本发明属于医用高分子领域，特别涉及一种一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子及其制备和应用。
背景技术：
一氧化氮(no)是一种普遍存在细胞中自由基信号分子，广泛参与和调节各种生理病理过程，如血管扩张，神经信号转导，免疫应答，细胞凋亡和肿瘤发生与转移。正常生理状态下，机体可产生适当水平no用于维持系统机能，非正常状态下要想发挥no杀伤作用及降低耐药性作用则需要外源性补充no，no供体正是应临床需求而产生的。硝酸酯类是最常用的一氧化氮供体药物，相比s-亚硝基硫醇及偶氮烯鎓二醇盐类供体而言亚硝酸酯类具有较好的稳定性，且不受温度、光及ph影响。一般认为其发挥作用是通过与胞内巯基作用后形成s-亚硝基硫醇，同时释放出no。
顺铂(cisplatin,cddp),以二价铂同两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物。其分子式为：cl2h4n2pt，分子量为：300.05，cas.no.15663-27-1，分子结构如下：
其作用机制：顺铂在高氯环境下活性低，但进入低氯的细胞内液后活性增高，发生水合解离，形成活泼的带正电荷的水合配离子。该离子可与腺嘌呤、鸟嘌呤的7位上的n结合，引起dna链间、链内及蛋白质-dna分子间交联，从而导致dna复制和转录失败，抑制细胞有丝分裂，造成肿瘤细胞死亡。由于顺铂对正常组织具有严重的毒副作用，特别是急性肾毒性和慢性神经毒性；同时，许多肿瘤具有内在的耐药性和对顺铂产生获得性耐药性，导致疗效低下。因此，医学界一直致力于开发新的基于铂的抗肿瘤药物，能够降低顺铂不良反应，提高抗肿瘤效率。人卵巢癌细胞(a2780/dpp)、卵巢腺癌细胞(skov3/dpp)、人胃癌顺铂耐药株(sgc-7901/dpp)及人非小细胞肺癌(a549/dpp)均为常见耐顺铂的肿瘤细胞。
如何利用肿瘤细胞微环境，如肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽，即还原性环境实现两种药物释放同时又具备相互促进的药物载体甚少。因此，将对氯苯乙烯及顺铂改性为含有还原性环境可响应的前药单体，经过高效聚合，得到的聚前药纳米粒子可以解决上述问题。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子。
本发明另一目的在于提供上述一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其由以下方法制备得到：
(1)no单体的制备：在溶剂存在条件下，将式i所示化合物和硝酸银发生反应，得到no单体；
(2)顺铂前药单体的制备：将顺铂与双氧水在避光条件下反应制得氧化型顺铂中间体，然后在溶剂中将氧化型顺铂中间体和甲基丙烯酸酐进行反应，制得顺铂前药单体；
(3)一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子的制备：在有机溶剂、引发剂及链转移剂存在条件下，将no单体、顺铂前药单体和n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)进行聚合反应，即得一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子；
(4)将一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子溶于有机溶剂中，然后加入到正在搅拌的水中进行自组装，即得到一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子。
步骤(1)中所述的式i所示化合物的结构式为
步骤(1)中所述的溶剂为乙腈(acn)、甲醇(meoh)、n,n二甲基甲酰胺(dmf)、1,4二氧六环(1,4-dioxane)，二甲基亚砜(dmso)及乙酸乙酯(etoac)中的至少一种；
步骤(1)中所述的反应是指在室温避光条件下搅拌反应过夜，搅拌仅仅为了原料之间混合均匀，因此并不需要限定搅拌速度；
步骤(1)中所述的式i所示化合物和硝酸银的摩尔比为1：1～10；
步骤(1)中所述的反应结束后还包括一个纯化步骤，具体如下：反应结束后将所得反应液过滤除去盐，旋蒸除去溶剂，然后乙酸乙酯溶解，用水和饱和nacl水溶液依次洗涤，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩即得纯化后的no单体。
步骤(2)中所述的在避光条件下反应是指在避光条件下65～75℃反应10～12h；步骤(2)中所述的氧化型顺铂中间体和甲基丙烯酸酐进行反应是指在避光条件下55～65℃反应12～24h；
步骤(2)中所述的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、1,4二氧六环(1,4-dioxane)、二甲基亚砜(dmso)中的至少一种；
步骤(2)中所述的顺铂与双氧水的摩尔比为1:1～10；所述的氧化型顺铂中间体和甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:1～5；
步骤(3)中所述的链转移剂的结构为p-q，其中p为
优选的，所述的链转移剂为4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸；
步骤(3)中所述的有机溶剂为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种；步骤(3)中所述的引发剂为aibn、abvn、aibme中的至少一种；
步骤(3)中所述的引发剂、链转移剂、no单体、顺铂前药单体、n,n-二甲基丙烯酰胺的摩尔比为0.5-1：1：1～1000：1～1000：1～1000；
步骤(3)中所述的聚合反应是指在真空条件下50～120℃反应12～60h；
步骤(3)中反应结束后还包括一个纯化步骤，具体如下：将反应后的混合物在乙醚中沉淀，离心，再溶解在二氯甲烷中并用乙醚沉淀，乙醚的体积是二氯甲烷的10倍，反复三次，然后真空干燥或将反应后的混合物至于透析袋密封在去离子水中避光透析，待溶剂和小分子物质去除然后冻干即得一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子；
步骤(4)中所述的有机溶剂为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种；所述的有机溶剂和水的体积比为1:5～19；所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子溶于有机溶剂后的浓度为1～10mg/ml。
步骤(4)中所述的自组装是指在室温避光条件下搅拌0.5～1h，然后通过透析或者超滤法除去有机溶剂即得到一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，所述的透析是指用分子量为1.5kda以上的透析膜进行透析；所述的超滤法是指采用超滤管(15ml3kda)进行离心，收集内管中溶液。
上述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的机理为：
本发明利用对氯甲基苯乙烯和顺铂等原料制备释放一氧化氮及顺铂前药单体，利用“一步法”高转化率聚合后得到含两种前药重复单元的聚合物p(dma-co-pt-co-no)。在肿瘤细胞还原性环境中，硝基响应gsh，释放出no；四价铂响应gsh释放出顺铂，充分利用肿瘤微环境中高浓度gsh实现释药，并发挥no对药物的促进作用。聚前药纳米粒子提高了药物的水溶性，稳定性并具有可控释放特征。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明采用硝酸银为基本原料，对对氯苯乙烯对位氯原子进行改性，引入硝基；采用过氧化氢及甲基丙烯酸酐对顺铂进行改性，在顺铂轴上引入酯键及双键。采用“一步法”，利用可逆加成断裂链转移聚合方法(raft)制备了聚前药纳米粒子pnrs。pnrs作为聚前药纳米粒子的典型代表，具有较好的稳定性，具备肿瘤细胞还原性微环境下响应释放no及顺铂原药，并能够提高抗肿瘤效率等特点。
本发明进一步拓宽了药物传输载体设计的思路，密切联系肿瘤细胞还原性微环境，实现共同递送且具有协同效应，提高药物稳定性，水溶性和可控释放，具有独创性。
附图说明
图1为实施例4制备的聚前药纳米粒子pnrs粒径分布图及透射电镜照片；
图2为实施例4制备的聚前药纳米粒子pnrs粒径稳定性
图3为实施例4制备的聚前药纳米粒子pnrs在不同时间点一氧化氮的释放量图；
图4为实施例4制备的聚前药纳米粒子pnrs在不同时间点顺铂累计释放量图；
图5为实施例4制备的聚前药纳米粒子pnrs与顺铂对非小细胞肺癌a549细胞以及耐药型a549/dpp的毒性数据图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中所用原料说明如下：
乙醚，乙腈，二甲基亚砜(dmso)，n,n-二甲基乙酰胺(dmf)以及其他有机试剂均为分析纯，购自广州化学试剂公司，使用时未进一步纯化。4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(cta)购自sigma-aldrich公司。对氯甲基苯乙烯(p-cms)购自安耐吉公司，顺铂、n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)及甲基丙烯酸酐均购自迈瑞尔公司，硝酸银(agno3)及过氧化氢(h2o2)购自广州化学试剂公司，偶氮二异丁腈(aibn)购自acros并用95％乙醇重结晶纯化。1640培养基(gbico，上海立菲生物技术有限公司)。实验中所用的超纯水均由milli-qsp智能超纯水系统制备，电阻率为18.4mω·cm。
实施例1：还原性响应对硝甲基苯乙烯单体p-cms-no制备
在100ml圆底烧瓶中，称取硝酸银(0.934g，5.5mmol)，对氯甲基苯乙烯(0.6g，3.93mmol)和10ml乙腈，磁子搅拌条件下，室温避光过夜搅拌。过滤除去盐，旋转蒸发去除溶剂，然后乙酸乙酯溶解，用水和饱和nacl水溶液各洗三次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩。得黄色液体产物1(0.851g,产率:55.5％)。
具体反应方程式如下所示：
实施例2.还原性响应顺铂单体ppm制备
先将顺铂(0.2g,0.667mmol)溶解在去离子水(5ml)中,加入过氧化氢(7ml6.0mmol)70℃条件下搅拌5h，得羟基化顺铂，然后用冷水、乙醇、乙醚各洗涤3次，真空干燥(产率78.6％)。取上述羟基化顺铂(0.2g,0.6mmol)溶于2mln,n-二甲基乙酰胺，加入甲基丙烯酸酐(0.19g,1.23mmol)，70℃过夜搅拌，加入1ml丙酮得亮黄色固体，用丙酮和乙醚洗涤各3次，真空干燥得黄色固体粉末(0.22g，产率：63.5％)。
具体反应方程式如下所示：
实施例3.“一锅煮”法制备聚合物p(dma-co-pt-co-no)
dma(70mg,7.0×10-4mol),ppm(49mg,1.04×10-4mol)，p-cms-no(52mg,3.0×10-4mol),链转移剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(2.9mg,1.03×10-5mol),偶氮二异丁腈(1.7mg,1.03×10-5mol)，6ml1,4-二氧六环和二甲基亚砜(体积比＝2:1)加入到安瓿瓶中溶解。将混合物脱气冻融循环三次，然后在真空下密封，65℃下搅拌反应24h后用液氮中止聚合反应，打开反应瓶，将反应后混合物进行透析(1.5kda)，真空冻干，得到土黄色粉末。
具体反应方程式如下所示：
实施例4.一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子的制备
将3mg聚合物p(dma-co-pt-co-no)溶于1mldmso溶液中，加入到加速搅拌的9ml去离子水中(转速为1000rpm)，继续搅拌1h，将所得溶液至于1.5kda透析袋中透析6h，每隔0.5h更换一次去离子水。即可得到一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子(pnrs)水溶液，浓度为0.3mg/ml。
所得到的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子的粒径分布图及透射电镜照片如图1所示，从图1中可以看出，粒子约为130nm左右的实体球结构。
实施例5.聚前药纳米粒子稳定性研究
分别取一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子(pnrs)水溶液于1ml的磷酸缓冲液(pbs)及1ml的dmem培养基(gbico，上海立菲生物技术有限公司)中，使pnrs终浓度为0.3mg/ml，避光置于恒温37℃水浴锅中，每隔一天同一时间点用动态光散射粒度分析(dls)进行采集粒径数值。结果如图2所示。从图2可以看出pnrs在水溶液状态及细胞培养基中较稳定。
实施例6.一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子还原性响应药物释放特征
取两份900μl的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子(pnrs)水溶液(0.3mg/ml)，分别加入100μl浓度100mmol/lgsh水溶液(模拟肿瘤细胞还原性环境)和等体积的磷酸缓冲液(pbs)，利用griess试剂盒检测不同时间点no的释放量及利用icp-ms检测顺铂累计释放量，结果分别如图3和图4所示；从图3和图4中可以发现一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子在还原性环境中能够有效释放no及顺铂，并且两种药物均呈现时间依赖的释放特点，说明一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子pnrs可以实现可控药物传输目的。
实施例7.聚前药纳米粒子抗癌活性比较
通过mtt法评估一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子以及游离顺铂对人非小细胞肺癌敏感型a549(atcc:ccl-185tm)及耐药型a549/dpp(atcccl1309tm)的毒性。两种细胞系先在37℃细胞培养箱中培养48h，然后将细胞接种在96孔培养板中，初始密度为5000个细胞/孔。在培养基中(a549细胞用dmem培养基，a549/dpp细胞系用1640培养基)于37℃培养24h后更换新鲜的培养基，并分别加入10μl不同浓度梯度的游离顺铂水溶液(终浓度梯度分别为120μm,80μm,60μm,40μm,20μm,0μm)以及与游离顺铂等物质量且与游离顺铂水溶液等体积的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子的水溶液。然后在37℃培养箱中培养36h后更换新鲜培养基，每孔加入20μlmtt的pbs溶液(5mg/ml)，继续培养细胞4h后，去除培养基，每孔加入180μldmso。用酶标仪检测细胞毒性，检测波长为570nm。每个实验条件下做四个平行样品并计算标准偏差(±sd)。结果如图5所示，相对于等摩尔量的游离顺铂，一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子对两种细胞系均具有更强的细胞毒性，且耐药型a549/dpp表现出比敏感型a549毒性更强，证明no可以克服耐药性促进顺铂累积。实施例1制备的还原性响应对硝甲基苯乙烯单体p-cms-no水溶性差，被动运输进入细胞，不具有特异性，通过比较半抑制浓度(ic50)不同，反映出聚前药纳米粒子作为药物载体的巨大优势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于由以下步骤制备得到：
(1)no单体的制备：在溶剂存在条件下，将式i所示化合物和硝酸银发生反应，得到no单体；
(2)顺铂前药单体的制备：将顺铂与双氧水在避光条件下反应制得氧化型顺铂中间体，然后在溶剂中将氧化型顺铂中间体和甲基丙烯酸酐进行反应，制得顺铂前药单体；
(3)一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子的制备：在有机溶剂、引发剂及链转移剂存在条件下，将no单体、顺铂前药单体和n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)进行聚合反应，即得一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子；
(4)将一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子溶于有机溶剂中，然后加入到正在搅拌的水中进行自组装，即得到一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子；
步骤(1)中所述的式i所示化合物的结构式为
2.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(1)中所述的溶剂为乙腈、甲醇、n,n二甲基甲酰胺、1,4二氧六环，二甲基亚砜及乙酸乙酯中的至少一种；
步骤(1)中所述的反应是指在室温避光条件下搅拌反应过夜；
步骤(1)中所述的式i所示化合物和硝酸银的摩尔比为1：1～10。
3.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(2)中所述的在避光条件下反应是指在避光条件下65～75℃反应10～12h；步骤(2)中所述的氧化型顺铂中间体和甲基丙烯酸酐进行反应是指在避光条件下55～65℃反应12～24h；
步骤(2)中所述的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、1,4二氧六环、二甲基亚砜中的至少一种；
步骤(2)中所述的顺铂与双氧水的摩尔比为1:1～10；所述的氧化型顺铂中间体和甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:1～5。
4.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(3)中所述的链转移剂的结构为p-q，其中p为
5.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(3)中所述的有机溶剂为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种；
步骤(3)中所述的引发剂为aibn、abvn、aibme中的至少一种；
步骤(3)中所述的引发剂、链转移剂、no单体、顺铂前药单体、n,n-二甲基丙烯酰胺的摩尔比为0.5-1：1：1～1000：1～1000：1～1000；
步骤(3)中所述的聚合反应是指在真空条件下50～120℃反应12～60h。
6.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(4)中所述的有机溶剂为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种；所述的有机溶剂和水的体积比为1:5～19；所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药高分子溶于有机溶剂后的浓度为1～10mg/ml。
7.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(4)中所述的自组装是指在室温避光条件下搅拌0.5～1h，然后通过透析或者超滤法除去有机溶剂即得到一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子。
8.根据权利要求7所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
所述的透析是指用分子量为1.5kda以上的透析膜进行透析；所述的超滤法是指采用15ml3kda的超滤管进行离心，收集内管中溶液。
9.根据权利要求1所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子，其特征在于：
步骤(1)中所述的式i所示化合物为对氯甲基苯乙烯；
步骤(3)中所述的链转移剂为4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸。
10.根据权利要求1～9任一项所述的一氧化氮与顺铂共递送聚前药纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术总结