本公开涉及生物医药领域，更具体地，它涉及使用人体肠道微生物组来提高肿瘤免疫治疗应答。
背景技术：
近年来，全球癌症患者激增，最新数据表明：2017年，全球新发癌症病例2450万，癌症死亡病例960万。结直肠癌(colorectalcancer,crc)，又称为大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、结肠直肠癌、或肠癌，为源自结肠或直肠(为大肠的一部分)的癌症。因为细胞不正常的生长，可能侵犯或转移至身体其他部分，结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。
人体微生物被称为“人类的第二基因组”。肠道是人体内最大的微生态环境，参与人体的营养吸收、能量代谢、组织器官发育、免疫防御及内分泌调控等多种重要的生理过程。近十几年来肠道微生态学取得了飞跃式的发展，人类对其认识不断加深，肠道微生态被认为是人体的“第二大脑”和“第二基因组”，与人类健康息息相关。
粪菌移植(fecalmicrobiotatransplantation,fmt)，其定义是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。2013年，菌群移植治疗复发性艰难梭菌感染被列入美国医学指南，并入选2013年美国时代杂志“世界十大医学突破”和美国克利夫兰医学中心“影响2014年的十大医学创新”榜单。
pd-1(programmeddeath1,程序性死亡受体1)是由t细胞表达的一类免疫检查点(immunecheckpoint)分子，为cd28超家族成员。pd-1是一类重要的免疫抑制分子，其作为“关闭的开关”发挥功能，抑制t细胞攻击体内的其它细胞。当t细胞表面的pd-1与体内正常细胞上表达的pd-1配体pd-l1(programmeddeathligand-1,程序性死亡配体1)时，t细胞的细胞杀伤效果受到抑制。肿瘤细胞利用这一机制逃避t细胞的免疫攻击，其表达大量pd-l1，以与t细胞表面的pd-1联合，抑制其细胞杀伤效果。针对pd-1或pd-l1免疫检查点的抑制剂，例如单克隆抗体药物能够阻断pd-1与pd-l1联合，抑制其下游信号传导，从而增强t细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用。根据目前的临床研究和临床前研究，pd-1抗体药物在多种癌症的治疗中表现出显著的效果，包括多种消化道癌症、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等。
然而，以pd-1/pd-l1抑制剂为代表的免疫信号通路调节剂在癌症治疗方面也存在诸多问题，其中以响应率低最为突出。研究表明，靶向pd-1/pd-l1的药物治疗的患者响应率通常不超过40％，而采用ctla-4单抗药物-ipilimumab治疗的患者其响应率仅约为15％，并且其中一部分患者仅为局部应答。此外，此类治疗还存在以下问题：起效慢，其中位起效时间为12周，可能会耽误患者的救治时间；部分患者治疗效果较差；在患者体内引起副作用，诸如结肠炎、腹泻、皮炎、肝炎、内分泌疾病等免疫相关不良反应(immune-relatedadverseevents,iraes)，可能导致治疗提前终止；以及价格昂贵，令普通患者难以承担。
技术实现要素：
本公开的目的在于提供一种健康人肠道菌群的菌液，及其与免疫信号通路调节剂联合，用于治疗肿瘤患者，以提高肿瘤对免疫治疗的应答。
具体来讲，本公开提供了一种健康人肠道菌群全菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；
对样本进行均质化；
对均质化的液体进行逐级过滤；
将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；
所述方法在厌氧条件下进行。
优选地，上述制备方法，其中，所述第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。
优选地，上述制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
使用无菌粪便采集盒收集新鲜粪便样本，取样后盖上盖子，送至实验室进行称量，并记录质量；
将采样盒放入在厌氧操作台的传递窗内，打开盒盖确保气体交换，盖上传递窗盖，启动去氧程序；5分钟后，将采样盒转移至操作台内部；
按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌，确保粪便不过分粘在采样盒上；
对样本粪便进行均质化；
对进行均质化的液体进行逐级过滤，优选地，所述逐级过滤为1mm-2mm、400-600μm、20-80μm；
将滤液转移至离心管内，离心2次，第一次离心条件为，50g-200g，离心5-7分钟，第二次离心条件为，4000g-5500g，离心5-7分钟，收集菌体沉淀。
用50ml无菌去氧生理盐水重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物。
优选地，上述制备方法，所述第一次、第二次离心温度优选为0-25℃，或0-15℃，或1-10℃，或2-8℃，最优选为4℃
优选地，上述制备方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
粪便来源的质量控制步骤；和/或，
人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤。
更优选地，所述粪便来源的质量控制步骤包括选择18-40岁健康人，通过健康筛查和临床检查，所述健康筛查和临床检查包括：血液检查无hiv、乙肝病毒、eb病毒等感染；身体无消化道疾病及其他会影响肠道菌群的疾病如代谢综合征等；粪便检查无轮状病毒，诺如病毒、沙门氏菌、志贺菌属、耐碳青霉烯类抗生素肠杆科细菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、产超广谱beta-内酰胺酶肠杆科细菌、白色念珠菌、隐孢子虫及环孢子虫感染；三餐规律，作息规律；所述人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤包括：无菌去氧生理盐水重悬所得菌液中，计数活菌率>5x1010个/ml视为合格。
本公开还提供上述任一种制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物。
本公开还提供包含上述任一种制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
特别地，本公开提供一种治疗癌症的试剂盒，其包上述的人肠道菌群全菌组合物或药物组合物，以及pd-1抗体。
本公开还提供上述的人肠道菌群全菌组合物在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途；优选地，所述癌症为消化道肿瘤；更优选地，所述癌症为结直肠癌。
优选地，上述用途，其特征在于所述药物或试剂盒中还包括一种或多种免疫信号通路调节剂；优选地，所述免疫信号通路调节剂包括抑制pd1/pdl1、pd1/pdl2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator，hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)、ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、tim3/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体，以及tigit/cd226中的一种或多种的试剂；更优选地，所述免疫信号通路调节剂为pd-1抑制剂，最优选为pd-1抗体。
优选地，上述用途，所述药物能够提高患者对pd-1抑制剂的治疗应答。
本公开的方法制备健康人肠道菌群的菌液具有操作方法简单，活菌率高，毒副作用低，病毒病菌感染风险低的特点。本公开人将来自健康人肠道菌群的全菌用于肿瘤治疗，可以提高肿瘤免疫治疗应答情况，同时可以与pd-1抑制剂联合使用具有协同效果，增强肿瘤抑制效果，延长肿瘤患者生存期。
附图说明
图1小鼠结肠癌ct26模型的给药方法
图2小鼠结肠癌ct26模型中，各给药组肿瘤生长情况
图3小鼠结肠癌ct26模型中，各给药组小鼠的kaplan-meier生存曲线
具体实施方式
根据本公开的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本公开上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
i.定义
肠道微生物群
“肠道微生物群”(以前称为肠道菌群或微生物群落)表示属于动物界的任何生物(人、动物、昆虫等)的肠中的微生物的群体。虽然每一个个体具有独特的微生物群组成(在总共400-500个不同的细菌种/个体中，60至80个细菌种由超过50％的采样人群所共有)，但它总是实现相似的主要生理功能并且对个体的健康具有直接影响：促成胃和小肠不能消化的某些食物(主要是不可消化的纤维)的消化；促成一些维生素(b和k)的产生；保护免受来自其它微生物的侵害，维持小肠粘膜的完整性；在适当的免疫系统的发育中起着重要作用；健康、多种多样和平衡的肠道微生物群是确保肠发挥恰当功能的关键。
考虑到肠道微生物群在身体的正常功能中所起的主要作用和其实现的不同功能，它现今被当作“器官”。然而，因为婴儿生来无菌，因此它是“获得性”器官；也就是说，肠道定殖在出生后立即启动，并在之后演化。
肠道微生物群的发展始于出生。子宫内部的无菌、新生儿的消化道被来自母亲(阴道、皮肤、乳房等)、其中发生递送的环境、空气等的微生物迅速定殖。从第3天开始，肠道微生物群的组成直接取决于婴儿如果被喂养：相较于用婴儿配方奶哺育的婴儿，以母乳喂养的婴儿的肠道微生物群例如主要由双歧杆菌属主导。
肠道微生物群组成的演化遍及整个生命，从出生至老年，并且是不同环境影响的结果。肠道微生物群的平衡可在老化过程中受到影响，因此，老年人具有与年轻成人显著不同的微生物群。
虽然主导肠道微生物群的一般组成在大多数健康人中是相似的(4个主要的门，即厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门)，但种水平上的组成是高度个性化的，并且主要由个体的遗传、环境和饮食决定。肠道微生物群的组成可变得习惯于饮食成分(暂时地或永久地)。例如，日本人可因他们的微生物群已从海洋细菌获得的特殊酶而能消化海藻类(他们日常饮食的一部分)。
生态失调
虽然它可适应变化并具有高弹性容量，但肠道微生物群组成失去平衡可在某些特定情况下出现。这被称为“生态失调”，肠道中潜在地“有害”细菌与已知的“有益”细菌之间的不平衡或对就主要菌群的组成和多样性而言被认为是“健康”微生物群的微生物群的任何偏差。生态失调可与健康问题诸如功能性肠病、炎性肠病、变态反应、肥胖和糖尿病相关。它也可以是治疗(诸如细胞毒性治疗或抗生素治疗)的结果。
在结直肠癌(crc)患者中，肠道微生物生态失调涉及来自拟杆菌属的细菌种的富集和属于faecalibacterium和罗斯氏菌属(roseburia)的种的减少(sobhani等人，2011；wu等人，2013)。具体而言，发现梭杆菌属(fusobacterium)和弯曲杆菌属(campylobacter)在crc患者的粪便和粘膜二者中一致增加。
在癌症的情况下，“有益的”或“有利的”细菌基本上是乳杆菌属和双歧杆菌属，而“有害的”或“不利的”细菌基本上是以下种：吉氏副拟杆菌和以下属：吉米菌属、alistipes。
如本文中所使用的，“微生物群”和“菌群(flora)”是指持续地和短暂地生活于受试对象身体中或受试对象身体上的微生物(包括真核生物、古细菌、细菌、和病毒(包括细菌病毒(即，噬菌体))的群落。
如本文中所使用的，“集落形成单位(colonyformingunits,cfu)”是指对给定样本中活微生物细胞数量的估计值。
如本文中所使用的，“活的(viable)”表示具备增殖的能力。
如本文中所使用的，“经分离的(isolated)”或“经纯化的(purified)”是指这样的细菌或者其他实体或物质，其已经(1)与其在初始产生(无论是天然地或在实验室环境中)时结合的组分中的至少一些组分分离，和/或(2)通过人类的手所生产、制备、纯化和/或制造。经分离的或经纯化的细菌可以与其初始结合的其他组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多分离。
免疫信号通路调节剂
免疫细胞信息传递途径可由细胞上的一或多个以下示例性的受体/配体对调节：pd1/pdl1、pd1/pdl2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator,hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)；ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、a型肝炎病毒细胞受体2(hepatitisaviruscellularreceptor2,havcr2；也称为t细胞免疫球蛋白与含有-3(tim3))/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体，以及tigit/cd226。免疫细胞信息途径也可由一或多种以下示例性的细胞激素/化学激活素及其同源细胞表面受体调节：白介素2(il-2)/cd122、腺苷/腺苷a2a受体(adenosinea2areceptor,a2ar)、白介素6(il-6)/il6r(cd126)、白介素10(il-10)/il-10r、白介素15(il-15)/il-15r、转化生长因子β(tgfβ)/tgfβr，以及巨噬细胞群落刺激因子1(csf-1)/csf-1r。其他免疫分子包括，但不限于，kir2dl、vista、hlla2、tlia、dnam-1、ceacam1、cd155，以及吲哚胺2，3-二氧酶(ido)，如ido1。上述任何免疫分子可作为如本公开所述的抗癌疗法的目标。
如本公开所用，“免疫信号通路调节剂”是指相对于对照载剂，改变免疫分子(例如，如本公开所述的任何一种)的活性的试剂。“调节剂”一词在本公开中以最广泛的含义使用，且包括部分或完全改变由一或多种免疫分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本公开所述的分子调节的信息传导途径。
于一些情况下，免疫信号通路调节剂为一种免疫检查点分子的抑制剂，其可以减少、减缓、停止，及/或阻止由该检查点分子调节的活性。“抑制剂”一词在本公开中以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制，或中和由一或多种免疫检查点分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本公开所述的分子调节的调节途径。合适的抑制分子具体包括天然多胜肽、胜肽、反义寡核苷酸、小的有机分子、重组蛋白或胜肽等的拮抗剂抗体或抗体片段、片段或胺基酸序列变体。
在其他情况下，免疫信号通路调节剂为免疫分子的活化剂，其增强及改善由该免疫分子调节的活性。“活化剂”一词在本公开中以最广泛的含义使用，且包括增强由一或多种免疫分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本公开所述的分子调节的信息传导途径。合适的活化剂包括激动性抗体或抗体片段、小的有机分子、重组蛋白质或胜肽等。于一些情况下，活化剂可为免疫分子的激动性抗体，例如medi0562(人源化ox40激动性抗体)、medi6469(小鼠ox4激动剂)；以及medi6383(ox40激动剂)。
识别这种调节剂的方法为本领域公知的。例如，可以使候选调节剂与合适的免疫分子目标接触，且可通过常规测定法测量由该免疫分子调节的信息传导的强度。在候选调节剂存在下，相对于空白对照的信息传导的可检测的变化表明，候选调节剂具有免疫分子的调节活性。
药物或药物组合物
本公开所述的健康人肠道菌群的菌液，与一种或多种辅料如佐剂、载体或稀释剂一起，可以置入药物组合物、单位剂量(unitdosages)或剂型(dosageforms)的形式中。所述药物组合物可以固体剂型(如粉剂、颗粒剂、丸粒剂、包衣或未包衣的片剂或经填充的胶囊)或液体的剂型(如溶液、混悬液、乳液或填充其的胶囊)或半固体剂型(如凝胶、霜剂和软膏)采用。药物剂型的一种或多种活性成分的溶解和释放特性可以在数秒至数月的范围内变化。
所述“药物”或“药物组合物”被设计用于在动物和人中的用途并可以经所有给药途径施用。优选的给药途径是口服途径、肺途径、鼻途径、直肠途径、肠胃外途径。此种药物组合物及其单位剂型可以常规或特别的比例包含常规的或新的成分，具有或不具有另外的活性化合物或成分，并且此种单位剂型可包含与目的日剂量范围相称的待采用的任何适宜有效量的活性成分。
应用于本公开的药物组合物的术语“载体”涉及与活性化合物一起施用的稀释剂、辅料或赋形剂。
本公开的药物或药物组合物可以经口地、局部地、肠胃外地或粘膜地(例如，含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。通常希望使用口服途径。所述活性试剂可以经口地以胶囊、片剂等形式(参见remington：thescienceandpracticeofpharmacy，20thedition)施用。
对于以片剂或胶囊形式的口服给药，活性药物组分可以与非-毒性的、药学可接受的辅料如粘结剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和其它还原性和非-还原性糖类、微晶纤维素、硫酸钙或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或硅土、硬脂酸、硬脂基富马酸酯钠、甘油二十二烷酸酯、硬脂酸钙等)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)、着色剂和调味剂、明胶、甜味剂、天然和合成的胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻朊酸盐)、缓冲盐、羧甲纤维素、聚乙二醇、蜡、等。对于以液体形式的口服给药，所述药物组分可以与非-毒性、药学可接受的惰性载体(例如，乙醇、甘油、水)、防沉降剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非-水性载体(例如，扁桃油、油酯类、乙醇或经分馏的植物油)、保藏剂(例如，p-羟基苯甲酸甲酯或p-羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等组合。还可以加入稳定剂如抗氧化剂(bha、bht、桔酸丙酯、抗坏血酸钠、柠檬酸)以稳定所述剂型。
包含作为活性化合物的片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。包含作为活性化合物的式i化合物的本公开的所述组合物还可以引入小珠、微球或微胶囊，例如由聚乙醇酸/乳酸(pgla)构建的。用于口服给药的液体的制剂可以采取例如溶液，糖浆剂，乳液或混悬液的形式或者它们可以呈现为在使用前用水或其它适宜的辅料重构的干产品。用于口服给药的制剂可以适宜地配制以使活性化合物受控或延迟地释放。
本公开的药物或药物组合物可以经肠胃外递送，即，通过静脉内(i.v.)、脑室内(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用，通过直接注射，经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现，例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂(excipient)的形状，在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构。
本公开的药物或药物组合物还可以配制用于直肠给药，例如呈栓剂或保留灌肠(例如，包含常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯)。
联合治疗方法
本公开提供了使用如本公开所述的免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液的联合癌症疗法。本公开所用的“联合疗法”一词包括以顺序方式施用这些药剂(例如，免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液)，即其中每种治疗剂在不同时间施用，以及施用这些治疗剂，或至少二种药剂，基本上同时进行。每种试剂的顺序，或基本上同时给药，可受任何适当途径的影响，包括，但不限于，口服途径、静脉内途径、肌肉内、皮下途径，以及通过黏膜组织的直接吸收。药剂可以通过相同的途径或不同的途径来施用。例如，可以口服给予第一药剂(例如，健康人肠道菌群的菌液)，而以静脉内施用第二药剂(例如，抗pd1抗体等抗检查点抗体)。此外，选择的组合剂可通过静脉内注射施用，而组合的其它药剂可以口服给药。或者，例如，可以通过静脉内或皮下注射施用二种或更多种药剂。
联合疗法还可包括如本公开所述的药剂(例如，免疫信号通路调节剂与发酵的组合物)进一步与其它生物活性成分(例如，不同的抗肿瘤剂)以及非药物治疗(例如，手术或放射治疗)组合的施用。在联合疗法进一步包含放射治疗的情况下，放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要从治疗剂的组合与放射治疗的共同作用获得有益的效果即可。例如，在适当的情况下，当放射治疗暂时从治疗剂的给药中除去时，可能达到几天甚至数周，仍可达到该有益效果。
应当理解的是，免疫信号通路调节剂与如本公开所述的菌液的任何组合可以治疗癌症的任何顺序使用。可基于许多因素来选择本公开所述的组合，该因素包括，但不限于，抑制或预防癌症进展的有效性、减轻组合的另一种药物的副作用的有效性，或缓解癌症相关症状的有效性。例如，如本公开所述的联合疗法可减少与组合的每个单独成员相关联的任何副作用。下列表格中提供了一些示例。例如，该健康人肠道菌群的菌液可以在涉及免疫信号通路调节剂(例如，抗pd1抗体)的治疗过程中每天使用。
在一些实施方案中，本公开所述的免疫信号通路调节剂与如本公开所述的菌液的组合是以试剂盒的形式提供。所述试剂盒包含免疫信号通路调节剂，以及本公开所述的菌液。在一些情况下，本公开的试剂盒还可以包含其他必要的试剂。应当理解的是，本公开的试剂盒中的各种组分可以治疗癌症的任何顺序使用。
如本公开所述的免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液的任何组合可用于治疗癌症。本公开所用的“癌症”一词是指由肿瘤或恶性细胞群、增殖或转移调节的医学病症，包括固体癌症及非固体癌症。癌症的实例包括，但不限于，肺癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、黑素瘤、头颈癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、皮肤癌、胃癌、食管癌、骨髓瘤、直肠癌、骨癌、子宫癌、前列腺癌，以及血液恶性肿瘤。
“个体”、“个人”以及“患者”等词在本公开中可互换使用，而且是指被评估用于治疗及/或被治疗的哺乳动物。个体可为人类，但亦包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗等。
如本公开所用，“有效量”是指对个体赋予治疗效果所需的每种活性剂(例如，免疫信号通路调节剂，例如，抗pd1抗体或健康人肠道菌群的菌液)的量，不论是单独或组合地与一或多种其它活性剂施用。于一些具体实施例中，治疗效果为抑制癌细胞生长及/或减少肿瘤负担。于一些具体实施例中，健康人肠道菌群的菌液的量对增强免疫信号通路调节剂的抗癌作用是有效的。在其它具体实施例中，健康人肠道菌群的菌液的量对增强个体对癌细胞的免疫力是有效的。于一些具体实施例中，治疗效果为预防或抑制肿瘤生长。于一些具体实施例中，治疗效果为与一种或多种药物/药物相关的副作用的降低。例如，可能由抑制pd-1途径(例如，疲劳、末梢水肿、发冷、发热、腹泻、恶心、腹痛、咳嗽、呼吸困难、皮疹、瘙痒、白斑病、关节痛、肌痛、背痛、头痛、头晕，及/或增加的天门冬胺酸胺基转移酶(ast))的副作用可通过与另一种药剂(例如，免疫信号通路调节剂与如本公开所述的健康人肠道菌群的菌液)的共同治疗而减轻。
如本公开所用，“治疗”一词是指将包括一或多种活性剂的组合物应用或施用于一个体，该个体患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状，或对该疾病/病症的倾向，且其目的为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进，或影响疾病、疾病症状，或对该疾病或病症的倾向。
缓解目标疾病/病症包括推迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。缓解疾病并不一定需要治疗结果。如其中所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意指推迟、阻止、缓慢、妨碍、稳定，及/或推迟疾病进展。这样的延迟可为不同的时间长度，这取决于疾病的历史及/或被治疗的个体。一种“延迟”或减轻疾病发展，或推迟疾病发病的方法，为减少在给定时间框架内发展一或多种疾病症状的可能性，及/或在给定的时间框架内减少症状程度的方法，与未使用该方法者进行比较。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的多个个体。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现及/或随后的进展。可使用本领域熟知的标准临床技术检测并评估疾病的发展。然而，发展亦指可能无法检测的进展。为了本发明的目的，发展或进展是指该症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发及发病。如本公开所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作及/或复发。
于一些具体实施例中，如本公开所述的免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液的组合，以足以将一或多种目标信息传导途径的活性体内抑制至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量，施用于需要治疗的个体。在其它具体实施例中，该组合以将一或多种目标抗原的活性程度降低至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的有效量施用。
于一些具体实施例中，将如本公开所述的健康人肠道菌群的菌液给予已经接受或正在接受涉及使用免疫信号通路调节剂(例如，抑制剂)的抗癌疗法的个体(例如，人类癌症患者)，如本公开所述者。
医学领域的普通技术人员已知的常规方法，可用于根据待治疗的疾病的类型或疾病的部位，而向个体施用医药组合物。该组合物亦可通过其它常规途径施用，例如，口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部性、直肠、鼻腔、口腔、阴道，或经由植入的储库给药。本公开所用的“肠胃外”一词包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、脑内，以及颅内注射或输注技术。此外，其可通过可注射的贮库途径施用于个体，例如使用1、3或6个月储存罐注射或可生物降解的材料及方法。于一些实例中，该医药组合物在眼内或玻璃体内施用。
无论通过口服、直肠或肠胃外(包括静脉内的和皮下)或在某些情况下甚至局部途径，可以将本公开的式i活性成分或与一种或多种药物-可接受的辅料、载体或稀释剂，特别是和优选地以它们的药物组合物的形式，以有效量施用给需要其的对象，例如活动物(包括人)体，用于治疗、减轻或改善、缓解或消除对其敏感的适应症或病症或者阐述于本申请其它处的适应症或病症。
ii.具体实施方式
下面参照实施例进一步阐释本公开。对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本申请说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。
本公开的一个目的在于提供了一种健康人肠道菌群全菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；
对样本进行均质化；
对均质化的液体进行逐级过滤；
滤液离心2次，重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；
所述方法在厌氧条件下进行。
在一个优选的实施方案中，所述第一次离心条件为0-25℃，50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为0-25℃，4000g-5500g，离心1-15分钟；
所述第一次、第二次离心温度优选为0-15℃，或1-10℃，或2-9℃，或3-8℃，或4-7℃，或5-6℃，最优选为4℃；
所述第一次离心转速优选为100-200g，或150-200g，最优选为200g；
所述第二次离心转速优选为4500-5000g，最优选为4500g；
所述第一次、第二次离心时间优选为3-10分钟，更优选5-7分钟，最优选为7分钟。
在一个优选的实施方案中，所述逐级过滤的粒径选择为1mm-2mm、400-600μm和20-80μm。
在一个优选的实施方案中，所述制备方法还包括以下步骤：
使用无菌粪便采集盒收集新鲜粪便样本，取样后盖上盖子，送至实验室进行称量，并记录质量；
将采样盒放入在厌氧操作台的传递窗内，打开盒盖确保气体交换，盖上传递窗盖，启动去氧程序；5分钟后，将采样盒转移至操作台内部；
按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌，确保粪便不过分粘在采样盒上；
对样本粪便进行均质化；
对进行均质化的液体进行逐级过滤，优选地，所述逐级过滤为1mm-2mm、400-600μm、20-80μm；
将滤液转移至离心管内，离心2次，第一次离心条件为1-10℃，50g-200g，离心5-7分钟，第二次离心条件为1-10℃，4000g-5500g，离心5-7分钟，收集菌体沉淀；
用50ml无菌去氧生理盐水重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物。
在一个优选地实施方案中，所述方法还包括以下步骤：
粪便来源的质量控制步骤；和/或
人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤。
在一个优选地实施方案中，所述粪便来源的质量控制步骤包括：选择18-40岁健康人，通过健康筛查和临床检查。
在一个更加优选地实施方案中，所述健康筛查和临床检查包括：血液检查无hiv、乙肝病毒、eb病毒等感染；身体无消化道疾病及其他会影响肠道菌群的疾病如代谢综合征等；粪便检查无轮状病毒，诺如病毒、沙门氏菌、志贺菌属、耐碳青霉烯类抗生素肠杆科细菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、产超广谱beta-内酰胺酶肠杆科细菌、白色念珠菌、隐孢子虫及环孢子虫感染；三餐规律，作息规律。
在一个优选地实施方案中，所述人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤包括：无菌去氧生理盐水重悬所得菌液中，计数活菌率>5x1010个/ml视为合格。
本公开的一个目的还在于提供上述任一种制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物。
本公开的一个目的还在于提供包含上述任一种制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本公开的一个目的还在于提供一种治疗癌症的试剂盒，其包上述的人肠道菌群全菌组合物或药物组合物，以及pd-1抗体。
本公开的一个目的还在于提供上述的人肠道菌群全菌组合物在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途。
在一个优选地实施方案中，所述癌症为消化道肿瘤。
在一个更加优选地实施方案中，所述癌症为结直肠癌。
在一个优选地实施方案中，上述制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途，其特征在于所述药物或试剂盒中还包括一种或多种免疫信号通路调节剂。
在一个更加优选地实施方案中，所述免疫信号通路调节剂包括本领域已知的任选地免疫信号通路调节剂，包括但不限于pd1/pdl1、pd1/pdl2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator，hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)、ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、tim3/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体，以及tigit/cd226中的一种或多种的试剂；优选地，所述免疫信号通路调节剂为pd-1抑制剂，最优选为pd-1抗体。
优选地，上述制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途，所述药物能够提高患者对pd-1抑制剂的治疗应答。
优选地，上述制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途，所述药物能够提高pd-1抑制剂的响应。
实施例1：健康人肠道粪便菌群全菌组合物的制备
选择32岁健康人，通过健康筛查和临床检查：血液检查hiv，乙肝，eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)等感染；身体无消化道疾病及其他会影响肠道菌群的疾病如代谢综合征等；粪便检查无轮状病毒，诺如病毒、沙门氏菌、志贺菌属、耐碳青霉烯类抗生素肠杆科细菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、产超广谱beta-内酰胺酶肠杆科细菌、白色念珠菌、隐孢子虫及环孢子虫感染；三餐规律，作息规律。
使用特定的无菌粪便采集盒收集新鲜粪便样本，取样后盖上盖子，送至实验室进行称量，并记录质量；将采样盒放入在厌氧操作台的传递窗内，打开盒盖确保气体交换。盖上传递窗盖，启动去氧程序；5分钟后，将采样盒转移至操作台内部，开始实验流程。
根据称量的样本质量，倒入5倍体积的无菌去氧生理盐水。例如粪便质量为100g，则倒入500ml；对样本进行搅拌，确保粪便不过分粘在采样盒上；将样本整体倒入到密封袋中，对样本粪便进行均质化；然后进行逐级过滤，所述逐级过滤的粒径选择为1mm-2mm、400-600μm和20-80μm；之后使用电动移液器和移液管将最后一次的滤液转移至50ml离心管内，每管装入50ml；进行两步离心，第一步：4℃，200g离心7分钟；第二步：4℃，4500g离心7分钟，弃上清，收集菌体沉淀；菌体用50ml无菌去氧生理盐水重悬，此时悬液为包含全菌的微生物溶液，即fmt菌液，可用于后续治疗。
取1ul菌液样本进行质检，将其稀释在1ml的无菌生理盐水中，并向其中加入thermofisherlive/deadtmbaclighttmbacterialviabilitykit试剂盒中的syto9染色剂和pi染色剂各1μl。震荡混匀后在黑暗中静置15分钟。15分钟后取2μl该溶液，将其稀释在1ml的无菌生理盐水中，震荡混匀。使用流式细胞仪检测该染色稀释液，将fitc通道增益调整为150，将pc5.5通道增益调整为200，将主阈值设为fsc，手动，400，将第二阈值设为ssc，手动，4500，其余所有参数设为默认，固定采集体积。设置流式细胞仪采集图，以fitc-a的log值为横坐标，以pc5.5-a的log值为纵坐标，定量采集数据。采集完成的散点图中，圈出图中右下部分聚集的散点，即为活菌。统计其数量，根据实验过程的稀释倍数，计算原始菌液中的活菌率。
该质检标准为，活菌率>5x1010个/ml，如达到这个标准则视为合格。
经流式细胞仪检测，本次菌液制备产品活菌率为1.21x1011/ml。检验合格。
实施例2：健康人肠道菌群全菌联合pd-1免疫抑制剂，用于治疗消化道肿瘤
受试药ratigg2a
供货商：中美冠科生物技术有限公司
货号：cvp039
批号：0119l220
包装：2.8mg/ml,96mg
储存温度：
受试药apd-1抗体(rmp1-14)
供货商：中美冠科生物技术有限公司
货号：cvp033
批号：0119l225
包装：4.1mg/ml,96mg
储存温度：
抗生素
day-8到day-4：配方包括氨苄青霉素(ampicillin)1mg/ml，新霉素(neomycin)1mg/ml，甲硝哒唑(metronidazole)1mg/ml和万古霉素(vancomycin)0.5mg/ml。将抗生素按比例添加到无菌水中供小鼠饮用，抗生素处理时间为4天，含抗生素的水瓶每三天更换一次。
day-3到day7：配方包括氨苄青霉素(ampicillin)1mg/ml，新霉素(neomycin)10mg/ml，甲硝哒唑(metronidazole)10mg/ml，万古霉素(vancomycin)5mg/ml和两性霉素b(amphotericinb)0.1mg/ml。将氨苄青霉素添加到无菌水中供小鼠饮用，其他抗生素混合后给小鼠灌胃，每天两次，每次200μl。
在接收微生物治疗前24h(day7)，中断抗生素处理，并将小鼠转入到新的笼子中，以防止老鼠食用含有抗生素的粪便。
day8在第一次微生物治疗前再一次将小鼠转移到新的笼子中，以防止老鼠食用还残留有抗生素的粪便。
细胞培养
ct26细胞(sibs：上海生命科学研究院，cat#：tcm37)培养在含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液中。收集指数生长期的ct26细胞，pbs重悬至适合浓度用于小鼠皮下肿瘤接种。
动物造模和随机分组
小鼠结肠癌ct26模型的给药方法如图所示。具体而言，购买spf级6-8周龄雌性balb/c小鼠。适应性饲养一周。实验期间将饲养在不同笼子里的属于同一组别的小鼠进行随机交换。
将小鼠分为4组：对照组(无菌生理盐水 同型对照)，fmt单独治疗组(fmt 同型对照)，pd-1单独治疗组(无菌生理盐水 pd-1)和fmt联合治疗组(fmt pd-1)，每组10只小鼠。
适应性饲养结束后，采用灌胃的方式对小鼠进行抗生素处理，处理时间为16天(从day-8到day7)，每天灌胃1次。
在抗生素处理过程中，选择在day0将培养好的ct26细胞注射到小鼠体内，进行造模。256只雌性小鼠右侧皮下接种5×105ct26细胞。接种当天定义为第0天(day0)。
接种8天后根据肿瘤体积进行随机分组，各组肿瘤平均体积为87mm3。
day7灌胃结束后中断抗生素处理，将小鼠转移到新的笼子中，以防小鼠食用含抗生素的粪便。
day9在第一次微生物治疗前再一次将小鼠转移到新的笼子中。
实施例1制备的fmt菌液，用无菌生理盐水重悬至2.5x1010个/ml。
在day8，day11，day14及day17分别给予fmt单独治疗组和fmt联合治疗组小鼠以灌胃的形式进行治疗，每只小鼠每天灌胃1次，灌胃体积为200μl，即剂量为5x109个/只/次；对照组和pd-1单独治疗组灌入等体积生理盐水。
在day9，day12，day15及day18分别进行抗体注射，用量为200ug/只/次。其中pd-1单独治疗组和联合治疗组注射pd-1抗体，而对照组和单独治疗组注射同型对照。
day24处死小鼠，收集肿瘤，进行称重并测量肿瘤面积后将肿瘤组织磨碎，同时收集脾脏，用于流式细胞分析。
在实验过程中，定期监控肿瘤细胞接种后小鼠肿瘤的生长状况：用游标卡尺直接测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式：
肿瘤体积(mm3)＝1/2×(a×b2)(其中a表示长径，b表示短径)。
监测时间点为：第5，8，11，14，17，21及24天；接种肿瘤后小鼠体重的监测。
相对肿瘤增殖率，t/c％，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式如下：
t/c％＝trtv/crtv×100％(trtv：治疗组平均rtv；crtv：溶媒对照组平均rtv；rtv＝vt/v0，v0为分组时该动物的瘤体积，vt为治疗后该动物的瘤体积)；或，
t/c％＝ttw/ctw×100％(ttw：治疗组实验终结时平均瘤重；ctw：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。
相对肿瘤抑制率，tgi(％)，计算公式如下：
tgi％＝(1-t/c)×100％(t和c分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(rtv)或瘤重(tw))。
结论
ct26模型所有组小鼠在给药后第13天(细胞接种后第21天即day21)，由各组小鼠生长情况(表1)可知：
无菌生理盐水 同型对照对照组小鼠的平均瘤体积为1916.88mm3；
fmt 同型对照组的平均肿瘤体积为1790.40mm3，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.679，相对肿瘤抑制率tgi(％)为6％；
无菌生理盐水 apd-1组的平均肿瘤体积为1402.64mm3，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.159，相对肿瘤抑制率tgi(％)为26％；
fmt apd-1组的平均肿瘤体积为1206.56mm3，相较对照组统计学上有显著性差异，p值为0.003，相对肿瘤抑制率tgi(％)为37％(表1)。
表1、在鼠结肠癌ct26模型中各组药效分析表
ct26模型所有组小鼠在给药后第15天(细胞接种后第24天即day24)，进行生存分析(表2)，用kaplan-meier方法分析各治疗组的生存曲线(图2)，fmt apd-1治疗组能够显著促进小鼠的生存期，相较对照组统计学上均有显著性差异(p值为0.002)。并且fmt apd-1和治疗组相较于无菌生理盐水 apd-1治疗组能进一步促进小鼠的生存期(p值为0.039)。
表2.在鼠结肠癌ct26模型中的生存分析
*mst：中位生存期(mediansurvivaltime)
**ils：生存期延长率(increaseoflifespan)。
1.一种健康人肠道菌群全菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；
对样本进行均质化；
对均质化的液体进行逐级过滤；
将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；
所述方法在厌氧条件下进行。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，离心2次，第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
使用无菌粪便采集盒收集新鲜粪便样本，取样后盖上盖子，送至实验室进行称量，并记录质量；
将采样盒放入在厌氧操作台的传递窗内，打开盒盖确保气体交换，盖上传递窗盖，启动去氧程序；5分钟后，将采样盒转移至操作台内部；
按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌，确保粪便不过分粘在采样盒上；
对样本粪便进行均质化；
对进行均质化的液体进行逐级过滤，优选地，所述逐级过滤为1mm-2mm、400-600μm、20-80μm；
将滤液转移至离心管内，离心2次，第一次离心条件为50g-200g，离心5-7分钟，第二次离心条件为4000g-5500g，离心5-7分钟，收集菌体沉淀；
用50ml无菌去氧生理盐水重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物。
4.根据前述任一项权利要求所述的制备方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
粪便来源的质量控制步骤；和/或，
人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述粪便来源的质量控制步骤包括选择18-40岁健康人，通过健康筛查和临床检查，所述健康筛查和临床检查包括：血液检查无hiv(humanimunodeficiencyvirus、乙肝病毒、eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)等感染；身体无消化道疾病及其他会影响肠道菌群的疾病如代谢综合征等；粪便检查无轮状病毒、诺如病毒、沙门氏菌、志贺菌属、耐碳青霉烯类抗生素肠杆科细菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、产超广谱beta-内酰胺酶肠杆科细菌、白色念珠菌、隐孢子虫及环孢子虫感染；三餐规律，作息规律；
所述人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤包括：无菌去氧生理盐水重悬所得菌液中，计数活菌率>5x1010个/ml视为合格。
6.根据前述任一项权利要求所述的制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物，或包含前述任一项权利要求所述的制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
7.治疗癌症的试剂盒，其包含权利要求6的人肠道菌群全菌组合物或药物组合物，以及pd-1抗体。
8.根据权利要求6所述的人肠道菌群全菌组合物或药物组合物在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途；优选地，所述癌症为消化道肿瘤；更优选地，所述癌症为结直肠癌。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述药物或试剂盒中还包括一种或多种免疫信号通路调节剂；优选地，所述免疫信号通路调节剂包括调节pd1/pdl1、pd1/pdl2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator，hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)、ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、tim3/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体，以及tigit/cd226中的一种或多种的试剂；更优选地，所述免疫信号通路调节剂为pd-1抑制剂，最优选为pd-1抗体。
10.根据前述任一项权利要求所述的用途，所述药物能够提高患者对pd-1抑制剂的治疗应答和/或延长肿瘤病人的生存期。
技术总结