pci)术后血管内膜损伤，明确as-iv在体内对于vsmcs增殖及炎症的抑制作用，进而为pci术后再狭窄的预防和治疗提供一种新的并且安全、有效的解决方案。
在本发明实施例中，大鼠球囊损伤动物模型血清中的il-6、tgf-β1、tgf-β2、tnf-α、il-1β等炎症因子显著上调，说明炎症在isr发挥了重要作用，同时细胞因子芯片的结果显示as-iv能够抑制il-6、tgf-β1、tnf-α、il-1β等促炎细胞因子的释放，说明as-iv对炎症有良好的抑制作用。as-iv对vsmcs的增殖并无直接抑制作用，但是却能逆转炎症因子tnf-a对vsmcs增殖的促进作用。并且as-iv还可以抑制ang-ii刺激的vsmcs的表型转换和增殖。as-iv不仅对心衰动物模型具有良好的治疗效果，而且as-iv还可通过减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤，显著改善内皮细胞的诱导的粘附和增殖。因此as-iv很有可能通过抑制pci术后炎症细胞的活化和炎症因子的释放，进而控制vsmcs增殖和迁移，最终预防支架内再狭窄(isr)的发生。现有的对于冠心病的治疗多采用金属裸支架和药物涂层支架，但是金属裸支架术因炎症刺激及术中对于血管内膜的损伤术后再狭窄率居高不下，现今已较少应用；而药物涂层支架因同时具有抑制vsmcs和血管内皮细胞的作用，导致术后内皮细胞再生不良，术后有较高的血栓形成风险，严重降低患者的预后，且药物涂层支架耗材昂贵，一定程度上限制了它的应用。本发明的中药as-iv为纯中药制剂，同时具有抑制炎症，抑制vsmcs增殖、迁移，保护内皮细胞免受氧化低密度脂蛋白的损伤的作用，并且价格低廉，药理作用广泛，是一种理想的替代药物。
附图说明
图1为球囊损伤后颈总动脉he切片及ki67组化表达图，其中a为he切片图，b为he切片管腔面积统计图，c为ki67免疫组化结果，d为ki67免疫组化定量图；
图2为细胞因子芯片检测球囊损伤构建以及as-iv的治疗对sd大鼠外周血清中多种炎症因子表达的影响，其中a为假手术组，b为球囊损伤模型组，c为as-iv单独治疗组；
图3为球囊损伤后颈总动脉内膜cd3、cd68表达结果图，其中a为cd3颈总动脉he切片免疫组化，b为cd3免疫组化定量，与模型组相比:**p<0.05，c为cd68颈总动脉he切片免疫组化，d为cd68免疫组化定量，与模型组相比:**p<0.05；
图4为球囊损伤术后后各组pcna、icam-1、α-sma的表达结果图。
具体实施方式
本发明提供了黄芪甲苷在制备预防和/或治疗动脉支架内再狭窄药物中的应用。
本发明所述黄芪甲苷(as-iv)优选为从中药黄芪中提取分离的单体化合物，本发明对所述提取分离的方法并没有特殊限定，利用本领域的常见黄芪甲苷的提取分离方法即可。本发明对所述as-iv的来源并没有特殊限定，可自行提取也可购买市售产品，优选为市售产品。本发明所述药物以as-iv为有效成分，优选还包括了药学上可接受的辅料。本发明对所述辅料的种类及配比关系并没有特殊限定。本发明构建了大鼠囊损伤模型，结果表明as-iv很有可能通过抑制pci术后炎症细胞的活化和炎症因子的释放，进而控制vsmcs增殖和迁移，最终预防isr的发生。
本发明还提供了黄芪甲苷在制备抑制局部炎症反应药物中的应用。
在本发明中，pci术后对血管内膜造成的机械性损伤以及术后支架作为一种异体物质对血管壁的持续刺激不可避免的会导致血小板和炎症细胞聚集、释放炎症介质，而炎症因子是促进vsmcs的迁移和增殖最终导致支架内再狭窄的“重要介质”。本发明大鼠球囊损伤动物模型血清中的il-6、tgf-β1、tgf-β2、tnf-α、il-1β等炎症因子也显著地上调，说明炎症在isr发挥了重要作用，且细胞因子芯片的结果显示as-iv能够抑制il-6、tgf-β1、tnf-α、il-1β等促炎细胞因子的释放，说明as-iv对炎症有良好的抑制作用。
本发明中，as-iv对vsmcs的增殖并无直接抑制作用，但是却能逆转炎症因子tnf-a对vsmcs增殖的促进作用；而且as-iv还可以抑制ang-ii刺激的vsmcs的表型转换和增殖。所以本发明还提供了黄芪甲苷在制备抑制ang-ii刺激的vsmcs的表型转换和增殖的药物中的应用，以及黄芪甲苷在制备逆转炎症因子tnf-a对vsmcs增殖的促进作用的药物中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗动脉支架内再狭窄的药物，所述药物以黄芪甲苷为有效成分。
本发明还提供了一种改善内皮细胞诱导的粘附和增殖效果的药物，所述药物以黄芪甲苷为有效成分。
下面结合实施例对本发明提供的提供黄芪甲苷在抑制局部炎症反应和治疗动脉再狭窄方面的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
对本发明中出现的术语或缩写进行解释：pci(percutaneouscoronaryintervention；经皮冠状动脉介入治疗)；isr(in-stentrestenosis；支架内再狭窄)；as-iv(astragalosideiv；黄芪甲苷)；chd(coronaryheartdisease，冠心病)；vsmcs(vascularsmoothmusclecells，血管平滑肌细胞)；pcna(proliferatingcellnuclearantigen；增殖细胞核抗原)；α-sma(α平滑肌肌动蛋白；α-smoothmuscleactin)；icam-1(intercellularcelladhesionmolecule-1；细胞间黏附分子-1)；cd3(clusterofdifferentiation3；分化簇3)；cd68(clusterofdifferentiation68；分化簇68)；ki67(增殖指数)；tnf-α(tumornecrosisfactor-alpha,肿瘤坏死因子-α)；pbs(磷酸盐缓冲液)。
实施例1
1、主要仪器及耗材：
-80℃超低温冰箱、液氮、高压灭菌锅、eppendorf微量移液器、imagequantlas500成像仪、酶标仪、电泳仪、涡旋混合器、高速冷离心机、超净工作台、电子天平、球囊导管
2、主要试剂：
as-iv(北京阿普瑞斯科技公司)，cd3免疫组化试剂盒、cd68免疫组化试剂盒、ki67免疫组化试剂盒、水合氯醛、羧甲基纤维素钠(北京鼎国生物科技公司)，pcna、a-sma(美国abcam生物公司)，icam-1、β-actin、羊抗兔二抗、bsa(武汉爱博泰克生物公司)。
3、试验方法
(1)实验用动物饲养及分组
于山东省济南朋悦实验动物繁育中心购买spf级8周龄雄性sd大鼠20只，每只体重约为280～300g，所有动物实验均通过济宁医学院伦理委员会审批，许可证：scxk20140007。置于受控环境(23±2℃，45％±5％湿度，12小时黑暗/12小时光循环)，适应环境3天。大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量黄芪组(ld-as-iv)、高剂量黄芪组(hd-as-iv)共4组。
(2)建造大鼠颈总动脉球囊损伤模型
用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，无明显角膜反射证明麻醉成功。在颈前三角区右侧气管旁寻找右侧颈总动脉，充分暴露颈内、颈外、颈总动脉。在颈外动脉起始部以5～0号线永久结扎颈外动脉远心端，以止血夹临时加闭颈总动脉近心端及颈内动脉起始部。大鼠尾静脉注射肝素给予全身肝素化(100u/kg)，于颈外动脉距起始部剪出一v形切口，于切口处插入2ffogarty球囊导管约3～4cm，用ptca压力泵打入约4～5个大气压，回拉球囊，以出现摩擦感，而又能拉动球囊为合适压力，重复拉伤三次后拔除球囊导管，结扎切口处颈外动脉，解除颈总动脉、颈内动脉止血夹。观察颈总动脉可见明显搏动，表明血流通畅。术后腹腔注射3天青霉素抗感染。
(3)药物干预及取材
假手术组与模型组大鼠灌胃给予等量2％羧甲基纤维素钠，ld-as-iv给予60mg/kgas-iv灌胃，hd-as-iv给予120mg/kgas-iv灌胃，造模前3天开始给药，每天1次，连续给药4周。4周后大鼠禁食禁水12h，10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取损伤侧颈总动脉，预冷pbs缓冲液中洗去血液，颈总动脉分为2份，1份放入4％多聚甲醛溶液中固定12h，然后逐级经70％、80％、95％、100％乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡等步骤后，制成蜡块，切片后进行he染色。1份取出后液氮速冻后存于超低温冰箱用于后续的蛋白检测。大鼠心脏取血4ml，高速冷冻离心机3000g离心10min后取上清液，冻存于超低温冰箱。
(4)血管形态的观察及管腔面积的测定
光学显微镜下观察血管内膜增殖情况，并采用caseviewer图像分析软件测定管腔面积，免疫组化法测定ki67表达水平。结果如图1所示，与假手术组相比，模型组内膜明显增生，管腔较前明显减小。经as-iv治疗后，增生的血管内膜受到抑制，管腔较前通畅，见图1中a和b。免疫组化法测定血管内膜ki67表达，与假手术组相比模型组内膜ki67表达明显增高，经as-iv干预后，其表达降低，见图1中c和d。
(5)细胞因子芯片检测as-iv的治疗对sd大鼠外周血清中多种炎症因子表达的影响
按照康成kctmbca蛋白质定量试剂盒操作说明，测定样品浓度，抗体芯片在封闭缓冲液中封闭30分钟，然后与蛋白样品室温孵育1～2h，抗体芯片经洗涤缓冲液清洗，加入生物素标记的抗体，室温孵育1～2h，抗体芯片经洗涤缓冲液清洗，加入hrp偶联的链霉亲和素，室温孵育2h。抗体芯片经洗涤缓冲液彻底清洗后，加入化学发光试剂，用x光胶片曝光(注意避光)。通过扫描仪获得x光胶片曝光图片。蛋白信号强度通过灰度值定量获得原始信号值，经修正后与阳性蛋白进行标准化。通过标准化数值的组间比较得到差异表达的蛋白。结果如图2所示，与假手术组相比，球囊损伤组il-6、tgf-β1、tgf-β2、tnf-α、il-1β等炎症因子显著上调，提示球囊损伤可促进炎症因子释放，经as-iv干预后，大鼠外周血清相关炎症因子表达较球囊损伤组减低，提示炎性反应被抑制。
(6)免疫组化法测定cd3、cd68的表达
免疫组织化学染色检测ki67、cd3、cd68的表达将颈总动脉石蜡块切成5um切片，放入50℃水中，防脱载玻片捞片，放入70摄氏度烤箱中烤30min。二甲苯i、ii中各脱蜡10min，分别放入100％、95％、85％、75％乙醇逐级脱水各5min，pbs缓冲液洗3次。切片放入枸橼酸盐缓冲液加热5min，冷却后pbs缓冲液洗3次。室温下山羊血清封闭30min，pbs冲洗切片，加入稀释至1：200的一抗，4℃过夜。次日pbs缓冲液洗3次。加入稀释至1：400的二抗，室温孵育60min，用pbs缓冲液洗3次，每次5min。37℃条件下滴加sabc试剂，作用20min，用pbs缓冲液洗3次，每次5min。滴加dab显色剂，控制反应时间，最佳状态下终止反应。用苏木素复染，经过脱水，透明，封片后镜下观察。镜下观察ki67、cd3、cd68的表达。每张切片在400倍视野下，选取5个视野，应用image-proplussoftware5.0图像分析软件计数分析功能，计算新生内膜中阳性细胞个数占全部细胞的比例，选定阳性区域，将背景转换为白色，新的图片转换为8灰度图片，记录软件的读数，即为累积吸光度值。结果如图3所示，与假手术组相比，模型组cd3表达明显升高，提示炎性反应激活，as-iv可抑制cd3表达，见图3中a和b；与假手术组相比，模型组cd68表达升高，提示炎症反应明显，as-iv治疗后cd68表达降低，炎症反应被抑制，见图3中c和d。
(7)westernblot法检测颈总动脉血管中pcna、a-sma、icam-1的表达
称量60mg血管组织，ep管内剪碎，按照1：99的比例将ripa裂解液及pmsf蛋白酶抑制剂混匀，用超声破碎仪破碎10s，置于冰上裂解约25min；再于4℃离心机内14000r/min，吸出上清置于另一ep管内，并标记。用bca蛋白浓度测定试剂盒检测各组蛋白的浓度，根据标准曲线计算出上样量。配制10％sds-page电泳胶，将上述提取的蛋白加入1/4体积的5×sds上样缓冲液，煮沸7min，按30mg蛋白质总量上样，电转移(350ma，120min)将蛋白质转至pvdf膜上，用含5％脱脂牛奶的tbs/t室温封闭1h，分别与pcna、a-sma、icam-1的一抗4℃反应过夜，次日用tbs/0.5％tween20洗膜3次后，与hrp标记的山羊抗兔igg二抗37℃温育1h，tbs/0.5％tween20洗膜3次后，加入预混hrp化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测。结果如图4所示，与假手术组相比，模型组pcna表达增加，提示增殖明显，经as-iv治疗后，pcna表达降低，提示增殖被抑制，见图4中a和b；与假手术组相比，模型组icam-1表达升高，提示球囊损伤后，细胞迁移明显，as-iv干预后迁移可被抑制，见图4中a和c；与假手术组相比，模型组α-sma表达降低，提示球囊损伤后细胞转换至增殖表型，经as-iv治疗，α-sma表达升高，提示恢复收缩表型，见图4中a和d。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.黄芪甲苷在制备预防和/或治疗动脉支架内再狭窄药物中的应用。
2.黄芪甲苷在制备抑制局部炎症反应药物中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述局部炎症反应由il-6、tgf-β1、tgf-β2、tnf-α和/或il-1β引起。
4.黄芪甲苷在制备抑制ang-ii刺激的vsmcs的表型转换和增殖的药物中的应用。
5.黄芪甲苷在制备逆转炎症因子tnf-a对vsmcs增殖的促进作用的药物中的应用。
6.一种预防和/或治疗动脉支架内再狭窄的药物，其特征在于，所述药物以黄芪甲苷为有效成分。
7.一种改善内皮细胞诱导的粘附和增殖效果的药物，其特征在于，所述药物以黄芪甲苷为有效成分。
技术总结