本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种太岁发酵液的制备方法、太岁发酵液和应用。
背景技术：
太岁又称肉灵芝，李时珍《本草纲目》记载有肉灵芝，并把它收入“菜”部“芝”类，可食用、入药，奉为“本经上品”，功效为“久食，轻身不老，延年神仙”。据《神农本草经》记载：“肉灵芝，无毒、补中、益精气、增智慧，治胸中结，久服轻身不老”。《山海经》称之谓“视肉”、“聚肉”、“太岁”、“封”，乃古代帝王养生佳肴。太岁十分稀有，是百药中的上品。有典籍记载，太岁性平，苦，无毒，具有补脾润肺，补肾益肝等价值。《本草纲目》中记载：“肉芝状如肉。附于大石，头尾具有，乃生物也。赤者如珊瑚，白者如脂肪，黑者如泽漆，青者如翠羽，黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也”。东晋道家葛洪在《抱朴子》中记载，“诸芝捣末，或化水服，令人轻身长生不老”，是古人认为的长生不老仙药。
太岁性平，苦，无毒，具有补脾润肺，补肾益肝等价值。目前的研究表明太岁中含有一些特殊物质，可以改善人体微循环系统，双向调解人体内激素水平，促进免疫细胞因子产生，全面提高人体免疫力，并具有对多种病毒和变异细胞的吞噬能力。太岁也具有修复受损细胞，修复受损器官，增强人体器官功能；增强大脑和神经系统功能；保护强化肝脏及其他内分泌器官的功能；增强免疫功能，包括：a.修复受损的胸腺b.核酸分解物atp(三磷酸腺苷)增多，提高免疫器官的活动能力c.核酸分解产物增多，可以提高免疫器官制造t细胞的功能；增强新陈代谢功能；提高免疫力，防治各种老年性、功能性、退行性疾病。太岁肉中主要有多糖、蛋白质、脂类、氨基酸、维生素b1、b2、b6、常量和微量元素、核酸、皂甙、黄酮、吡咯喹啉醌(pqq)、多肽等。由于太岁肉生长缓慢，从太岁肉分离提取功效成分受到限制。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种太岁发酵液的制备方法、太岁发酵液和应用，采用本发明提供的太岁发酵液的制备方法制备得到的太岁发酵液，提高了太岁发酵液中的功效成分含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种太岁发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)将猕猴桃、李子、草莓和灵芝混合、打浆、过滤，得到滤液，将所述滤液与蜂蜜混合，得到太岁培养液；
2)将所述步骤1)得到的太岁培养液与太岁混合后进行发酵，得到发酵物，除去太岁后、过滤，得到太岁发酵液；
所述猕猴桃、李子、草莓、灵芝和蜂蜜的质量比为5～10:5～10:5～10:1～2:0.5～1。
优选的，所述步骤2)发酵的温度为15～30℃，所述发酵的ph值为2～3。
优选的，所述发酵的时间在1个月以上，
优选的，所述步骤2)太岁培养液与太岁的质量比为0.5～1:100～200。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备的太岁发酵液，所述太岁发酵液中吡咯喹啉醌的含量为67.46～76.02μg/ml，多糖的含量为1.98～2.9mg/ml，蛋白质的含量为4.26～5.92mg/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的太岁发酵液在延长秀丽隐杆线虫寿命中的应用。
优选的，将所述太岁发酵液饲喂秀丽隐杆线虫。
优选的，所述太岁发酵液的饲喂浓度为0.75～1.5mg/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的太岁发酵液在清除dpph中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的太岁发酵液在除皱中的应用。
本发明还提供了一种太岁发酵液的制备方法，包括以下步骤：1)将猕猴桃、李子、草莓和灵芝混合、打浆、过滤，得到滤液，将所述滤液与蜂蜜混合，得到太岁培养液；2)将所述步骤1)得到的太岁培养液与太岁混合后进行发酵，得到发酵物，除去太岁后、过滤，得到太岁发酵液；所述猕猴桃、李子、草莓、灵芝和蜂蜜的质量比为5～10:5～10:5～10:1～2:0.5～1。在本发明中，所述太岁培养液为太岁提供良好的生长条件的同时，还提高了太岁的代谢活性，从而提高了太岁发酵液中的功效成分含量。
附图说明
图1为秀丽隐杆线虫的寿命曲线；
图2为不同浓度的太岁液对dpph的清除率；
图3为皮肤总皱纹面积变化；
图4为皮肤平均皱纹长度变化；
图5为皮肤平均皱纹深度变化。
具体实施方式
本发明提供了一种太岁发酵液的制备方法，包括以下步骤：
1)将猕猴桃、李子、草莓和灵芝混合、打浆、过滤，得到滤液，将所述滤液与蜂蜜混合，得到太岁培养液；
2)将所述步骤1)得到的太岁培养液与太岁混合后进行发酵，得到发酵物，除去太岁后、过滤，得到太岁发酵液；
所述猕猴桃、李子、草莓、灵芝和蜂蜜的质量比为5～10:5～10:5～10:1～2:0.5～1。
在发明对所述混合、打浆和过滤的条件没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述猕猴桃的作用是为太岁的生长提供碳水化合物，维生素和微量元素，尤其是维生素c、维生素a；所述李子的作用是为太岁的生长提供糖、蛋白質、脂肪、矿物质、多种氨基酸及纤维素等；所述草莓的作用是为太岁的生长提供苹果酸、柠檬酸、维生素b1、维生素b2，以及胡萝卜素、钙、磷、铁等；所述灵芝优选为灵芝粉，所述灵芝粉的粒径优选为100～200目，所述灵芝的作用是为太岁的生长提供有机酸、氨基酸、葡萄糖、多糖类水溶性蛋白质等；所述蜂蜜的作用是为太岁的生长提供能源、蛋白质、多种维生素及矿物质。本发明对上述原料的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明对上述原料的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明对所述灵芝和蜂蜜的种类没有特殊限定，采用常规即可。
在本发明中，所述发酵的温度优选为15～30℃，所述发酵的ph值优选为2～3，所述发酵的时间优选在1个月以上。在本发明中，所述太岁培养液与太岁的质量比为0.5～1:100～200，更优选为0.8:140～160。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备的太岁发酵液，所述太岁发酵液中吡咯喹啉醌的含量为67.46～76.02μg/ml，多糖的含量为1.98～2.9mg/ml，蛋白质的含量为4.26～5.92mg/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的太岁发酵液在延长秀丽隐杆线虫寿命中的应用。本发明优选将所述太岁发酵液制备成药物后再应用到秀丽隐杆线虫中，本发明对所述药物的种类和药物中太岁发酵液的含量没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述应用优选包括：将所述太岁发酵液饲喂秀丽隐杆线虫，所述太岁发酵液的饲喂浓度优选为0.75～1.5mg/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述的太岁发酵液在清除dpph中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的太岁发酵液在除皱中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将500克猕猴桃、500克李子、500克草莓和100克的灵芝粉(150目)混合、打浆、过滤，得到滤液，将滤液和50克蜂蜜充分搅拌均匀，得到营养液。将野生太岁:营养液:矿泉水按重量比1:100:100的比例混合，培养1个月，培养温度25℃，ph值为2.5，培养结束后采用膜过滤方法(0.45微米)过滤分离，滤液即为太岁发酵液。采用常规分析方法检测太岁发酵液中的吡咯喹啉醌、蛋白质、粗多糖和核酸，结果见表1。
表1太岁发酵液的检测结果
实施例2
不同浓度的肉灵芝发酵液对野生型秀丽隐杆线虫的寿命的影响，秀丽线虫培养：使用的秀丽线虫均为野生型秀丽线虫(thebristoln2strain)，以e.coliop50为食，在ngm(nematodegrowthmedium)培养基生长，于20℃恒温培养箱培养。为保证同一批实验中，秀丽线虫生理状态相近，实验前需对秀丽线虫进行同期化处理，将ngm培养基中秀丽线虫用m9缓冲液冲洗收集到1mlep管中，静置5分钟至秀丽线虫沉淀，移走上清，沉淀重新加入m9缓冲液，如此反复冲洗1次，待冲洗结束，将多余m9缓冲液移除，保留秀丽线虫沉淀，并向其中加入1ml裂解液，裂解3分钟，使用手掌离心机，低速离心，移除裂解液，m9冲洗一次，移除多余液体，用移液器将沉淀吸取到涂布有e.coliop50的ngm培养基中，待虫卵孵化，孵化后的秀丽线虫可被视为同期化的秀丽线虫。同期化的l4期秀丽线虫50只放在含有充足e.coliop50的特定培养基(ngm培养基或含不同浓度pq的诱导培养基)中，给药组秀丽线虫根据实验要求，将dhhp-6按不同浓度添加到e.coliop50中，作为秀丽线虫的食物，20℃培养箱培养，每小时(诱导组)或每天(非诱导组)统计秀丽线虫的死亡数。用挑虫器轻触秀丽线虫头部，30s内无反应则该秀丽线虫死亡，成虫体内存在已孵化幼虫的现象被称为“虫袋”，因“虫袋”死亡的秀丽线虫不计入死亡数，每组实验重复三次，使用graphpadprism5采用kaplan-meier法作存活率曲线图，log-rank法比较各组间差异性，p<0.05计为*，p<0.01为**，p<0.001为***。结果见图1。
与空白对照组相比，0.75、1.5、3mg/ml的太岁发酵液对野生型秀丽隐杆线虫的寿命均有延长，但是3mg/ml的太岁发酵液作用不稳定，而1.5mg/ml的比0.75mg/ml的效果好，这说明太岁发酵液中可能存在着一些抗菌肽的物质对线虫的寿命产生了负作用。因此，浓度为1.5mg/ml，延长了线虫寿命的30％。
实施例3
不同浓度的实施例1制备的太岁发酵液dpph清除率的测定
(1)溶液的配制
首先配制dpph溶液(现配现用)。称取2mgdpph，溶于2.5ml无水乙醇配成母液(浓度为2mmol/l)，再取1ml，稀释10倍用于测定。注意避光保存。
所需测定的太岁发酵液的配制，称取10mg的太岁发酵液，按比例配成10mg/ml的母液，用时按不同比例稀释即可。
(2)各试剂的混合
在1ml的ep管中混合。设置实验组(s)，对照组(d)和空白组(k)。
按如下方法加入。
实验组：200μl太岁发酵液 600μldpph；
对照组：200μl无水乙醇 600μldpph；
空白组：200μl太岁发酵液 600μl乙醇。
dpph最后加入，注意避光。加完后，放入离心机，3000转离心20分钟。使用uv/vis分光光度计在517nm下进行吸光度测定。用乙醇调零。
每组设定多个平行实验。
(3)计算
计算公式如下：
清除率＝[d-(s-k)]/d＝1-(s-k)/d
多测几组浓度，求得清除率曲线，结果见图2。
从图2中可以得出太岁液对自由基的清除率随着浓度的增加而增加，浓度为4mg/ml时清除率可达到80％。
实施例4
实施例1制备的太岁发酵液对皮肤皱纹的影响
用无菌水配制20％的太岁发酵液作为受试样品，无菌水做空白对照。选择年龄在18-60岁的有效志愿者5人作为受试者按照要求在面部或其他皮肤处标记点，连续使用受试样品5周，用visiolinevl650皱纹分析系统测定受试者标记点使用样品前后皮肤各指标变化，以此来评价该样品对皮肤各项指标的影响。
visiolinevl650皱纹分析系统原理是借助倾斜的光照在皮肤的硅胶复制模型上，有皱纹的地方就会形成阴影，在主机平台上方在一个高分辨率的摄像机，通过专用软件分析这些阴影部分的面积、长度及皱纹深度值变化来反映皱纹变化。结果用总皱纹面积(mm2)、平均皱纹长度(mm)、平均皱纹深度(μm)表示，后续分析时以第一次拍摄的照片作为定位参照。
复制皱纹模型时让受试者平躺，头部左侧面向上，闭眼，将定位胶贴在标记点。倒入一定量硅胶与塑料小盒内，加入适量catalyst促凝剂，快速搅拌均匀，将硅胶均匀涂于定位胶圈定的区域，10min后揭下硅胶贴于visiolinevl650皱纹分析系统专用定位纸板上。用visiolinevl650皱纹分析系统分析受试者使用前、连续使用1周、2周、3周、4周、5周内眼角细纹硅胶复制模型的皱纹变化。将制作好的硅胶复制品置于visiolinevl650的平台上，调节好焦距及光线，光线与皱纹线条垂直，拍照后分析总皱纹面积(mm2)、平均皱纹长度(mm)、平均皱纹深度(μm)变化。结果见图3、图4、图5。
受试者使用太岁发酵液5周后总皱纹面积从88mm2减少到70mm2，平均皱纹长度从1.3mm减少到0.8mm，平均皱纹深度从78μm减少到70μm，说明太岁发酵液有比较明显的抗皱功效。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的制备方法制备得到的太岁发酵液，提高了太岁发酵液中的功效成分含量，对秀丽隐杆线虫具有延长寿命的作用，具有除皱功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种太岁发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将猕猴桃、李子、草莓和灵芝混合、打浆、过滤，得到滤液，将所述滤液与蜂蜜混合，得到太岁培养液；
2)将所述步骤1)得到的太岁培养液与太岁混合后进行发酵，得到发酵物，除去太岁后、过滤，得到太岁发酵液；
所述猕猴桃、李子、草莓、灵芝和蜂蜜的质量比为5～10:5～10:5～10:1～2:0.5～1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)发酵的温度为15～30℃，所述发酵的ph值为2～3。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的时间在1个月以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)太岁培养液与太岁的质量比为0.5～1:100～200。
5.一种利用权利要求1～4任一项所述的制备方法制备的太岁发酵液，其特征在于，所述太岁发酵液中吡咯喹啉醌的含量为67.46～76.02μg/ml，多糖的含量为1.98～2.9mg/ml，蛋白质的含量为4.26～5.92mg/ml。
6.权利要求5所述的太岁发酵液在延长秀丽隐杆线虫寿命中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述太岁发酵液饲喂秀丽隐杆线虫。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述太岁发酵液的饲喂浓度为0.75～1.5mg/ml。
9.权利要求5所述的太岁发酵液在清除dpph中的应用。
10.权利要求5所述的太岁发酵液在除皱中的应用。
技术总结