本发明涉及蛹虫草产品加工提取技术领域，具体涉及纯天然预防和治疗失眠的产品制备方法及应用。
背景技术：
失眠是一种常见病、多发病，并且严重的影响了人们的生活、工作及身心健康。长期失眠者的严重意外事故和外伤发生率明显高于睡眠正常者。但传统抗失眠药物副作用大、依赖性较强，因此开发出健康的预防和治疗失眠的食品或者药品，成为科学研究的新问题。
文献报道许多天然药物如颧草属植物、枣根、生酸枣仁、炒酸枣仁、合欢花、南蛇藤果实、冬虫夏草、花生叶、半夏汤等提取物具有良好的镇静作用，且不良反应较少，具有广阔的应用前景。但这些天然药物都没有开发出抗失眠活性单体，所以具有服药剂量大，服用时间长等缺点。
冬虫夏草是虫草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科幼虫中以其为载体的虫菌复合体，含有丰富的蛋白质、脂肪、虫草酸、核苷类物质和多种氨基酸等活性物质，味道清香，早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳萎遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。目前研究证明蛹虫草具有抑制肿瘤、止咳镇静、驱风、散热、驻容美颜、延缓衰老、提高机体免疫力、镇静催眠等作用。
蛹虫草(cordycepsmilitaris)，属于新资源食品(卫生部公告2009年第3号)，在分类学上与冬虫夏草同归于虫草属,是一种珍贵的药用真菌，经本实验室研究证明，蛹虫草与冬虫夏草化学成分70％以上是相似的，药理作用与冬虫夏草相似，在临床上可替代冬虫夏草入药。由于冬虫夏草对生长环境的要求苛刻，导致冬虫夏草资源极为有限而不能满足日益增加的市场需求。目前，人工栽培蛹虫草已获成功，并实现了规模化生产，我们可以用人工栽培蛹虫草代替冬虫夏草入药。
陈桂宝等对蛹虫草水煎液的药理作用进行了研究，结果显示蛹虫草具有明显的镇静、增强戊巴比妥的睡眠作用。我们选取蛹虫草为原料，通过溶剂提取、色谱分离获得抗失眠有效成分n6-(2-羟乙基)腺苷，再配比虫草多糖提取物，以期开发一系列绿色、健康的具有预防和治疗失眠功效的食物或药物，为受睡眠影响生活的大众解决睡眠健康问题。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种天然预防和治疗失眠的产品制备方法及应用。第一方面，本发明提供了一种天然预防和治疗失眠的产品制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)虫草腺苷、虫草多糖提取物制备
(a)预处理：取烘干的蛹虫草子实体为原料，进行超低温粉碎处理，得到蛹虫草超微粉。
(b)水提：在超微粉中加入一定量提取溶剂，在一定温度条件下进行提取操作；合并提取液，浓缩。步骤(b)中的提取溶剂为纯化水；
(c)乙醇提取：在步骤(b)中得到的浓缩物用适量水分散，加入提取溶剂，在0-4℃的提取温度下进行浸提提取操作，对浸渍提取物进行离心处理，并收集离心处理后的上清，将收集的上清进行旋转蒸发浓缩烘干处理。上清液备用，沉淀即为虫草多糖提取物样品；步骤(c)中的提取溶剂为85-100％的乙醇；
(d)色谱分离：取步骤(c)中得到的上清液，加入15％甲醇-水溶液进行溶解，得到浓度为200mg/ml样品，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为dac150(150*250mmc1810μm)，洗脱方式：15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，收集52-67min馏分，浓缩干燥后即得腺苷样品。
(2)产品制作
本产品由虫草腺苷、虫草多糖为原料，虫草腺苷质量占比为55％、虫草多糖质量占比为45％混合制作而成。根据后期剂型需求不同，虫草腺苷、虫草多糖可以以任意比例，再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
优选的，步骤(1)(a)中的中的超微粉碎处理是将烘干处理后的蛹虫草原料，使用50-80目筛网的粉碎机进行粗粉碎处理，并对粗粉碎处理后的蛹虫草原料，使用超微粉碎机进行粉碎处理(300-500目)，得到所述蛹虫草超微粉。
优选的，步骤(1)(b)中的提取操作是指每隔0.5h搅拌一次，提取时间为每次3h，合并提取液，浓缩。
优选的，步骤(1)(c)中加入提取溶剂的质量是沉淀物的质量的1.5-2.5倍。
优选的，步骤(1)(c)中的离心处理是指将降温处理后的所述浓缩提取液置于离心瓶中，离心温度为8-12℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min。
优选的，步骤(1)(c)中的浓缩烘干处理的温度为60-70℃。
优选的，(1)(d)制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的c18，大小为150mm×250mm，洗脱方式为：洗脱方式为：15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，上样量为200ml，流速为600ml/min。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1与实施例2得到天然预防和治疗失眠的产品制备的流程图；
图2所示的是本发明实施例3所得到的产品(五类腺苷)急性毒性实验-对小鼠体重及饮食量影响变化结果。a.各组小鼠的平均体重，b.图为各组小鼠的平均饮食量；
图3所示的是本发明实施例3所得到的产品(五类腺苷)急性毒性实验-对小鼠各主要脏器(心、肝、脾、胃、肾、脑)的影响结果图，a.五类腺苷高剂量组(5.0g/kg)，b.五类腺苷中剂量组(2.5g/kg)，c.五类腺苷低剂量组(1.25g/kg)，d.空白组；
图4所示的是本发明实施例4所得到的产品(五类腺苷)影响小鼠睡眠实验结果。a.各组小鼠平均爬格子数，b.各组小鼠平均入睡时间，c.各组小鼠入睡率，d.各组小鼠平均睡眠持续时间；
图5所示的是本发明实施例4所得到的产品(五类腺苷)给药期间小鼠体重及饮食变化结果图，a图为各组小鼠的平均体重，b图为各组小鼠的平均饮食量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：虫草腺苷、虫草多糖提取物制备
(a)预处理：取烘干的蛹虫草子实体为原料，进行超低温粉碎处理，得到蛹虫草超微粉。
(b)水提：在超微粉中加入一定量提取溶剂，在一定温度条件下进行提取操作；合并提取液，浓缩。步骤(b)中的提取溶剂为纯化水；
(c)乙醇提取：在步骤(b)中得到的浓缩物用适量水分散，加入提取溶剂，在0-4℃的提取温度下进行浸提提取操作，对浸渍提取物进行离心处理，并收集离心处理后的上清，将收集的上清进行旋转蒸发浓缩烘干处理。上清液备用，沉淀即为虫草多糖提取物样品；步骤(c)中的提取溶剂为85-100％的乙醇；
(d)色谱分离：取步骤(c)中得到的上清液，加入15％甲醇-水溶液进行溶解，得到浓度为200mg/ml样品，微孔滤膜滤过，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为dac150(150*250mmc1810μm)，洗脱方式：15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，收集52-67min馏分，浓缩干燥后即得腺苷样品。
实施例2：产品制作
本产品由虫草腺苷、虫草多糖为原料，虫草腺苷质量占比为55％、虫草多糖质量占比为45％混合制作而成。根据后期剂型需求不同，虫草腺苷、虫草多糖可以以任意比例，再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
实施例3：本产品(五类腺苷)对小鼠的急性毒性实验
考查五类腺苷样品的急性毒性。
【药品及试剂】
受试样品：五类腺苷样品(批号：20131121、成分：虫草腺苷55％，虫草多糖45％、保存方法：4℃冷藏、配制方法：将虫草腺苷55％及虫草多糖45％混合后溶于纯水)
【实验动物】
km小鼠(18～25g，雌雄各半)(动物许可证号：scxk(京)2012-0001，合格证号：11400700020779)，动物来源(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，scxk(军)2012-0004)，饲料来源(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，scxk(军)2007-001)，饲养环境：普通级，室温，常规饲喂。
【实验方法】
1.分组及给药方法
将40只实验小鼠共分为4组，每组10只，雌雄各半，分为①五类腺苷高剂量组(5.0g/kg)、②五类腺苷中剂量组(2.5g/kg)、③五类腺苷低剂量组(1.25g/kg)、④空白组，以上各组在空腹12h后，按各组别给药剂量灌胃给药一次。
2.观察指标
每日对各组小鼠进行称重、饮食量计算、是否有死亡现象及按附表观察是否有中毒反应的发生(标准参考附表)，并进行记录，于第15天对各组小鼠进行解剖观测。
【实验结果】
根据表1的结果，可以初步推测，五类腺苷样品在给药剂量为1.25g/kg-5.0g/kg范围内，采用口服给药方式，其对小鼠的体重及饮食方面的影响表现为，五类腺苷减缓了小鼠体重的增长，且影响程度与给药量呈现正比关系；五类腺苷样品影响小鼠的每日摄食量，同样其影响程度与给药剂量呈现正比关系，由此推测，五类腺苷样品可能是减少小鼠的摄食量从而影响其体重增长(具体参见图2)。
各给药组别存活率均为100％，无死亡现象。
在不良反应方面，在给药剂量为1.25g/kg-5.00g/kg范围内出现不同程度的中毒反应，包括竖毛、困倦现象，涉及到自主神经系统及睡眠中枢系统，均为可逆反应；中毒反应随着给药量的减少其发生率降低或持续时间缩短(具体参见表1)。
在灌胃给药后15天对存活的小鼠进行大体解剖，对机体的主要脏器(心、肝、肺、胃、肾、脑)进行观测，并未发现有明显的器官改变(具体参见图3)。
表1五类腺苷急性毒性实验结果
附表：急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的组织、器官、系统
实施例4：本产品(五类腺苷)对小鼠睡眠的影响实验
采用连续给药后测定五类腺苷对小鼠活动性及戊巴比妥钠阈上、阈下剂量对小鼠睡眠的影响。
【药品及试剂】
五类腺苷样品(腺苷55％、虫草多糖45％，20140514)、枣仁安神胶囊(贵州同济堂制药有限公司，121104)、艾司唑仑片(天津太平洋制药有限公司，130503)、戊巴比妥钠(sigma公司分装)。
【试验动物】
km小鼠(18～22g)(动物许可证号：scxk(京)2012-0001，合格证号：11400700020779)
【器材及仪器】
注射器(上海治宇医疗器械有限公司)、秒表、el电子天平(常州天之平仪器设备有限公司)。
【步骤】
1.药物制备方法
五类腺苷灌胃剂：按样品给定混合比例，称取一定重量的虫草腺苷及虫草多糖样品至研钵中，充分研磨后再加入所需体积的生理盐水，混匀后备用。
枣仁安神胶囊灌胃剂：将胶囊内容物取出后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。
艾司唑仑片灌胃剂：将艾司唑仑片粉碎研磨后，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。
2.动物分组及给药方法
将72只实验小鼠共分为6组，每组12只，雌雄各半，分为①五类腺苷高剂量组(58.2mg/kg)、②五类腺苷中剂量组(29.1mg/kg)、③五类腺苷低剂量组(14.6mg/kg)、④枣仁安神胶囊组、⑤艾司唑仑片组、⑥空白组，以上除空白组外，其余各组均按相应给药剂量每日给药一次，连续给药15天，空白组在相同给药时间及给药时长灌胃给予生理盐水，连续灌胃15天。
3.观察指标
3.1小鼠大体状态
每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录。
3.2对小鼠自发活动(旷野法)的影响
小鼠连续灌胃15天后，在末次给药后1小时，采用旷野法将小鼠放入100cm×100cm×40cm无盖箱，铺设画有10cm×10cm格子的箱底，待小鼠适应5分钟后，记数2分钟内小鼠爬过的格子数，连续2次，取平均值进行结果的统计分析。
3.3对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响
观察受试药物能否延长戊巴比妥类使小白鼠翻正反射消失的时间。各组连续给药15天，末次给药1小时后，每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠闭上催眠剂量(使100％动物入睡，但又不使睡眠时间过长的腹腔注射剂量)，睡眠以翻正反射消失为指标。将动物背朝下仰卧于平板上，若动物保持此姿式30秒以上，则认为翻正反射消失。观察记录入睡潜伏期(腹腔注射至翻正反射消失的时间)和睡眠持续时间(翻正反射消失至恢复的时间)，结果进行统计学分析。
3.4对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响
用阈下催眠剂量戊巴比妥钠和受试药物合用，以翻正反射消失为指标,观察有无睡眠作用。各组连续给药15天，末次给药1小时后，每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠阈下催眠剂量(使90-100％的动物翻正反射不消失的最大剂量)，观察30分钟内有多少动物翻正反射消失达1分钟以上，如超过1分钟即为发生睡眠的动物，计算各给药组入睡率。
4.数据统计
对小鼠自发活动的影响及对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响数据均以
【结果】
由表2、图4实验结果可知，五类腺苷样品在给予剂量为58.2mg/kg服药天数为15天时与空白组小鼠在一定时间内爬过格子数比较有极显著差异(p<0.01)，其余各组与空白组比较有显著差异(p<0.05)，即给药后小鼠自主活动性降低，五类腺苷样品在给予剂量为58.2mg/kg与枣仁安神胶囊组(中药对照组)比较无明显差异，与艾司唑仑组(西药对照组)比较药效较弱。
在入睡潜伏时间方面，各组别与空白组比较均有极显著差异(p<0.01)，直观观测五类腺苷样品各组别药效略差于枣仁安神胶囊组(中药对照组)及艾司唑仑片组(西药对照组)。
在睡眠持续时间方面，五类腺苷样品在给予剂量为58.2mg/kg时，与空白组比较有极显著差异(p<0.01)；且此剂量与枣仁安神胶囊组(中药对照组)比较无明显差异。
在阈下剂量入睡率方面，各组别入睡率均高于空白组别，且五类腺苷样品在给予剂量为58.2mg/kg时，其入睡率与枣仁安神胶囊组(中药对照组)相同；五类腺苷样品在给予剂量为14.6mg/kg时，其入睡率与艾司唑仑组(西药对照组)相同。
由图5可知，在给药期间，各组别体重及饮食量均在一定范围内波动，无明显差别。
综上所述，推测五类腺苷在给药剂量为14.6mg/kg时可提高入睡率，减少机体的自主活动性，缩短入睡前时间；在给药剂量为58.2mg/kg时，可明显延长睡眠时间，改善睡眠质量。
表2睡眠相关试验结果
注：与空白组比较**p<0.01、*p<0.05。
1.一种纯天然预防和治疗失眠的产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)虫草腺苷、虫草多糖提取物制备
(a)预处理：取烘干的蛹虫草子实体为原料，进行超低温粉碎处理，得到蛹虫草超微粉；
(b)水提：在超微粉中加入一定量提取溶剂，在一定温度条件下进行提取操作；合并提取液，浓缩，步骤(b)中的提取溶剂为纯化水；
(c)乙醇提取：在步骤(b)中得到的浓缩物用适量水分散，加入提取溶剂，在0-4℃的提取温度下进行浸提提取操作，对浸渍提取物进行离心处理，并收集离心处理后的上清，将收集的上清进行旋转蒸发浓缩烘干处理，上清液备用，沉淀即为虫草多糖提取物样品，步骤(c)中的提取溶剂为85-100％的乙醇；
(d)色谱分离：取步骤(c)中得到的上清液，加入15％甲醇-水溶液进行溶解，得到浓度为200mg/ml样品，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为dac150(150*250mmc1810μm)，洗脱方式：15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，收集52-67min馏分，浓缩干燥后即得虫草腺苷样品；
(2)产品制作
本产品由虫草腺苷、虫草多糖为原料，腺苷质量占比为55％、虫草多糖质量占比为45％混合制作而成，根据后期剂型需求不同，虫草腺苷、虫草多糖可以以任意比例，再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
2.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取治疗失眠药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中的中的超微粉碎处理是将烘干处理后的蛹虫草原料，使用50-80目筛网的粉碎机进行粗粉碎处理，并对粗粉碎处理后的蛹虫草原料，使用超微粉碎机进行粉碎处理(300-500目)，得到所述蛹虫草超微粉。
3.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取治疗失眠药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(b)中的提取操作是指每隔0.5h搅拌一次，提取时间为每次3h，合并提取液，浓缩。
4.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取治疗失眠药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(c)中加入提取溶剂的质量是沉淀物的质量的1.5-2.5倍。
5.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取治疗失眠药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(c)中的离心处理是指将降温处理后的所述浓缩提取液置于离心瓶中，离心温度为8-12℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min。
6.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取治疗失眠药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(c)中的浓缩烘干处理的温度为60-70℃。
7.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取治疗失眠药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(d)制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的c18，大小为150mm×250mm，洗脱方式为：15％甲醇～水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，上样量为200ml，流速为600ml/min。
8.根据权利要求1所述预防和治疗失眠的产品制作方法，其特征在于：本产品腺苷质量占比为55％、虫草多糖质量占比为45％混合制作而成。
9.根据权利要求1所述预防和治疗失眠的产品制作方法，其特征在于：本产品虫草腺苷、虫草多糖为原料，根据后期剂型需求不同，虫草腺苷、虫草多糖可以以任意比例，再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
技术总结