本发明属于一种医药
技术领域：
，具体是涉及到一种治疗风热感冒的猴头菌培养基、桑叶猴头菌转化菌丝体、提取物和应用。
背景技术：
：桑叶是桑科植物桑的干燥叶，其药用价值主要是疏散风热，清肺润燥，清肝明目。用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花。针对不同的用途，常配以其他的药物，比如：1、疏散风热：用于风热感冒及目赤肿痛，常配菊花。2、清肝明目：用于风火目疾(如急性结膜炎)。配黑芝麻名桑麻丸，用于肝阴不足，肝阳上亢引起的头晕、视物昏花。3、清肺润燥∶用于肺热燥咳。桑叶苦寒清泄肺热，甘寒益阴，凉润肺燥，故可用于燥热伤肺、干咳少痰，轻者可配杏仁、沙参、贝母等同用，如桑杏汤；重者可配生石膏、麦冬、阿胶等同用。为了提高治疗风热感冒的效果，常常将几种常见的对风热感冒具有疗效的物质配伍，比如cn201110209106.9一种无糖型风热感冒颗粒剂及其制备方法，颗粒剂主要由主料和辅料组成，主料包括板蓝根、连翘、薄荷、荆芥穗、桑叶、芦根、牛蒡子、菊花、苦杏仁、桑枝和六神曲，辅料主要包括甜菊糖苷、阿斯巴甜、羧甲淀粉钠和适量麦芽糊精；其制备方法是先将薄荷和荆芥穗提取挥发油备用，提取挥发油后的药渣和其他主料按规定的顺序投料，煎煮三次，过滤，将滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.15(60℃)的清膏，喷雾干燥得到浸膏粉，将筛选的辅料加入到浸膏粉，然后投入到干法制粒机内，制成10～30目颗粒，喷入提取的挥发油，混合均匀，包装即得；采用该方法制备的颗粒剂不含蔗糖，辅料用量少，比原颗粒剂服用量大幅减少，生产成本低，工艺改进后，有效成分牛蒡苷含量高。猴头菌为多孔蓖科真菌猴头菌的子实体，功能主治为：利五脏，助消化，主治消化不良，神经衰弱、身体虚弱，主要作为食材。cn201910305542.2一种治疗感冒、咳嗽、咽炎、发烧、腹泻的中药制剂，其原料按重量的配方如下：鱼腥草300-600份、紫苏200-400份、灵芝200-400份、蒲公英200-400份、五味子150-300份、白术150-300份、夏枯球150-300份、仙鹤草150-300份、小叶榕150-300份、甘草150-300份、黄苓100-200份、八角茴香100-200份、百部100-200份、枳实100-200份、白芷100-200份、桑叶100-200份，其采用了灵芝和桑叶作为中药组分，但是其主要是利用组分中具有提高免疫力等作用来达到预防风热感冒的作用，治疗效果并不突出。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种治疗风热感冒的猴头菌培养基、桑叶猴头菌转化菌丝体、提取物和应用，采用桑叶做猴头菌的培养基，显著的提高了其治疗风热感冒的效果。本发明的内容为治疗风热感冒的猴头菌培养基，包括桑叶80-90份和基础培养基10-20份，所述基础培养基包括如下重量分数的各组分：麦麸60-80％，玉米芯粉20-40％。优选的，包括桑叶85份和基础培养基15份。本发明的猴头菌可以采用市场上常见的猴头菌作为菌种。一种桑叶猴头菌转化菌丝体，制备方法为，将猴头菌接种到上述猴头菌培养基中，控制温度为25-28℃，空气相对湿度为85％～90％，培育时间为22-25天，取出猴头菌菌丝体，得到桑叶猴头菌转化菌丝体。一种桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物，提取物的制备方法包括如下步骤，首先，将桑叶猴头菌转化菌丝体干燥，粉碎，超声波处理，然后加入55-60℃水中浸泡，过滤，浓缩，得到浓缩液；然后，将浓缩液抽真空干燥，得到桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物。优选的，桑叶猴头菌转化菌丝体和水的重量比为1：4-5，浸泡次数为2-3次，每次浸泡时间为2-3h。本发明还提供一种提取物在制备治疗风热感冒药物方面的应用。本发明的有益效果为，一般来说，人们培养猴头菌，主要是利用其子实体，子实体才是猴头菌的价值所在，子实体外的菌丝体部分连同培养基部分会作为废料进行处理，本发明反其道而行之，采用桑叶作为培养基的主要组成部分，桑叶占培养基的比例为80％以上，将猴头菌接种到本申请猴头菌培养基后，猴头菌的菌丝体部分较为发达，得到的菌丝体较多，将其提取后得到的提取物，具有较好的预防和治疗风热感冒的作用。桑叶虽然具有抗风热感冒的作用，但是一般来讲，单独使用桑叶，无论是浸泡煮水还是其他方式都难以达到较好的效果，本发明将桑叶作为培养基采用猴头菌进行培养，显著的提高了其抗风热感冒的效果。具体实施方式实施例1一种桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物，提取物的制备方法包括如下步骤，首先，将猴头菌接种到猴头菌培养基中，控制温度为25℃，空气相对湿度为85，培育时间为25天，取出猴头菌菌丝体，得到桑叶猴头菌转化菌丝体。猴头菌培养基，包括桑叶45份和基础培养基350份，所述基础培养基包括如下重量分数的各组分：棉籽壳40％，麦麸或米糠20％，玉米芯粉25％，水15％。将桑叶猴头菌转化菌丝体干燥，粉碎，超声波处理，然后加入55-60℃水中浸泡，过滤，浓缩，得到浓缩液；桑叶猴头菌转化菌丝体和水的重量比为1：4，浸泡次数为2次，每次浸泡时间为2h。然后，将浓缩液抽真空干燥，得到桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物。实施例2一种桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物，提取物的制备方法包括如下步骤，首先，将猴头菌接种到猴头菌培养基中，控制温度为28℃，空气相对湿度为90％，培育时间为22天，取出猴头菌菌丝体，得到桑叶猴头菌转化菌丝体。猴头菌培养基，包括桑叶40份和基础培养基350份，所述基础培养基包括如下重量分数的各组分：棉籽壳30％，麦麸或米糠30％，玉米芯粉20％，水20％。将桑叶猴头菌转化菌丝体干燥，粉碎，超声波处理，然后加入55-60℃水中浸泡，过滤，浓缩，得到浓缩液；桑叶猴头菌转化菌丝体和水的重量比为1：5，浸泡次数为3次，每次浸泡时间为2h。然后，将浓缩液抽真空干燥，得到桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物。实施例3一种桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物，提取物的制备方法包括如下步骤，首先，将猴头菌接种到猴头菌培养基中，控制温度为26℃，空气相对湿度为90％，培育时间为23天，取出猴头菌菌丝体，得到桑叶猴头菌转化菌丝体。猴头菌培养基，包括桑叶50份和基础培养基400份，所述基础培养基包括如下重量分数的各组分：棉籽壳35％，麦麸或米糠30％，玉米芯粉20％，水15％。将桑叶猴头菌转化菌丝体干燥，粉碎，超声波处理，然后加入55-60℃水中浸泡，过滤，浓缩，得到浓缩液；桑叶猴头菌转化菌丝体和水的重量比为1：4，浸泡次数为3次，每次浸泡时间为3h。然后，将浓缩液抽真空干燥，得到桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物。实施例4对组胺致小鼠皮肤毛细血管通透性增高的影响取小鼠40只，雌雄各半，体重20-24g，在实验室适应性饲养2天，随机分为4组，每组10只。①氯化钠注射液组20ml/kg；②醋酸泼尼松组10mg/kg；③桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物小剂量组3.5g生药/kg；④桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物大剂量组7.5g生药/kg。各组均灌胃给药，每天1次，连续给药3天。末次给药30min后给小鼠尾静脉注射0.5％的伊文思蓝溶液0.1ml/10g，随即腹部皮下注射5mg％的组胺溶液0.1ml/10g，20min后处死小鼠，剪下腹部蓝染皮片(1.5×1.5cm2)，剪碎后浸泡于5ml70％的丙酮溶液中，45℃孵育72～96h，直至皮肤蓝色完全消失时取出，1500g离心15min，取上清液，用722分光光度计(波长620nm)测量吸光度(od)，实验结果各给药组与氯化钠注射液组比较，组间t检验处理，结果见表1。表1不同药物对组胺致小鼠皮肤毛细血管通透性影响表组别剂量od值抑制率120ml/kg0.521±0.082-210mg/kg0.341±0.13443.5433.5g生药/kg0.465±0.10327.6847.5g生药/kg0.354±0.04342.85与氯化钠注射液组比较*p<0.05,**p<0.01由表1可见，本发明药物对组胺所致小鼠毛细血管通透性增加有抑制作用，抑制作用明显，与氯化钠注射液组比较有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。实施例5对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响取小鼠40只，雌雄各半，体重20-24g，在实验室适应性饲养2天，随机分为4组，每组10只。①氯化钠注射液组20ml/kg；②醋酸泼尼松组10mg/kg；③桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物小剂量组3.5g生药/kg；④桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物大剂量组7.5g生药/kg。各组均灌胃给药，每天1次，连续给药3天。末次给药60min后，每鼠右耳涂二甲苯0.05ml致炎，左耳作为正常对照。致炎1h后处死小鼠，用直径9mm的打孔器取下双侧耳片，分别称其重量，以两耳片重量之差作为肿胀度，按下式计算抑制率。实验结果各给药组与氯化钠注射液组比较，组间t检验处理，结果见表2。表2不同药物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀影响表组别剂量肿胀度抑制率120ml/kg7.4±2.2-210mg/kg3.6±1.552.5233.5g生药/kg4.7±2.536.4347.5g生药/kg3.7±1.451.74与氯化钠注射液组比较*p<0.05,**p<0.01。由表2可见，本发明抑制二甲苯刺激小鼠耳部诱发的急性渗出性炎症反应，使肿胀度减小，与氯化钠注射液组比较，效果显著。表明本发明药物有抗小鼠急性渗出性炎症的作用。实施例6体内抗菌、抗病毒实验实验菌株毒株：①、金黄色葡萄球菌atcc25923株，流感嗜血杆菌cmcc(b)58535株。冻干菌种购自中国预防医学科学院北京药品生物制品检定所中国医学细菌保藏中心。实验前接种于5％牛血清mha平板37℃培养18-24h，用无菌5％甘油生理盐水洗脱菌苔，制成菌液，置-20℃冻存。使用前用生理盐水配成使用浓度菌液。实验方法，参照卫生部药政局《新药临床前研究指导》中“体内抗菌实验原则”、“体内抗病毒实验原则”和《中药药理研究方法学》，采用孙氏综合法测定中药组合物浸粉对金黄色葡萄球菌atcc25923株、流感嗜血杆菌cmcc58535株感染icr小鼠的半数保护量，计算其95％可信限。1、实验菌和病毒对小鼠的最小致死量(mld)测定将小鼠随机分组，每组5只，雌雄兼用。将小鼠用乙醚浅麻醉。用生理盐水将实验菌液配成108cfu/ml，再进行10倍连续梯度稀释。病毒液用生理盐水自1:100开始做10倍连续梯度稀释。每一稀释梯度菌液或病毒液滴鼻吸入法感染一组小鼠，感染量30μl/20g体重，2次/日，连续感染2日。同时设立正常对照组，用等体积生理盐水滴鼻。精心饲养，观察、记录各组小鼠死亡情况。对照组小鼠完全正常时，在7日内致一个实验组内小鼠全部死亡的最小剂量组的细菌量为最小致死量(mld)。测定结果：金黄色葡萄球菌atcc25923株感染小鼠的mld为3×108cfu/kg。流感嗜血杆菌cmcc58535株株感染小鼠的mld为3×109cfu/kg。2、实验药物对感染小鼠的0％(ed0)和100％(ed100)保护预测定小鼠随机分组，每组5只，雌雄兼用。将小鼠浅麻醉，用实验菌和实验病毒的mld量滴鼻吸入法感染小鼠。设立感染模型对照和正常对照。首次感染后2h开始给药。将中药组合物药粉用蒸馏水由4％(m/v)浓度起做5倍连续梯度稀释，每一稀释度药液灌胃给药一组小鼠，给药量0.5ml/20g体重。感染模型组和正常对照组给予蒸馏水0.5ml/20g。每日给药一次，连续给药7日。精心饲养，观察、记录7日内小鼠死亡情况。组内小鼠全部死亡的最大给药量为0％保护量；组内小鼠全部存活的最小给药量为100％保护量。测定结果：本发明提取物对金黄色葡萄球菌atcc25923株、流感嗜血杆菌58535株感染小鼠的ed100为15.64g生药/kg，ed0为0.1235g生药/kg。3、50％保护量(ed50)的测定小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半。小鼠浅麻醉后，用mld量实验菌液和病毒液滴鼻吸入法感染小鼠，设立感染模型对照组以及正常对照组，首次感染2h后开始灌胃给药。根据ed100和ed0预实验数据设立最大给药剂量和组间稀释倍数。将中药组合物浸粉药粉用蒸馏水由最大给药剂量(金葡菌感染组的最大给药剂量4.1175g生药/kg，对流感嗜血杆菌感染组最大给药剂量8.235g生药/kg，做二倍连续梯度稀释，共做6个梯度，每一梯度药液灌胃给予一组小鼠。感染模型组和正常对照组给予蒸馏水0.5ml/20g体重。每日给药2次(间隔8h)，连续给药7日。精心饲养，观察、记录各组小鼠死亡情况。统计、整理实验数据，用寇氏改良法计算中药组合物对实验菌感染小鼠的ed50以及95％可信限。计算公式：ed50＝antilg[xm–i(∑p-0.5)]95％可信限＝antilg[x50±1.96i(∑p-∑p2/n–1)-2]xm：最大实验剂量对数值，i：组间对数值差(稀释倍数对数值)，p：存活率，n：组内动物数，antilg：反对数。实验结果，中药组合物对金黄色葡萄球菌atcc25923株、流感嗜血杆菌cmcc58535株感染icr小鼠的保护实验结果统计见表3和表4。表3本发明提取物对金黄色葡萄球菌atcc25923株感染小鼠体内保护实验结果组别给药剂量(g生药/kg)动物数死亡动物数存活率s14.11751001s22.05871010.9s31.02931020.8s40.51461030.7s50.25731070.3s60.128710100sc感染模型组-10100正常对照组-1001表4本发明提取物对流感嗜血杆菌25923株感染小鼠体内保护实验结果组别给药剂量(g生药/kg)动物数死亡动物数存活率流18.2351001流24.11751010.9流32.05871030.7流41.02931070.3流50.51461080.2流60.257310100感染模型组-10100正常对照组-1001上述实验结果表明，本发明提取物对金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌感染的小鼠均有明显的保护作用。实施例7体外抗流感病毒试验本发明提取物对mdck细胞的毒性作用采用细胞病变法结合mtt法检测本发明提取物对mdck细胞的毒性，实验结果见表5。本发明提取物的最大无毒浓度为(35.65mg/l)，半数致死浓度为(88.73mg/l)；金刚烷胺的最大无毒浓度为(11.34mg/l)，半数致死浓度为(34.53mg/l)。本发明提取物的毒性明显低于阳性对照药物金刚烷胺的毒性。表5本发明提取物对mdck细胞的毒性作用组别tc50tc0本发明提取物70.73mg/l35.65mg/l金刚烷胺34.61mg/l11.87mg/l本发明提取物在mdck中对h1n1的抑制作用采用cpe法结合mtt法检测重楼克感滴丸对h1n1的抑制作用，根据吸光度od值，计算各剂量在mdck细胞中对流感病毒h1n1的抑制率，采用reed-muench法计算半数抑制浓度ic50，并根据前面计算所得的本发明提取物的tc50值，计算治疗指数ti，结果见表6。表6本发明提取物对h1n1的抑制作用组别tc50ic50ti本发明提取物70.73mg/l4.97mg/l14.23金刚烷胺34.61mg/l4.68mg/l7.40本发明提取物的ic50和金刚烷胺的ic50值相当，说明药物对病毒h1n1具有较好的抑制作用。实施例8本发明提取物对甲1型(h1n1)流感病毒感染小鼠鼠肺病变的影响将小鼠随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组、本发明提取物组，共4组，每组10-11只。本发明提取物组给予相应剂量药物，利巴韦林组灌服利巴韦林75mg/kg(体重)，正常对照组和病毒对照组灌服等体积蒸馏水，除正常对照组外，各组小鼠在乙醚轻度麻醉下，以15～30ld50病毒液滴鼻感染，每鼠0.05ml。于感染前一天开始灌胃给药，每天1次，每次0.1ml/10g(体重)，连续5天。给药结束后第2天禁食禁水4小时以上，称重，处死，取出全肺，记录病变程度，于生理盐水中洗涤二次，用吸水纸吸干表面水分，称出肺重。依据：肺指数＝[肺重(g)/后体重(g)×100％]肺指数抑制率＝[(病毒对照组肺指数均数—实验组肺指数均数)/病毒对照组肺指数均数×100％]。逐个算出肺指数和肺指数抑制率，与对照组比较，进行组间t检验。表7本发明组合物对甲1型(h1n1)流感病毒感染鼠肺病变的影响组别剂量肺重(g)肺指数(g/g体重)抑制率正常对照-0.125±0.0070.583±0.045-病毒对照-0.240±0.0411.824±0.624-利巴韦林0.075g/kg0.137±0.0190.819±0.09255.1％本发明提取物0.3g/kg0.138±0.0100.803±0.15756.0％注：与病毒对照组比较，**：p＜0.01。表7结果表明，本发明提取物具有抑制流感病毒所致小鼠肺病变的作用，且效果明显，与病毒对照组比较，具有统计学意义(p＜0.01)。实施例9退烧统计试验针对感冒发烧患者，选取50例患者病例，年龄在20-70岁之间，痊愈例为42例，占84％；显效例为6例，占12％，好转例为2例，占4％，无效例为0例，总有效率100％。其中平均退烧起效时间为3.5个小时；平均体温降至正常时间为29个小时。疗效评定标准：痊愈：治疗三天以内，完全退烧，体温达到正常值，临床症状完全消失；显效：治疗三天以内，完全退烧，体温达到正常值，临床症状大部分消失；好转：治疗三天以内，退烧不完全，体温下降，临床症状部分消失；无效：临床症状无改善。当前第1页1 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技术特征：1.一种治疗风热感冒的猴头菌培养基，其特征是，包括桑叶80-90份和基础培养基10-20份，所述基础培养基包括如下重量分数的各组分：麦麸60-80％，玉米芯粉20-40％。
2.如权利要求1所述治疗风热感冒的猴头菌培养基，其特征是，包括桑叶85份和基础培养基15份。
3.一种桑叶猴头菌转化菌丝体，其特征是，制备方法为，将猴头菌接种到如权利要求1或2所述的猴头菌培养基中，控制温度为25-28℃，空气相对湿度为85％～90％，培育时间为22-25天，取出猴头菌菌丝体，得到桑叶猴头菌转化菌丝体。
4.一种桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物，其特征是，提取物的制备方法包括如下步骤，
首先，将权利要求3所述的桑叶猴头菌转化菌丝体干燥，粉碎，超声波处理，然后加入55-60℃水中浸泡，过滤，浓缩，得到浓缩液；
然后，将浓缩液抽真空干燥，得到桑叶猴头菌转化菌丝体的提取物。
5.如权利要求4所述的提取物，其特征是，桑叶猴头菌转化菌丝体和水的重量比为1：4-5，浸泡次数为2-3次，每次浸泡时间为2-3h。
6.一种如权利要求4或5的提取物在制备治疗风热感冒药物方面的应用。
技术总结本发明属于一种医药技术领域，具体是涉及到一种治疗风热感冒的猴头菌培养基、桑叶猴头菌转化菌丝体、提取物和应用，治疗风热感冒的猴头菌培养基包括桑叶80‑90份和基础培养基10‑20份，所述基础培养基包括如下重量分数的各组分：麦麸60‑80％，玉米芯粉20‑40％，本发明采用桑叶做猴头菌的培养基，显著的提高了其治疗风热感冒的效果。
技术研发人员：何述金;周代俊;田建峰;向玉婷
受保护的技术使用者：湖南新汇制药股份有限公司
技术研发日：2020.03.11
技术公布日：2020.06.09
