本发明涉及一种紫毛野牡丹提取物的制备方法、抑菌操作方法及其应用，属于中药提取物技术领域。
背景技术：
近年来，随着器官移植、癌症放化疗、艾滋病患者的增加，广谱抗生素、肾上腺皮质激素的长期不合理应用，免疫功能低下患者的人数正在迅速上升，深部真菌感染的发病率及死亡率不断上升，感染率高峰已达7.3％。
与此同时念珠菌病已成为了深部真菌感染的主要类型。目前已发现并确认的念珠菌有200多种，其中约10％可以引起人类感染。我国2010年深部真菌感染病例的回顾性分析表明：以念珠菌属为主，占90.54％，念珠菌属中感染占前三位的分别是白念珠菌(54.73％)、热带念珠菌(13.18％)及光滑念珠菌(7.09％)。白念珠菌又名白假丝酵母菌(candidaalbicans，ca)，热带念珠菌又名热带假丝酵母菌(candidatropicalis，ct)，光滑念珠菌又名光滑假丝酵母菌(candidaglabrata，cg)。
白念珠菌难以防治的主要原因在于其具有广泛的耐药性。
目前能够有效治疗真菌感染的药物非常有限，主要有以下几类：
(1)多烯类抗真菌药物：两性霉素b；
(2)5-氟胞嘧啶；
(3)三唑类抗真菌药物：如酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等；
(4)丙烯胺类抗真菌药物：如特比萘芬，主要用于浅表真菌感染的治疗；
(5)棘白菌素类抗真菌药物：如卡泊芬净，具有杀菌作用；
但是上述5种药物均具有不同程度的不良反应。
临床上广泛应用的主要还是三唑类抗真菌药物(氟康哇、伊曲康哇)、两性霉素b和5-氟胞嘧啶。由于单独应用5-氟胞嘧啶进行治疗时，念珠菌会快速获得对5-氟胞嘧啶的耐药性，因此深部真菌感染的单一药物疗法普遍采用两性霉素b或三唑类抗真菌药物。两性霉素b虽然是有效的杀菌剂，因其明显的肾毒性和输注相关毒性，大大限制了它在临床上作为常规药物的应用。三唑类抗真菌药物是最大的一类抗真菌药物，酮康唑是最先使用的该类口服药，但现多被更有效低毒的三唑类衍生物如氟康唑、伊曲康唑等取代，但三唑类药物具有广泛的耐药性。
念珠菌属作为常见的真菌感染类型，临床治疗主要使用化学药品进行治疗，但这往往会产生耐药性、不良反应多等问题，使真菌感染的治疗变得越来越困难。作为一种新途径，从药用植物中寻找抗菌药物已有多年的历史。众所周知，药物植物中的化学成分、起效机制均复杂多样，药用植物的毒副作用、耐药性一般较西药小，故亟需寻找一种具有抗真菌感染的中药提取物来解决上述技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种紫毛野牡丹提取物的制备方法，该制法可获得紫毛野牡丹的水提物和醇提取物。
同时，本发明提供一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，该抑菌操作方法的菌种活化效果好，抑菌操作精准度高。
同时，本发明还提供一种紫毛野牡丹提取物在抗真菌中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一种紫毛野牡丹提取物的制备方法，包括以下步骤：
s1，取野牡丹属植物紫毛野牡丹，进行前处理，得药材干粉；
s2，称取适量药材干粉，加入相当于药材干粉9～11倍量的提取溶剂，于提取容器中浸泡至少2h后，热回流提取2～3h，过滤，收集滤液，滤渣中再加入相当于药材干粉4～6倍量的提取溶剂，热回流提取2～3h后，过滤，合并滤液，浓缩至干膏，冷藏保存，得紫毛野牡丹提取物。
所述前处理的方法包括将紫毛野牡丹晾干后，40～45℃鼓风干燥至恒重，粉碎，过60～80目筛，用密封袋包装扎紧，干燥器贮藏，备用。
所述提取溶剂包括水或醇；所述紫毛野牡丹提取物包括紫毛野牡丹水提干膏和紫毛野牡丹醇提干膏。
所述水包括超纯水，所述醇包括70～80％乙醇。
本发明还公开了一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，包括以下步骤：
步骤一，mh琼脂培养皿的制备：称取mh琼脂36.0g，溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；上述供培养用mh琼脂培养皿在配制时，另取20.0g葡萄糖与36.0gmh琼脂一同溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，制成含2％葡萄糖的mh琼脂培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；
步骤二，工作用菌的准备：取各供试菌菌种，分别划线于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面第一次活化，置37℃培养箱培养48h后刮取单菌落并划菌于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面进行二次活化，置37℃培养箱培养48h后作为工作用菌，置4℃冰箱保存备用；
步骤三，菌悬液的配制：量取4.9ml1％硫酸溶液和0.1ml0.5％氯化钡溶液入试管中充分混匀制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；
刮取工作用菌落，用无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×108cfμ/ml的菌悬液，用时新制；
上述配制均在无菌条件下进行；
步骤四，纸片扩散法抑菌试验：
s4a，试液的准备：称取紫毛野牡丹水提干膏和紫毛野牡丹醇提干膏，分别溶解于40.0ml超纯水中摇匀，配制成按原药量计算浓度为0.25mg/ml的药液，作为各提取物的抑菌溶液，置于4℃冰箱中贮存，备用；再精密称取氟康唑0.0250g置10ml容量瓶中，超纯水溶解并定容，得2.5mg/ml的氟康唑对照品药液，4℃冰箱贮存，备用；
s4b，纸片的制备：将粗滤纸制成直径6mm的圆型纸片，置西林瓶中，封口121℃高压灭菌20min，干燥，密封保存；
s4c，抑菌试验分为四组，分别为氟康唑溶液阳性对照组、超纯水空白组、紫毛野牡丹水提取物组、紫毛野牡丹醇提取物组；无菌条件下，取mh琼脂培养皿加菌悬液300μl，涂布均匀，吸出多余菌悬液，放置片刻，夹取圆形纸片，展平，置于培养皿中央，轻轻按压，分别吸取氟康唑溶液阳性对照组、超纯水空白组、紫毛野牡丹水提取物组、紫毛野牡丹醇提取物组的药液10μl滴加于纸片中央，盖上培养皿，做好标记，37℃培养，48h后观察并记录抑菌圈直径，每组重复三次。
本发明还公开了另一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，该抑菌操作方法为微量稀释法抑菌试验，具体包括以下步骤
s01，rpmi-1640培养基的制备：分别称取10.4grpmi-1640，34.5gmops，2.0gnahco3，置1000ml容量瓶中，加超纯水适量使溶解，以1mol/lnaoh调节培养基ph至7.0±0.1，超纯水定容至刻度；无菌条件下，以0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃冰箱中保存，备用；
s02，试液的制备：用时新制，分别精密称取紫毛野牡丹水提干膏和紫毛野牡丹醇提干膏，按生药量计算，分别以超纯水配制成4096μg/ml的药液，高压灭菌后分别用rpmi-1640液体培养基进行对倍稀释配制，得浓度为2048μg/ml，1024μg/ml，512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml的药液；再精密称取氟康唑对照品以超纯水配制成浓度为1024μg/ml的药液，高压灭菌后用rpmi-1640液体培养基对倍稀释得浓度为512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml的氟康唑药液，放入离心管架中，置4℃冰箱保存备用；
s03，菌悬液的配制：量取4.9ml1％硫酸溶液和0.1ml0.5％氯化钡溶液入试管中充分混匀制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；
刮取工作用菌落，用无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×108cfμ/ml的菌悬液，用时新制；
上述配制均在无菌条件下进行；
s04，菌悬液分两步稀释1000倍作为试验用菌液，试验设置分为氟康唑阳性对照组，水提物组、醇提取物组、空白组及阴性对照组，无菌条件下，取96孔板按组别分别加入相应溶液，其中氟康唑组、水提物组及醇提取物组分别加入先前配制好的相应药液100μl及100μl试验用菌液，空白组加入200μlrpmi-1640液体培养基，阴性对照组加入100μlrpmi-1640液体培养基及100μl试验用菌液，加好药液和试验用菌液后，适度振摇均匀，用多功能酶标仪在波长为450nm条件下进行测定，记录数据为空白板吸光度，放入37℃培养箱中培养48h后再进行测定，记录数据为培养48h后吸光度，计算mic值；
s05，mic的计算：以培养48h后各孔吸光度减去对应空白板各孔吸光度得差值，将阴性对照组的平均差值计为100％的生长率，其值的1/2计为50％的抑制率，实验组中平均差值最接近50％抑制率的对应浓度计为该药液的mic值。
所述供试菌菌种包括真菌。
本发明还适用于其他细菌等其他微生物。
真菌包括白假丝酵母菌ca、热带假丝酵母菌ct、光滑假丝酵母菌cg、克柔假丝酵母菌ck和近平滑假丝酵母菌cp。
一种紫毛野牡丹提取物在抗真菌中的应用。
一种紫毛野牡丹提取物在抗白假丝酵母菌ca、热带假丝酵母菌ct、光滑假丝酵母菌cg、克柔假丝酵母菌ck和近平滑假丝酵母菌cp中的应用。
本发明提供的一种紫毛野牡丹提取物的制备方法、抑菌操作方法及其应用，具有以下有益效果：
1、试验结果显示出，紫毛野牡丹的水提物和70～80％乙醇提取物在两种药敏试验方法中均表现出了一定的抑菌作用。整体而言，乙醇提取物体现出了较水提物要强的抑菌作用，这与其抗菌活性成分有关，而考虑到其水提取物及醇提取均表现出的抑菌作用，提示其抗菌活性成分不单一。这也符合中药提取物的起效作用机制，多成分，多靶点发挥药效，故紫毛野牡丹提取物的抗真菌作用的耐药性必然比西药小。
2、目前野牡丹属植物有关研究中显示，黄酮类和可水解鞣酸类成分为其属植物的特征性成分及活性成分，故在未来的研究中可以从此方向研究紫毛野牡丹的主要抑菌活性成分及抑菌机制。
3、念珠菌属作为常见的真菌感染类型，临床治疗主要使用化学药品进行治疗，但这往往会产生耐药性、不良反应多等问题，使真菌感染的治疗变得越来越困难。作为一种新途径，从药用植物中寻找抗菌药物已有多年的历史[1-3]，而将本发明与已有的研究成果对比，紫毛野牡丹提取物对白假丝酵母菌等的抑制效果显著。现其粗提物已获得良好抑菌效果，可为该植物的研究开发奠定一定基础。
[1]zhaosj(赵诗景),yingzx(应泽茜),hexw(何小稳).researchprogressofactiveconstituentsfromnaturalplantsagainstcandidaspp[j].naturalproductresearchanddevelopment(天然产物研究与开发).2017,29:715-721.
[2]jinousasgarpanah,seyyedjamalhashemi,elhamhashemi,etal.invitroantifungalactivityofsometraditionalpersianmedicinalplantsonpathogenicfungi[j].chinjintegrmed,2017,23(6):433-437.
[3]wangyl(王玉连),wujh(吴建华).advancesonantifungaltreatmentthroughchineseherbalmedicine[j].worldclinicaldrugs(世界临床药物),2018,39(9):638-641.
具体实施方式
下面对本发明作进一步的阐述，以下实例仅用于更加清楚的说明本发明的技术方案，而不能以此限制本发明的保护范围。
实施例1
紫毛野牡丹(melastomagenicillatumnaud.)归属于野牡丹科(melastomaceae)野牡丹属(melastoma)，《中国植物志》记载其国内仅分布于海南省，国外菲律宾亦有分布。在现有的研究中已经发现，野牡丹属中的野牡丹等植物有诸如治疗霍乱、腹泻、持续性发热、痢疾、白带、创伤、皮肤病等作用，在金色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌及溶血性链球菌等微生物的药敏试验中，显示出显著地抑制作用，其同科属的植物许多都具有一定的药用开发价值。而紫毛野牡丹作为野牡丹属植物之一，未见其药理作用的相关报道，故对其抑菌作用进行初步的研究，以期能够为紫毛野牡丹及其同属植物的研究提供一定参考。
1试验材料与设备
1.1试验材料：植株于2017年5月采自海南省屯昌县，经形态学鉴定确为野牡丹属植物紫毛野牡丹，晾干，40℃鼓风干燥，粉碎，过60目筛，用密封袋包装扎紧，干燥器贮藏，备用。
1.2供试菌种：白假丝酵母菌(candidaalbicans，ca)、热带假丝酵母菌(candidatropicalis，ct)、光滑假丝酵母菌(candidaglabrata，cg)、克柔假丝酵母菌(candidakrμseis，ck)、近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis，cp)。由海南医学院科学实验中心提供。
1.3仪器：yj-vs型超净工作台，cascadalsmk2型超纯水系统，spr2ng-r30型台式可挂壁纯水器，hh·cp-01型二氧化碳培养箱，gr60dr型全自动立式高压灭菌器，tanon-4100型全自动数码凝胶图像分析系统，synergyhtx型多功能酶标仪，dhg-9123a型电热恒温鼓风干燥箱，赛多利斯bs210s型电子天平，hyq-2121型涡旋混匀器。
2方法
2.1提取方法：称取药材粉100g，量取超纯水1000ml，加入沸石，于烧瓶中浸泡2h，煮沸2h，过滤，滤渣加500ml超纯水，煮沸2h，过滤，合并滤液，蒸干，计算得率，置4℃冰箱储存备用；另再称取药材粉100g，量取70％乙醇1000ml，加入烧瓶中，加入沸石，浸泡2h后，回流2h，过滤，再向烧瓶中加入500ml70％乙醇，继续回流2h，过滤，合并滤液，回收提取溶剂，浓缩至干膏，置4℃冰箱储存备用。
2.1mh琼脂培养皿的制备：称取mh琼脂36.0g，溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；供培养用mh琼脂培养皿在配制时另取20.0g葡萄糖与36.0gmh琼脂一同溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，制成含2％葡萄糖的mh琼脂培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用。
2.3工作用菌的准备：取各供试菌菌种，划线于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面第一次活化，置37℃培养箱培养48h后刮取单菌落、划菌于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面进行二次活化，置37℃培养箱培养，培养48h后作为工作用菌，置4℃冰箱保存备用。
菌悬液的配制：采用麦氏比浊法，量取4.9ml1％硫酸溶液和0.1ml0.5％氯化钡溶液入试管中充分混匀制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；刮取工作用菌落，用无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×108cfμ/ml的菌悬液，用时新制。配制均在无菌条件下进行。
2.4纸片扩散法抑菌试验
2.4.1试液的准备：根据预试验结果，称取水提干膏和70％乙醇提干膏，分别溶解于40.0ml超纯水中摇匀，配制成按原药量计算浓度为0.25mg/ml的药液，作为各提取的抑菌溶液，置于4℃冰箱中贮存，备用。再精密称取氟康唑0.0250g置10ml容量瓶中，超纯水溶解并定容，得2.5mg/ml的氟康唑对照品药液，4℃冰箱贮存，备用；
2.4.2纸片的制备：将粗滤纸制成直径6mm的圆型纸片，置西林瓶中，封口121℃高压灭菌20min，干燥，密封保存；
2.4.3试验内容：试验分为四组，分别为氟康唑溶液阳性对照组、超纯水空白组、紫毛野牡丹水提取物组、紫毛野牡丹70％乙醇提取物组。无菌条件下，取mh琼脂培养皿加菌悬液300μl，涂布均匀，吸出多余菌悬液，放置片刻，夹取圆形纸片，展平，置于培养皿中央，轻轻按压，吸取药液10μl滴加于纸片中央，盖上培养皿，做好标记，37℃培养，48h后观察并记录抑菌圈直径，每组重复三次。
2.5微量稀释法抑菌试验
2.5.1rpmi-1640培养基的制备：分别称取10.4grpmi-1640，34.5gmops，2.0gnahco3，置1000ml容量瓶中，加超纯水适量使溶解，以1mol/lnaoh调节培养基ph至7.0±0.1，超纯水定容至刻度。无菌条件下，以0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃冰箱中保存，备用。
2.5.2试液的准备：用时新制，分别精密称取紫毛野牡丹水提物干膏及70％乙醇提取物干膏，按生药量计算，分别以超纯水配制成4096μg/ml的药液，高压灭菌后分别用rpmi-1640液体培养基进行对倍稀释配制，得浓度为2048μg/ml，1024μg/ml，512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml的药液；再精密称取氟康唑对照品以超纯水配制成浓度为1024μg/ml的药液，高压灭菌后用rpmi-1640液体培养基对倍稀释得浓度为512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml的氟康唑药液，放入离心管架中，置4℃冰箱保存备用。
2.5.3试验内容：菌悬液分两步稀释1000倍作为试验用菌液，试验设置分为氟康唑阳性对照组，水提物组、70％乙醇提取物组、空白组及阴性对照组，无菌条件下，取96孔板按组别分别加入相应溶液，其中氟康唑组、水提物组及乙醇提取物组分别加入先前配制好的相应药液100μl及100μl试验用菌液，空白组加入200μlrpmi-1640液体培养基，阴性对照组加入100μlrpmi-1640液体培养基及100μl试验用菌液，加好药液和菌液后，适度振摇均匀，用多功能酶标仪在波长为450nm条件下进行测定，记录数据为空白板吸光度，放入37℃培养箱中培养48h后再进行测定，记录数据为培养48h后吸光度，计算mic值。
2.5.4mic的计算：以培养48h后，各孔吸光度减去对应空白板各孔吸光度得差值，将阴性对照组的平均差值计为100％的生长率，其值的1/2计为50％的抑制率，实验组中平均差值最接近50％抑制率的对应浓度计为该药液的mic值。
3结果
3.1纸片法抑菌试验结果：纸片法考察紫毛野牡丹水提取物及70％乙醇提取物的对各供试菌的抑制作用，所得结果见表1。
表1纸片法抑菌试验结果(抑菌圈直径：mm)
纸片法试验结果表明，紫毛野牡丹水提取物及70％乙醇提取物对五种假丝酵母菌均具有敏感性，对ck表现出中度敏感性，对其他四种酵母菌(ca、ct、cg、cp)表现为低敏感性；而其70％乙醇提取物对cg及cp表现出了高度敏感性，对另外三种酵母菌(ca、ct、ck)表现为中度敏感性。
3.2微量稀释法试验结果：微量稀释法考察紫毛野牡丹水提取物及70％乙醇提取物的对各供试菌的mic值，所得结果见表2。
表1紫毛野牡丹水提物的mic值(μg/ml)
微量稀释法试验结果表明，紫毛野牡丹水提物对五种假丝酵母菌均具有较为明显的抑制作用，其中对ca及cg的mic值为32μg/ml，对ct及cp的mic值为128μg/ml，而对ck的mic值为256μg/ml；而其70％乙醇提取物对五种假丝酵母菌亦具有较为明显的抑制作用，其中对ca及cg的mic值为32μg/ml，对ct的mic值为64μg/ml，而对ck及cp的mic值为128μg/ml。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于：前处理时鼓风干燥温度为45℃，过80目筛；提取时，一次提取时，提取溶剂的用量为900ml，浸泡时间为2.5h，热回流提取3h；二次提取时，提取溶剂的用量为400ml，提取时间为3h；提取溶剂为80％乙醇。
实施例3
本实施例与实施例2的区别仅在于：提取时，一次提取时，提取溶剂的用量为1100ml，浸泡时间为3h，热回流提取2.5h；二次提取时，提取溶剂的用量为600ml，提取时间为2.5h；提取溶剂为75％乙醇。
在此处所提供的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下被实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个发明方面中的一个或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时被一起分组到单个实施例或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本发明要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多特征。更确切地说，如权利要求书所反映的那样，发明方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发明的单独实施例。
本领域的技术人员能够理解，尽管在此所述的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。
尽管根据有限数量的实施例描述了本发明，但是受益于上面的描述，本技术领域内的技术人员明白，在由此描述的本发明的范围内，可以设想其它实施例。此外，应当注意，本说明书中使用的语言主要是为了可读性和教导的目的而选择的，而不是为了解释或者限定本发明的主题而选择的。因此，在不偏离所附权利要求书的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。对于本发明的范围，对本发明所做的公开是说明性的，而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书限定。
1.一种紫毛野牡丹提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1，取野牡丹属植物紫毛野牡丹，进行前处理，得药材干粉；
s2，称取适量药材干粉，加入相当于药材干粉9～11倍量的提取溶剂，于提取容器中浸泡至少2h后，热回流提取2～3h，过滤，收集滤液，滤渣中再加入相当于药材干粉4～6倍量的提取溶剂，热回流提取2～3h后，过滤，合并滤液，浓缩至干膏，冷藏保存，得紫毛野牡丹提取物。
2.根据权利要求1的一种紫毛野牡丹提取物的制备方法，其特征在于，所述前处理的方法包括将紫毛野牡丹晾干后，40～45℃鼓风干燥至恒重，粉碎，过60～80目筛，用密封袋包装扎紧，干燥器贮藏，备用。
3.根据权利要求1的一种紫毛野牡丹提取物的制备方法，其特征在于，所述提取溶剂包括水或醇；所述紫毛野牡丹提取物包括紫毛野牡丹水提干膏和紫毛野牡丹醇提干膏。
4.根据权利要求3的一种紫毛野牡丹提取物的制备方法，其特征在于，所述水包括超纯水，所述醇包括70～80％乙醇。
5.一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，mh琼脂培养皿的制备：称取mh琼脂36.0g，溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；上述供培养用mh琼脂培养皿在配制时，另取20.0g葡萄糖与36.0gmh琼脂一同溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min，冷至50～60℃，倾入无菌培养皿，制成含2％葡萄糖的mh琼脂培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；
步骤二，工作用菌的准备：取各供试菌菌种，分别划线于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面第一次活化，置37℃培养箱培养48h后刮取单菌落并划菌于2％葡萄糖的mh琼脂培养基平面进行二次活化，置37℃培养箱培养48h后作为工作用菌，置4℃冰箱保存备用；
步骤三，菌悬液的配制：量取4.9ml1％硫酸溶液和0.1ml0.5％氯化钡溶液入试管中充分混匀制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；
刮取工作用菌落，用无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×108cfμ/ml的菌悬液，用时新制；
上述配制均在无菌条件下进行；
步骤四，纸片扩散法抑菌试验：
s4a，试液的准备：称取紫毛野牡丹水提干膏和紫毛野牡丹醇提干膏，分别溶解于40.0ml超纯水中摇匀，配制成按原药量计算浓度为0.25mg/ml的药液，作为各提取物的抑菌溶液，置于4℃冰箱中贮存，备用；再精密称取氟康唑0.0250g置10ml容量瓶中，超纯水溶解并定容，得2.5mg/ml的氟康唑对照品药液，4℃冰箱贮存，备用；
s4b，纸片的制备：将粗滤纸制成直径6mm的圆型纸片，置西林瓶中，封口121℃高压灭菌20min，干燥，密封保存；
s4c，抑菌试验分为四组，分别为氟康唑溶液阳性对照组、超纯水空白组、紫毛野牡丹水提取物组、紫毛野牡丹醇提取物组；无菌条件下，取mh琼脂培养皿加菌悬液300μl，涂布均匀，吸出多余菌悬液，放置片刻，夹取圆形纸片，展平，置于培养皿中央，轻轻按压，分别吸取氟康唑溶液阳性对照组、超纯水空白组、紫毛野牡丹水提取物组、紫毛野牡丹醇提取物组的药液10μl滴加于纸片中央，盖上培养皿，做好标记，37℃培养，48h后观察并记录抑菌圈直径，每组重复三次。
6.一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，其特征在于，包括以下步骤：
s01，rpmi-1640培养基的制备：分别称取10.4grpmi-1640，34.5gmops，2.0gnahco3，置1000ml容量瓶中，加超纯水适量使溶解，以1mol/lnaoh调节培养基ph至7.0±0.1，超纯水定容至刻度；无菌条件下，以0.22μm微孔滤膜滤过，置4℃冰箱中保存，备用；
s02，试液的制备：用时新制，分别精密称取紫毛野牡丹水提干膏和紫毛野牡丹醇提干膏，按生药量计算，分别以超纯水配制成4096μg/ml的药液，高压灭菌后分别用rpmi-1640液体培养基进行对倍稀释配制，得浓度为2048μg/ml，1024μg/ml，512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml的药液；再精密称取氟康唑对照品以超纯水配制成浓度为1024μg/ml的药液，高压灭菌后用rpmi-1640液体培养基对倍稀释得浓度为512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml的氟康唑药液，放入离心管架中，置4℃冰箱保存备用；
s03，菌悬液的配制：量取4.9ml1％硫酸溶液和0.1ml0.5％氯化钡溶液入试管中充分混匀制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；
刮取工作用菌落，用无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×108cfμ/ml的菌悬液，用时新制；
上述配制均在无菌条件下进行；
s04，菌悬液分两步稀释1000倍作为试验用菌液，试验设置分为氟康唑阳性对照组，水提物组、醇提取物组、空白组及阴性对照组，无菌条件下，取96孔板按组别分别加入相应溶液，其中氟康唑组、水提物组及醇提取物组分别加入先前配制好的相应药液100μl及100μl试验用菌液，空白组加入200μlrpmi-1640液体培养基，阴性对照组加入100μlrpmi-1640液体培养基及100μl试验用菌液，加好药液和试验用菌液后，适度振摇均匀，用多功能酶标仪在波长为450nm条件下进行测定，记录数据为空白板吸光度，放入37℃培养箱中培养48h后再进行测定，记录数据为培养48h后吸光度，计算mic值；
s05，mic的计算：以培养48h后各孔吸光度减去对应空白板各孔吸光度得差值，将阴性对照组的平均差值计为100％的生长率，其值的1/2计为50％的抑制率，实验组中平均差值最接近50％抑制率的对应浓度计为该药液的mic值。
7.根据权利要求5或6所述的一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，其特征在于，供试菌菌种包括真菌。
8.根据权利要求7所述的一种紫毛野牡丹提取物的抑菌操作方法，其特征在于，真菌包括白假丝酵母菌ca、热带假丝酵母菌ct、光滑假丝酵母菌cg、克柔假丝酵母菌ck和近平滑假丝酵母菌cp。
9.一种紫毛野牡丹提取物在抗真菌中的应用。
10.一种紫毛野牡丹提取物在抗白假丝酵母菌ca、热带假丝酵母菌ct、光滑假丝酵母菌cg、克柔假丝酵母菌ck和近平滑假丝酵母菌cp中的应用。
技术总结