本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种治疗心肌缺血再灌注损伤的aldh2活化线粒体制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
冠心病与急性心肌梗死等缺血性心血管疾病是当今世界威胁人类健康的最主要杀手，临床上经皮冠状动脉介入治疗实现及时的血管再通能够有效改善患者心肌功能。但是，患者接受血运重建治疗后会发生心肌缺血再灌注损伤(ischemiaandreperfusion，ir)，这是接近10％的急性心肌梗死病人在出院后1年内发生死亡，约20％的存活患者发生慢性心力衰竭的主要原因。心肌细胞中存在大量的线粒体以维持心脏正常功能，心肌梗死导致的心肌细胞供氧不足通过引起氧化应激及线粒体中间代谢产物积累严重损伤心肌细胞线粒体的结构和功能，对此类患者实施血管再通能够有效的增加心肌细胞的供氧量减缓缺血引起的心肌细胞损伤，但是已受损的线粒体会导致心肌细胞活力和收缩功能恢复异常，并且该过程会引起线粒体的再度损伤。因而，此过程对血运重建患者进行线粒体移植有望改善病人的心肌细胞能量代谢，进而增加心肌细胞的再生和收缩能力。
期刊文献(杨世锋,孙超,王玉佩,等.线粒体移植在治疗线粒体缺陷疾病中的研究进展[j].生物化学与生物物理进展,2018,45(3):297-304.)公开了“james课题组利用离体兔心脏左前降支动脉结扎方式制造心肌缺血再灌注损伤模型，并对线粒体移植保护功能进行了评价。心肌缺血29min后，在缺血区域注入浓度为(7.7±1.5)×106/ml的正常线粒体进行干预。结果显示，再灌注120min后，线粒体移植处理组的左心室舒张压和收缩后收缩分别显著提高到正常状态下的75％和83％，趋于正常水平。ttc染色显示线粒体移植处心肌梗死面积较模型组明显减小，保护效果显著。随后，又有人在兔和猪体内心脏模型中进行验证，均发现线粒体移植在心脏缺血/再灌注损伤保护中有明显效果。”。
虽然线粒体移植具有极其广泛的应用前景，如何改善外源线粒体移植后对损伤心肌细胞的修复能力是线粒体移植策略的关键限制因素。
文献(张瑞，薛梦阳，王甲莉，等.aldh2通过调控线粒体网络减轻心肌缺血-再灌注损伤.中国科技论文在线)公开了：aldh2是位于线粒体基质内的酶，具有重要的心肌保护作用。心肌缺血-再灌注过程中线粒体分裂增加形成大量片段化线粒体，而抑制线粒体分裂则减少细胞死亡。为了研究aldh2是否通过调控线粒体融合分裂发挥心肌保护作用，我们选用大鼠心肌细胞h9c2作为细胞模型，在缺氧-复氧培养条件下，给予aldh2激活剂alda-1处理；在荧光显微镜下观察线粒体的形态变化；并观察细胞凋亡情况。本实验发现使用alda-1激活aldh2活性后，显著降低缺氧-复氧条件下的线粒体分裂，减少细胞凋亡。表明aldh2可能通过调控线粒体网络对细胞凋亡发挥调节作用。但该文献证明的是预先用alda-1激活h9c2心肌细胞aldh2活性，可以抑制h9c2心肌细胞缺氧-复氧条件下的线粒体分裂和减少心肌细胞的凋亡，即aldh2活性较高的线粒体能更好地应对缺氧-复氧，不容易发生线粒体损伤，且是基于体外细胞实验验证的。此外，还有文献(mccullyjd,cowandb,pacakca,etal.injectionofisolatedmitochondriaduringearlyreperfusionforcardioprotection.amjphysiolheartcircphysiol2009,296(1):h94～h105)表明在整个心肌缺血的再灌注过程中使用ros清除剂mpg或将其添加到线粒体中注射到局部缺血区域，未能发挥心脏保护作用。
因此，提高外源性线粒体的功能是否能增强线粒体移植的缺血再灌注损伤治疗效果是未知的。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种可以增强线粒体移植的缺血再灌注损伤治疗效果的制剂及其制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种线粒体制剂在制备防治心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述线粒体制剂是从使用alda-1活化aldh2后的心肌细胞中分离得到的。
作为本发明的一个优选例，所述线粒体制剂的制备方法为：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-21μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
更优选地，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
第二方面，本发明提供了一种治疗心肌缺血再灌注损伤的aldh2活化的线粒体制剂，所述线粒体制剂的制备方法为：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-21μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
作为本发明的一个优选例，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
第三方面，本发明提供了一种治疗心肌缺血再灌注损伤的aldh2活化的线粒体制剂的制备方法，包括以下步骤：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-21μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
更优选地，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
第二方面，本发明提供了一种治疗心肌缺血再灌注损伤的aldh2活化的线粒体制剂，所述线粒体制剂的制备方法为：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-21μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
作为本发明的一个优选例，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
本发明优点在于：
1、目前国内外线粒体移植研究还较少，关于如何处理移植线粒体以增强其缺血再灌注损伤的治疗效果更是很少涉及。本申请发明人基于丰富的研究经验，首次通过aldh2的小分子激活剂alda-1激活心肌细胞线粒体中的aldh2，并分离心肌细胞线粒体实施aldh2活化后的线粒体缺血再灌注损伤移植，发现aldh2活化的线粒体能够显著增加心肌细胞产能，降低心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡，改善心肌缺血再灌注损伤，表明心肌细胞分离后先给予alda-1处理再提取线粒体，储存于pbs中所得的制剂是可以增强治疗效果的。对于临床上急性心肌梗死病人血管再通时实施alhd2活化的线粒体移植能够保障心肌供能，改善心肌收缩舒张功能，降低再灌注损伤，抑制心衰发生。
2、本申请在线粒体制剂的制备过程中，选择了合适的细胞和培养条件，确定了alda-1的干预时机、浓度和时间，分离的线粒体保存于pbs中，最终对线粒体的活化作用显著，同时也很好的维持了其活力，取得了优异的治疗效果。
附图说明
附图1是本研究的技术路线图。酶消化法分离成年小鼠心肌细胞，aldh2小分子激活剂alda-1干预，分别分离正常和aldh2活化心肌细胞线粒体，构建小鼠缺血再灌注损伤模型，将不同处理的线粒体于心肌再灌注时进行多点移植，移植24小时后检测小鼠心功能及单个心肌细胞发生的功能变化。
图2～5：aldh2活性依赖的线粒体移植之治疗小鼠心肌缺血再灌注损伤效果评估。各图中，c：对照组，i：ir组，m：ir mito(ir 线粒体移植)，a：ir a(ir aldh2活化后的线粒体移植)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图2：aldh2活化的线粒体移植显著增加缺血再灌注损伤小鼠心脏左室射血分数，改善心功能。
图3：aldh2活化的线粒体移植通过显著增加心肌细胞中的存留量，降低心肌细胞凋亡水平(绿色荧光)。
图4：不同处理组缺血小鼠线粒体移植后再灌注24小时，外源荧光标记的线粒体(红色)及其荧光强度分析。
图5：不同组线粒体移植后心肌细胞凋亡指标cleaved-caspase3表达情况分析。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
技术路线：
1)分离成年小鼠心肌细胞，20μmalda-1进行干预12小时激活线粒体酶aldh2。
2)对原代心肌细胞线粒体实施mitotracker红色荧光标记后，分离正常和aldh2活化的心肌细胞线粒体备用。
3)气体麻醉c57bl/6小鼠，左前降支冠脉结扎实施心肌缺血45分钟，随后解开结扎线于左室心肌多点移植正常和aldh2活化的线粒体，同时再灌注24小时。
4)24小时后对缺血再灌注损伤小鼠心功能进行检测，分析线粒体在心肌细胞中的定位，分析不同线粒体移植前后缺血再灌注心肌的细胞凋亡水平，心肌梗死面积。
具体内容：
1材料
以下实施例中涉及的小鼠购自常州卡文实验动物中心，线粒体分离试剂盒和tunnel分析试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，alda-1,evansblue和ttc由美国sigma公司提供，动物实验已通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。
2方法
2.1线粒体准备
酶消化法分离获得成年小鼠(c57bl/6)心肌细胞(参见文献asimplified,langendorff-freemethodforconcomitantisolationofviablecardiacmyocytesandnonmyocytesfromtheadultmouseheart.circres.2016；119:909-920)，保证细胞存活率80％以上，转移至5μg/mllaminin包被的培养皿中进行培养，向培养体系加入终浓度20μm的alda-1于cm原代心肌细胞培养基(参见上述文献)37℃培养箱孵育12小时。随后使用mitotracker红色荧光探针工作液孵育正常及alda-1处理过的心肌细胞，37℃培养箱孵育30分钟，利用碧云天线粒体提取试剂盒分离获得正常和aldh2活化后的心肌细胞线粒体，溶于pbs中，0-4℃保存，计数备用。
2.2缺血再灌注损伤模型构建
提前对成年c57bl/6小鼠进行胸部脱毛处理，使用2％的异氟烷气体吸入麻醉小鼠，行左胸开胸手术，将胸大肌与胸小肌分离，止血钳打开胸膜和心包，挤出心脏使用6-0丝线对其前左降支进行活结结扎缺血45min，随后二次挤出心脏解开结扎线实施心肌再灌注。此时于心肌左室表面四个点，按照1ml胰岛素注射器的刻度，每推进一小格为25微升，每个点推进一小格，分四个点注射浓度为106/ml线粒体，每只小鼠共移植100微升正常或aldh2活化线粒体。ir组只注射相同体积的pbs，对照组实施假手术，开胸挤出心脏只穿线不结扎。再灌注24小时后行超声心动图检测小鼠心脏功能，组织病理学检测小鼠心肌结构变化，免疫荧光检测移植后线粒体的定位，evansblue/ttc染色检测小鼠心肌的梗死面积。
2.3evansblue/ttc染色
再灌注24小时后，不同处理组小鼠进行腹腔注射1％戊巴比妥钠0.2ml，小鼠麻醉后固定在小动物操作台上，开胸快速暴露心脏，使用6-0丝线重新结扎小鼠前降支，同时暴露左心耳。胰岛素注射器吸取1％伊文思蓝染液注射于左心耳，待心脏未结扎区充满染液。取下心脏，在无菌生理盐水中洗涤三次去除多余染液。去除非心肌组织，并保证左右心室完整。将心脏转移到-80℃冰箱中冷冻30min，随后取出冷冻变硬的心脏，冰上迅速将变硬的心脏横向均匀切成4-5片。心脏切片放置于1％ttc染液中，避光37℃水浴30min后，将心脏压平，固定在4％多聚甲醛中。于体视显微镜下拍照观察。白色为心肌梗死区(不能被evansblue和ttc染液染色)，红色为心肌缺血区(不能被evansblue但能被ttc染色)，蓝色为非缺血区(被evansblue和ttc染液染色)。梗死面积以危险区的百分比计算。
3结果
不同干预组小鼠的心功能评估以小鼠左室心肌射血分数(ef％)和左心窒的短轴缩短率(fs％)为标准。如图2所示，结果显示，与对照组c相比，ir组小鼠的心肌ef值和fs值显著降低，aldh2活化后的线粒体移植能够显著增加ir后的ef和fs值。
心肌梗死面积及凋亡水平也是评估线粒体移植对ir小鼠心功能影响的参考指标，我们研究中使用了evansblue/ttc染色评估不同干预组的心肌梗死面积(％危险区)，通过mitotracker红色荧光标记线粒体进行心肌组织冰冻切片染色，tunnel凋亡检测心肌细胞凋亡水平，研究结果显示，与ir组相比，aldh2活化的线粒体移植能够显著降低ir小鼠的心肌梗死面积，增加线粒体在心肌内的存留量，降低心肌细胞的凋亡水平(图3)。
为了进一步证实移植后的线粒体在小鼠心肌内的驻存情况，研究中通过免疫荧光标记线粒体，再灌注移植24小时后检测小鼠心肌的荧光强度，图4结果显示aldh2活化后的线粒体移植显著增加小鼠心肌的线粒体荧光强度(即线粒体驻留量)。
cleaved-caspase3表达水平代表心肌细胞凋亡情况，本实施例检测了cleaved-caspase3在不同干预组心肌的表达情况(图5)，结果表明，aldh2活化后的线粒体移植能够逆转小鼠ir心肌显著增加的凋亡水平。
我们的研究结果显示，aldh2活化后的线粒体移植能够显著抑制细胞凋亡，提高心肌ef值和fs值，相比于单纯的线粒体移植能明显改善心功能，减少小鼠的缺血再灌注损伤。
实施例2
上述研究的同时做了以下处理，补充内容如下：
干预组1：ir aldh2活化后的线粒体移植，与实施例1不同之处在于alda-1处理时间为8h；
干预组2：ir aldh2活化后的线粒体移植，与实施例1不同之处在于alda-1处理时间为10h；
干预组3：ir aldh2活化后的线粒体移植，与实施例1不同之处在于alda-1处理时间为14h；
干预组4：ir aldh2活化后的线粒体移植，与实施例1不同之处在于分离心肌细胞后直接提取线粒体，溶于含有20μmalda-1的pbs中，按照同样的方法注射。
各干预组小鼠ef％和fs％统计结果如表1所示，与对照组c相比，干预组2的小鼠ef和fs值显著增加，差异有统计学意义(p<0.05)，干预组1和干预组2的小鼠ef和fs值增加不明显，差异无统计学意义(p>0.05)。以上表明本发明的方法处理恰当，最大程度地提升了线粒体中aldh2活性并保留了线粒体的活力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
1.一种线粒体制剂在制备防治心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述线粒体制剂是从使用alda-1活化aldh2后的心肌细胞中分离得到的。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体制剂的制备方法为：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-21μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
4.一种治疗心肌缺血再灌注损伤的aldh2活化的线粒体制剂，其特征在于，所述线粒体制剂的制备方法为：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-22μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
5.根据权利要求4所述的线粒体制剂，其特征在于，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
6.一种治疗心肌缺血再灌注损伤的aldh2活化的线粒体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将分离的细胞存活率80％以上的心肌细胞使用原代心肌细胞培养基在层黏连蛋白提前包被的培养皿中培养，培养条件37℃；
b)待细胞正常贴壁后，向培养体系加入alda-1，终浓度为18-22μm，干预11-13小时；
c)干预结束后分离线粒体，溶于pbs中，即得所述线粒体制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述alda-1的终浓度为20μm，干预时间为12小时。
技术总结