本发明属于生物医药技术领域，具体涉及褪黑素联合弥可保在治疗糖尿病创面愈合障碍中的应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
糖尿病是一种严重危害人类健康及生活质量的慢性代谢性疾病。研究表明，2015年世界糖尿病患者人数为4.15亿，到2040年可能达到6.42亿。由糖尿病引起的并发症是糖尿病患者的残疾和死亡的主要原因，其中患者溃疡创面愈合延迟或不愈合是患者住院或截肢的首要因素，成为临床上亟待解决的难点和热点。研究表明，糖尿病创面愈合障碍涉及到上百种已知的病理因素，包括炎症反应、血管生成障碍、皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖迁移能力下降，骨愈合能力下降等。但是目前临床上仍缺乏公认的有效的治疗药物或治疗方案。虽然有研究试图通过应用实验室培养的皮肤替代品，干细胞疗法或超生理浓度的重组生长因子等来解决这个问题。但是这些已被证明难以维持，并且在某些情况下导致严重的不良副作用。因此筛选针对糖尿病创面愈合的药物，加快研发组织工程技术及产品，有利于大大改善糖尿病患者预后及生活质量，为临床治疗提供新思路，具有重要的临床意义和社会价值。
褪黑素(n-acetyl-5-methoxytryptamine,melatonin)是一种由松果体分泌的吲哚胺类激素，具有调节昼夜节律作用。在几乎所有组织中都能检测到，表明它在人体中具有普遍的重要性。研究表明褪黑素有调控衰老，抗炎，抗氧化以及抑制肿瘤细胞活性等一系列生物学功能。最近的研究结果表明，褪黑素能促进胃溃疡粘膜上皮愈合以及大鼠皮肤伤口的愈合。此外，有体外实验研究显示褪黑素能提高高糖刺激下角质细胞的增殖以及迁移活性，并且降低角质细胞的凋亡。
弥可保(mecobalamin，甲钴胺)是维生素b12的一种辅酶形式，它的结构与维生素b12相似，实质是一种具有生物活性的烷性钴胺素。目前对弥可保的研究主要集中在面神经麻痹、肿瘤、糖尿病性神经病、视觉退化、改善心率变异性，抑制hiv-1感染、男性不育、睡眠障碍等。而且弥可保已经被用在临床上以应对高同型半胱氨酸血症和糖尿病引起的周围神经病变。但是发明人发现，弥可保在糖尿病皮肤的治疗上未见任何报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供褪黑素联合弥可保在治疗糖尿病创面愈合障碍中的应用。本发明研究发现，褪黑素与弥可保的联合使用对糖尿病大鼠创面的愈合有显著的促进作用，且联合用药的效果优于褪黑素单独使用时的效果，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供褪黑素联合弥可保在制备治疗糖尿病创面愈合障碍产品中的应用。
根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗糖尿病创面愈合障碍的相关措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。
具体的，所述治疗糖尿病创面愈合障碍至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)促进糖尿病伤口愈合，提高糖尿病伤口愈合率；
2)降低糖尿病伤口部位炎症反应；
3)提高糖尿病伤口部位表皮干细胞数量。
本发明的第二个方面，提供一种治疗糖尿病创面愈合障碍的组合物，所述组合物是以褪黑素与弥可保为主要活性成分。
本发明的第三个方面，提供一种药物制剂，所述药物制剂由上述组合物和一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料组成。
本发明的有益技术效果：
本发明通过试验证明，褪黑素与弥可保的联合使用对糖尿病大鼠创面的愈合有显著的促进作用，且联合用药的效果优于褪黑素单独使用时的效果。联合用药时通过降低了伤口部位的炎症反应以及增加了表皮干细胞的数目进而显著促进了糖尿病皮肤伤口的愈合情况。结合当前糖尿病伤口治疗现状(愈合困难、治疗时费用高)，以及褪黑素，弥可保等小分子药物价格上，应用安全上的优势，研发褪黑素与弥可保混合的制剂具有重要临床实用价值，本发明的研究成果为临床应用提供了理论基础和新的治疗思路，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为褪黑素与弥可保联合用药促进糖尿病大鼠伤口愈合相关图。a.在大鼠背侧躯干的两侧进行全层真皮伤口示意图；b.第2、5、8、11和14天时对照组，褪黑素处理组，弥可保(vb12) 褪黑素处理组三组的伤口闭合的代表性图像。c.对应时间点下三组的伤口愈合率。数据结果表示为均数±标准差。与对照组相比*p＜0.05；与单独使用褪黑素组相比#p＜0.05。
图2为褪黑素与弥可保联合用药对伤口部位炎症反应以及表皮干细胞的影响相关图。a.在第11天，通过he染色检测不同治疗组中伤口的愈合情况。比例尺，100μm。b.给药第11天，通过realtimepcr检测糖尿病大鼠伤口组织促炎因子的表达水平。独立实验重复三次，数据结果表示为均数±标准差，**p＜0.01，*p＜0.05。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，由糖尿病引起的并发症是糖尿病患者的残疾和死亡的主要原因，其中患者溃疡创面愈合延迟或不愈合是患者住院或截肢的首要因素，成为临床上亟待解决的难点和热点。
有鉴于此，本发明通过研究意外发现，将褪黑素与弥可保联合使用，对糖尿病大鼠创面的愈合有显著的促进作用，且联合用药的效果优于褪黑素单独使用时的效果，从而完成本发明。
本发明的一个具体实施方式中，提供褪黑素联合弥可保在制备治疗糖尿病创面愈合障碍产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品为药物。
根据本发明，根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗糖尿病创面愈合障碍的相关措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。
具体的，所述治疗糖尿病创面愈合障碍至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)促进糖尿病伤口愈合，提高糖尿病伤口愈合率；
2)降低糖尿病伤口部位炎症反应；
3)提高糖尿病伤口部位表皮干细胞数量。
其中，所述用途2)中，降低糖尿病伤口部位炎症反应具体表现为降低炎症相关因子表达。所述炎症相关因子包括但不限于il-6和tnf-α。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗糖尿病创面愈合障碍的组合物，所述组合物是以褪黑素与弥可保为主要活性成分。
具体的，所述治疗糖尿病创面愈合障碍至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)促进糖尿病伤口愈合，提高糖尿病伤口愈合率；
2)降低糖尿病伤口部位炎症反应；
3)提高糖尿病伤口部位表皮干细胞数量。
其中，所述用途2)中，降低糖尿病伤口部位炎症反应具体表现为降低炎症相关因子表达。所述炎症相关因子包括但不限于il-6和tnf-α。
本发明的又一具体实施方式中，所述组合物中，褪黑素的剂量为8-12mg/kg，弥可保的剂量为2-4mg/kg，所述褪黑素与弥可保的质量比为4-6:1-2。
本发明的又一具体实施方式中，所述组合物中，褪黑素的剂量为10mg/kg，弥可保的剂量为3.6mg/kg，所述褪黑素与弥可保的质量比为25：9。
在本发明的意义上，所述组合物表示一种物质，其含有的褪黑素与弥可保对糖尿病创面愈合障碍具有明显的治疗作用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物制剂，所述药物制剂由上述组合物和一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料组成。
所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的组合物或药物制剂可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述组合物或药物制剂施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的又一具体实施方式中，提供褪黑素联合弥可保在制备如下任意一种或多种产品中的应用：
1)糖尿病伤口愈合促进剂；
2)炎症相关因子抑制剂；
3)表皮干细胞产生促进剂。
其中，所述炎症相关因子包括但不限于il-6和tnf-α。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1材料与方法
1.1实验动物
雄性8周龄左右sd大鼠24只(体重220±20g),购于山东大学实验动物中心,实验方案已获得山东大学医学院动物实验伦理委员会(no.kyll-2017(ks)-357)的授权，实验中严格遵守《动物保健和治疗指南》(第八版，2011年)。
1.2实验材料与试剂
褪黑素(m5250-1g；sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)；弥可保(上海爱必信生物科技有限公司)。
1.3sd大鼠糖尿病模型及糖尿病伤口模型的制备
造模前禁食不禁水12h,次日上午尾部采血测空腹血糖。随后腹腔(i.p.)注射链脲佐菌素(stz；75mg/kg；sigma-aldrich，st)连续注射三天诱导高血糖模型，stz溶于柠檬酸盐缓冲液(0.01mol/l，ph4.5)中。对照组小鼠注射等体积的柠檬酸盐缓冲液。注射stz后的24h内为防止大鼠因过度低血糖死亡，用2％蔗糖水喂养大鼠并自由进食。7天后检测空腹血糖(fbg)水平，大鼠空腹血糖浓度≥11.1mmol/l,视为糖尿病模型建立成功。持续高血糖状态4周后对糖尿病大鼠进行全层皮肤切除伤口建立模型。使用2％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，75％酒精对大鼠背部皮肤进行消毒,随后使用直径1cm的真皮打孔器在背部按压形成4个对称圆孔印迹,再使用灭菌眼科手术剪和手术镊沿印迹剪去圆孔内全层皮肤(包括皮下筋膜层)。使用无菌纱布压迫止血,造模完成后单笼喂养[33]。
1.4模型分组
造模成功后,将模型鼠随机分成3组：对照组(n＝8)、10mg/ml褪黑素组(n＝8)和褪黑素 弥可保组(n＝8)。大鼠麻醉状态下于伤口部位皮下注射相应药液100μl，每两天注射1次，注射两周。
1.5he染色
取下一定量的皮肤组织，4％多聚甲醛固定过夜后石蜡包埋。将组织切成3-4μm切片，进行he染色。
he染色：切片脱蜡后水化，蒸馏水冲洗后苏木精染色，1％盐酸酒精分化，水洗反蓝，蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水，伊红染色，然后经过两次100％酒精，最后在二甲苯中透明，中性树胶封片。
1.6实时定量pcr(realtimepcr)
先提取伤口组织的总rna(trizol法)，逆转录为cdna，加入基因特异性引物和sybrgreen配成pcr反应溶液进行pcr反应。检测炎症因子(il-6，tnf-α)mrna的表达。tnf-α基因上游引物为5’-tctcattcctgcttgtggc-3’(seqidno.1)；下游引物为5’-cacttggtggtttgctacg-3’(seqidno.2)；il-6基因上游引物为5’-tccatccagttgccttcttg-3’(seqidno.3)下游引物为5’-aagcctccgacttgtgaagtg-3'(seqidno.4)；
1.7实验统计
实验结果独立实验重复三次并用均数±标准差(mean±se)表示，应用独立样本t检验进行两组样本均数的比较，应用one-wayanova进行多组样本均数的比较，p<0.05时认为有统计学意义。
2实验结果
2.1褪黑素与弥可保联合用药更好地促进糖尿病大鼠伤口愈合
图1a显示的为糖尿病大鼠手术的代表性示意图。图1b的实验结果表明在第5、8、11和14天，褪黑素处理组以及褪黑素 vb12联合给药组较对照组而言，均能显著促进糖尿病伤口的愈合，而且与单独使用褪黑素组相比较，联合给药组的治疗效果更佳明显。图1c所示为糖尿病大鼠在不同给药时间点对应的伤口愈合率。给药第11天，各组伤口结痂开始或已经脱落，此时各组伤口愈合率：对照组(43.04±3.50)％，褪黑素处理组(52.5±5.05)％，褪黑素 弥可保联合给药组(61.5±4.15)％，联合给药组伤口愈合率相比于对照组和单一药物处理组差异均有统计学意义(p＜0.05)，综上所述，实验结果显示联合治疗的效果优于单独给褪黑素处理的效果，对糖尿病小鼠的伤口愈合有更好的促进作用。
2.2褪黑素与弥可保联合用药对伤口部位炎症反应以及表皮干细胞的影响
如图2a所示，在第11天取伤口部位皮肤组织固定进行he染色检测伤口炎症以及愈合情况。箭头所示为基底层的表皮干细胞，结果所示，糖尿病大鼠创缘处表皮干细胞数目减少，但是药物处理后，表皮干细胞数目均显著增加，而且较褪黑素单独处理组而言，弥可保与褪黑素联合给药处理后表皮干细胞数目增加程度更明显。实验结果表明，联合给药可能是通过增加了表皮干细胞的数目进而显著促进了糖尿病皮肤伤口的愈合情况。同时我们进一步通过realtimepcr在基因水平检测了炎症相关因子il-6和tnf-α的表达，如图2b所示，与对照组相比，给药处理组促炎因子il-6和tnf-α均降低(p＜0.05或p＜0.01)，且与褪黑素处理组相比，联合给药组炎症因子表达降低，表达差异具有统计学意义(p＜0.05)。实验结果表明，联合给药后会降低糖尿病伤口部位的炎症反应。
综上所述，褪黑素与弥可保的联合使用对糖尿病大鼠创面的愈合有显著的促进作用，且联合用药的效果优于褪黑素单独使用时的效果。联合用药时通过降低了伤口部位的炎症反应以及增加了表皮干细胞的数目进而显著促进了糖尿病皮肤伤口的愈合情况。结合当前糖尿病伤口治疗现状(愈合困难、治疗时费用高)，以及褪黑素，弥可保等小分子药物价格上，应用安全上的优势，研发褪黑素与弥可保混合的制剂具有重要临床实用价值，本专利的研究成果为临床应用提供了理论基础和新的治疗思路。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
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1.褪黑素联合弥可保在制备治疗糖尿病创面愈合障碍产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品为药物。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗糖尿病创面愈合障碍至少表现在具有如下任意一种或多种用途：
1)促进糖尿病伤口愈合，提高糖尿病伤口愈合率；
2)降低糖尿病伤口部位炎症反应；
3)提高糖尿病伤口部位表皮干细胞数量。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述用途2)中，降低糖尿病伤口部位炎症反应具体表现为降低炎症相关因子表达。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述炎症相关因子包括il-6和tnf-α。
6.一种治疗糖尿病创面愈合障碍的组合物，其特征在于，所述组合物是以褪黑素与弥可保为主要活性成分。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，褪黑素的剂量为8-12mg/kg，弥可保的剂量为2-4mg/kg，所述褪黑素与弥可保的质量比为4-6:1-2；优选的，褪黑素的剂量为10mg/kg，弥可保的剂量为3.6mg/kg，所述褪黑素与弥可保的质量比为25：9。
8.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂由权利要求6或7所述组合物和一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料组成。
9.褪黑素联合弥可保在制备如下任意一种或多种产品中的应用：
1)糖尿病伤口愈合促进剂；
2)炎症相关因子抑制剂；
3)表皮干细胞产生促进剂。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述炎症相关因子包括il-6和tnf-α。
技术总结