技术领域：
本发明涉及一种天然产物分离纯化的方法，具体涉及一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法。
背景技术：
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黑穗醋栗(ribesnigruml.)，又名黑加仑，为虎耳草目茶藨子科多年生小型落叶灌木。黑穗醋栗营养丰富，具有极高的食用及药用价值，可以直接食用或加工成果酱、果酒和果汁等。多糖是黑穗醋栗果实中重要的活性成分，因其具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖等生物活性而备受关注。此外，黑穗醋栗果实富含大量多酚类物质(包括类黄酮，花青素，酚酸等)，具有明显的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等生物活性。因此，若能建立一种同时制备这两种活性成分的方法，无疑会为黑穗醋栗精深开发利用带来广阔前景。
在过去的十几年中，水/有机溶剂浸提法、酶法、加压水法、微波辅助浸提法、超声辅助浸提法、超声辅助复合酶法等已经用于黑穗醋栗多糖和多酚的提取，但未见多糖和多酚两种成分一步同时制备的方法报道。微波是300mhz～300ghz频带中的电磁波。微波加热是由溶解离子的离子传导和极性溶剂的偶极旋转引起的分子摩擦产生的。这种快速的内部加热不仅导致更有效和选择性的加热，而且还加速了目标化合物从材料向周围环境的迁移。因此，与其他方法相比，微波辅助提取(mae)具有更高的效率和选择性，更短的时间，更少的溶剂以及更低的能耗等优点。二十世纪六十年代中期，albertson首先将双水相萃取(atpe)用于生物分子的初步分离。atpe具有双相萃取能力和选择性，使得目标成分可以分别被提取到上相和下相。近年来，由于atpe的高收率，相形成组分的高回收率、相对于纯有机溶剂对环境更友好的特性，atpe已从分离逐渐扩展到活性成分提取和纯化。微波辅助双水相萃取(ma-atpe)是mae和atpe的组合，在一个步骤中将场强效应和两相分离结合在一起，可以同时萃取和纯化活性成分并去除杂质。ma-atpe利用了微波的高能作用和双水两相系统(atps)的分离作用。由于包含大量水，atps可以强烈吸收微波能量并产生巨大的热效应，这种热效应能够导致温度迅速升高，提高溶剂向基质中的渗透，并有利于组分释放到周围的溶剂中。综上所述，本发明充分利用组成双水相的两种不同溶剂对不同极性活性物质的选择性，将微波优势与双水相提取方法相结合，利用微波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系一步直接从黑穗醋栗干粉中提取分离多酚和多糖。本方法条件温和，成本低，工艺操作简单，不引起黑穗醋栗多酚和多糖的失活或变性，易于工业化生产使用。
目前，关于利用微波辅助双水相体系同时提取黑穗醋栗果实多糖和多酚的专利未见报道。中国专利cn110327385a以青钱柳叶片为原料，采用ma-atpe提取青钱柳三萜类化合物。然而，该发明只提取分离得到一类活性物质，且未对提取条件进行优化，不能充分发挥ma-atpe提取分离不同活性成分的优势。此外，中国专利cn101961427a和cn104829740a分别公开了采用双水相体系从油茶蒲和草叶马尾藻中分离多糖及多酚的方法。但是，这两个专利存在不足：(1)提取工艺均先以水作溶剂对原料进行3-4次的提取，然后利用双水相对原料粗提液进行分离，进而得到多酚和多糖，该方法费时，操作步骤繁琐，原料中不同极性活性成分提取不完全，造成资源的浪费；而本发明是利用ma-atpe一步直接从原料中提取分离多酚和多糖，将mae与atpe优势相结合，提取更完全，操作更简单。(2)双水相分离操作只是在恒温振荡器中进行，且用时较长；而本发明是利用ma-atpe一步提取和分离，微波快速加热促使多酚与多糖在两相中的快速分离，具有更高的分离效率和更好的分离效果。因此，本发明建立了一种高效、绿色、节能的一步同时提取分离黑穗醋栗果实多糖和多酚的方法，具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中的不足，高效地一步同时制备黑穗醋栗果实多酚和多糖的方法，实现黑穗醋栗生物资源的综合利用。
本发明的目的是这样实现的：
一种一步同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，以黑穗醋栗果实干粉为原料，包括以下步骤：①将黑穗醋栗干粉按一定液料比加入到所制备的乙醇-硫酸铵双水相体系中，在优化的微波条件下进行提取；②把步骤①中的提取液离心分离，分别收集上相及下相提取液；③把步骤②所得上相提取液利用乙醇洗涤除去硫酸铵，浓缩、冻干后得到上相粗提物；④把步骤②所得下相提取液在室温下透析，浓缩，醇沉、离心、冻干后得到下相多糖；⑤将步骤③所得上相粗提物通过ab-8大孔树脂柱分离，分别得到多酚和上相多糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明中的微波辅助双水相提取技术，结合微波及双水相优势，能够一步提取并分离黑穗醋栗果实多酚及多糖，简化了操作步骤，加速目标物质的提取，具有时间短、操作方便、提取效率高等优势。
2.本发明采用最常见的乙醇-硫酸铵双水相体系，制备简单，溶剂低毒，环保，且易于连续操作以及工艺放大，具有用于工业化提取及分离黑穗醋栗果实中功能性天然产物的潜力。
3.本发明优化的提取条件能够有效使黑穗醋栗多酚及多糖从细胞中溶出，同时获得最大收率。
4.本技术得到的三种活性成分，资源利用价值高，可用于黑穗醋栗多糖和多酚药品、保健品和食品的开发。
附图说明
图1标准品(a)和黑穗醋栗多酚提取物(b)在正离子模式下的基峰色谱图(1：芦丁；2：矢车菊素-3-o-葡萄糖苷；3：山奈酚-3-o-芸香糖苷；4：金丝桃苷)
图2单糖标准品(a)、上相多糖(b)、下相多糖(c)的气相色谱图(galua：半乳糖醛酸；rha：鼠李糖；ara：阿拉伯糖；xyl：木糖；man：甘露糖；glc：葡萄糖；gal：半乳糖；inositol：内标肌醇)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细描述，以便于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限于此。
黑穗醋栗果实多酚及多糖最佳提取条件的确定：
单因素试验：
液料比的选择：
称取黑穗醋栗干粉，分别按不同液料比加入到由28.98～32.13％乙醇及13.57～22.04％硫酸铵组成的双水相体系中，在功率为500w，温度为60℃下，微波辐射14min后得到提取液，计算上下相提取液中的多酚及多糖提取率，确定液料比在50:1～70:1范围内。
微波温度的选择：
称取黑穗醋栗干粉，按液料比为50:1～70:1加入到由28.98～32.13％乙醇及13.57～22.04％硫酸铵组成的双水相体系中，在功率为500w，不同温度下微波辐射14min后得到提取液，计算上下相提取液中的多酚及多糖提取率，确定微波温度在60～70℃范围内。
微波时间的选择：
称取黑穗醋栗干粉，按液料比为50:1～70:1加入到由28.98～32.13％乙醇及13.57～22.04％硫酸铵组成的双水相体系中，在功率为500w，温度为60～70℃的条件下，微波辐射不同时间后得到提取液，计算上下相提取液中的多酚及多糖提取率，确定微波时间在8～12min范围内。
微波功率的选择：
称取黑穗醋栗干粉，按液料比为50:1～70:1加入到由28.98～32.13％乙醇及13.57～22.04％硫酸铵组成的双水相体系中，在温度为60～70℃，不同功率下微波辐射8～12min后得到提取液，计算上下相提取液中的多酚及多糖提取率，确定微波功率在500～700w范围内。
响应面优化实验：
以多酚(y1)及下相多糖(y2)提取率平均值为考查指标(设3个重复)，按照单因素试验结果，选择x1液料比(50:1～70:1)，x2时间(8～12min)，x3温度(60～70℃)，x4功率(500～700w)这四个因素进行四因素三水平响应面优化试验。
表1模型1(多酚得率，y1)方差分析结果
如表1所示，y1模型方差分析显示实验结果显著(p＜0.01)拟合响应面模型(f＝31.89)，失拟项不显著且变异系数c.v.为2.42％，表明模型能准确预测实验结果。r2为0.9696，表明该模型与实验数据有96.96％的符合度，该方程模型具有高可信度。自变量一次项中x1极显著，说明料液比对多酚得率的影响最大。平方项(x2)均在p＜0.01水平上显著；比较f值可知因素对多酚得率的影响高低顺序为：料液比＞温度＞时间＞功率。
表2模型2(下相多糖得率，y2)方差分析结果
如表2所示，y2模型方差分析显示实验结果显著(p＜0.01)拟合响应面模型(f＝69.59)，失拟项不显著且变异系数c.v.为2.34％，表明模型能准确预测实验结果。r2为0.9858，表明该模型与实验数据有98.58％的符合度，该方程模型具有高可信度。自变量一次项中x2极显著，说明时间对下相多糖得率的影响最大。平方项(x2)均在p＜0.01水平上显著；比较f值可知因素对下相多糖得率的影响高低顺序为：时间＞料液比＞温度＞功率。
综合分析分别以上相多酚得率，下相多糖得率为响应值的二响应面拟合模型，预测出提取最佳工艺条件为：液料比50:1～60:1(ml/g)，提取时间8～10min，温度60～65℃，功率500～600w。
实施例1
一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，步骤如下：
(1)将黑穗醋栗干粉按液料比50:1加入到由30.47％乙醇和18.02％硫酸铵组成的双水相体系中，在提取温度为60℃、提取功率为600w条件下处理8min。离心分离收集上相及下相提取液，并分别量取体积。
(2)取上相提取液，用乙醇洗涤除去硫酸铵，浓缩、冷冻干燥得到上相粗提物。
(3)取下相提取液在室温下进行48h透析处理，除去无机盐及其他小分子杂质，透析液浓缩，冷冻干燥，得到下相粗提物。
(4)将上相粗提物溶解，上样ab-8大孔树脂柱，多酚被大孔树脂吸附于柱内，用酸化水洗脱未被吸附的多糖，洗脱流速为1ml/min，收集洗脱液，浓缩，醇沉、冷冻干燥得到上相多糖。
(5)将大孔树脂内被吸附的多酚用75％含水乙醇洗脱，洗脱流速为0.8ml/min，浓缩，冷冻干燥得到多酚。
(6)将下相粗提物溶解，醇沉，离心收集底部沉淀物，冷冻干燥得到下相多糖。
经测定，多酚提取率为46.65mg/g，下相多糖提取率为35.29％。
本方法多糖、多酚提取率测定步骤如下：
采用苯酚-硫酸法测定多糖，分别向试管中添加浓度为0.02～0.10mg/ml的葡萄糖标准溶液1.0ml，之后加入去离子水和苯酚溶液(5％，w/v)各1.0ml，充分振荡，再加入浓硫酸5.0ml，混匀。待反应体系降至常温，测定样液在490nm下的吸光度，空白对照以去离子水代替葡萄糖溶液。分别以葡萄糖溶液浓度和对应吸光度为横纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。黑穗醋栗下相多糖提取率测定：取多糖提取液稀释至适当浓度，与上述步骤相同测定吸光度。根据之前的标准曲线，算出待测液多糖浓度，根据公式(1)，得出提取率。
式中：m为黑穗醋栗干粉的质量，g；
c为由标准曲线计算所得黑穗醋栗提取液多糖的浓度，mg/ml；
v为待测溶液体积，ml；
d为稀释倍数。
使用folin–ciocalteu方法测定多酚提取率，将0.5ml，0.1～1.0mg/ml没食子酸标准样品溶液分别与1.0mlfolin–ciocalteu试剂和3.0mlna2co3(20％，w/v)混合，然后用去离子水稀释至25.0ml。混合溶液在50℃下加热5min，并在室温下保持30min。于765nm下测量混合物的吸光度。空白对照以去离子水代替葡萄糖溶液，分别以没食子酸溶液浓度和对应吸光度为横纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。根据标准曲线，算出待测液多酚浓度，根据公式(2)，得出提取率。多酚提取率表示为没食子酸当量(mg)/黑加仑粉重(g)。
式中：m为黑穗醋栗干粉的质量，g；
c为由标准曲线计算所得黑穗醋栗提取液多酚的浓度，mg/ml；
v为待测溶液体积，ml；
d为稀释倍数。
实施例2
一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，步骤如下：
(1)将黑穗醋栗干粉按液料比50:1加入到由30.47％乙醇和18.02％硫酸铵组成的双水相体系中，在提取温度为60℃、提取功率为500w条件下处理10min。离心分离收集上相及下相提取液，并分别量取体积。
(2)取上相提取液，用乙醇洗涤除去硫酸铵，浓缩、冷冻干燥得到上相粗提物。
(3)取下相提取液在室温下进行透析处理48h，除去无机盐及其他小分子杂质，透析液浓缩，冷冻干燥，得到下相粗提物。
(4)将上相粗提物溶解，上样ab-8大孔树脂柱，多酚被大孔树脂吸附于柱内，用酸化水洗脱未被吸附的多糖，洗脱流速为1.0ml/min，收集洗脱液，浓缩，醇沉、冷冻干燥得到上相多糖。
(5)将大孔树脂内被吸附的多酚用75％乙醇洗脱，洗脱流速为0.8ml/min，浓缩，冷冻干燥得到多酚。
(6)将下相粗提物溶解，醇沉，离心收集底部沉淀物，冷冻干燥得到下相多糖。
按照实施例1的方法测定多酚、多糖提取率。经测定，多酚提取率为43.29mg/g，下相多糖提取率为33.75％。
实施例3
一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，步骤如下：
(1)将黑穗醋栗干粉按液料比60:1加入到由30.47％乙醇和18.02％硫酸铵组成的双水相体系中，在提取温度为65℃、提取功率为600w条件下处理8min。离心分离收集上相及下相提取液，并分别量取体积。
(2)取上相提取液，用乙醇洗涤除去硫酸铵，浓缩、冷冻干燥得到上相粗提物。
(3)取下相提取液在室温下进行透析处理48h，除去无机盐及其他小分子杂质，透析液浓缩，冷冻干燥，得到下相粗提物。
(4)将上相粗提物溶解，上样ab-8大孔树脂柱，多酚被大孔树脂吸附于柱内，用酸化水洗脱未被吸附的多糖，洗脱流速为1.0ml/min，收集洗脱液，浓缩，醇沉、冷冻干燥得到上相多糖。
(5)将大孔树脂内被吸附的多酚用75％乙醇洗脱，洗脱流速为0.8ml/min，浓缩，冷冻干燥得到多酚。
(6)将下相粗提物溶解，醇沉，离心收集底部沉淀物，冷冻干燥得到下相多糖。
按照实施例1的方法测定多酚、多糖提取率。经测定，多酚提取率为46.93mg/g，下相多糖提取率为37.85％。
对比例1溶剂提取法从黑穗醋栗中提取多糖及多酚
将1.0g黑穗醋栗干粉添加到60.0ml蒸馏水中，剧烈摇晃，在100℃热下回流3h。冷却后，测定多糖提取率。将6.0g黑穗醋栗干粉添加到60.0ml，80％乙醇中，剧烈摇晃，在35℃提取2h，测定多酚提取率。
按照实施例1的方法测定多酚、多糖提取率。经测定，多酚提取率为26.32mg/g，多糖提取率为23.75％。
对比例2微波辅助提取法从黑穗醋栗中提取多糖及多酚
将1.0g黑穗醋栗干粉添加到60.0ml蒸馏水中，放入微波消解罐，在温度为65℃，功率为600w条件下微波处理10min。冷却后，测定多糖提取率。将6.0g黑穗醋栗干粉添加到60.0ml，80％乙醇中，放入微波消解罐，在温度为65℃，功率为600w条件下微波处理10min。冷却后，测定多酚提取率。
按照实施例1的方法测定多酚、多糖提取率。经测定，多酚提取率为40.19mg/g，多糖提取率为27.84％。
双水相同时制备黑穗醋栗多酚及两种多糖的组分分析
使用液相质谱联用法确定所得的多酚主要成分，结果如附图1，表3所示。黑穗醋栗多酚的主要组分包括芦丁、矢车菊素-3-o-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-芸香糖苷及金丝桃苷。
表3黑穗醋栗多酚提取物的保留时间，质谱数据
使用气相色谱法测定上、下相制备得到的黑穗醋栗多糖的单糖组成，结果如附图2，表4、5所示。结果表明：本专利制备的上下相多糖均由相同种类的单糖组成，但是各种单糖所占的比例不同。上相多糖的单糖摩尔比为：半乳糖醛酸：鼠李糖：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝0.12：0.72：0.39：0.48：1.00：0.33，而下相多糖中各单糖摩尔比为0.11：2.70：0.86：0.46：1.00：0.68。葡萄糖是组成上相多糖的主要单糖，而鼠李糖是组成下相多糖的主要单糖。
表4标准品及两种多糖中单糖的气相色谱出峰时间
表5两种多糖中单糖的物质的量比
本发明中黑穗醋栗多酚组成分析通过液相质谱联用法(hplc-ms/esi)测定，具体条件如下：
色谱检测条件：型号为acquityuplcbehc18的色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温40℃；进样量为5μl；流速0.4ml/min；检测时间30min，流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为纯乙腈；洗脱程序为0-3min，5％-15％b；3-3.5min，15％b；3.5-6min，15％-30％b；6-6.5min，30％b；6.5-12min，30％-70％b；12-12.5min，70％b；12.5-18min，70％-100％b；18-25min，100％b；25-25.5min，100％-5％b；25.5-29min，5％b。
质谱检测条件：质谱仪(
本发明中黑穗醋栗单糖组成分析通过气相色谱法测定，具体方法如下：
(1)酸水解
精确称量50.0mg上下相多糖于锥形瓶中，加入8.00ml三氟乙酸溶液(5mol/l)，振荡10min，在120℃下水解6h，加入色谱级甲醇，用氮吹仪吹干，重复3-4次。
(2)乙酰化
分别称量8种单糖标准品25mg置于气相小瓶，逐次加入10.0mg盐酸羟胺、4.0mg内标肌醇和1.00ml吡啶，振摇2min后在100℃水浴锅中反应30min，反应期间持续摇晃。冷却后加入1.0ml醋酸酐进行乙酰化，于水浴锅中反应30min，冷却，制得糖腈乙酸酯衍生物。将产物用甲醇溶解后过0.22μm的微孔滤膜，进样分析。按照相同的方法对酸水解多糖样品进行乙酰化。
gc色谱条件：rtx-1701石英毛细管色谱柱(0.25μm×30.0m)；检测器：氢火焰离子化检测器(fid)；程序升温：190～220℃(5℃/min，5min)，220～260℃(10℃/min，20min)；检测器温度：250℃；汽化温度：280℃；载气：高纯n2。
1.一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于：
①将黑穗醋栗冻干粉按一定液料比加入到已制备好的乙醇-硫酸铵双水相体系中，在最佳微波条件下进行提取；②将所得提取液离心分离，分别得到上、下相提取液；③把步骤②中离心分离所得上相提取液经无水乙醇洗涤去盐后，减压浓缩，真空冷冻干燥得到上相粗提物；④把步骤②中离心分离所得下相提取液在室温下进行透析，除去无机盐等杂质，然后将透析液减压浓缩，真空冷冻干燥得到下相粗提物；⑤将步骤③所得上相粗提物溶解后上样ab-8大孔树脂柱，使用酸性水溶液洗脱树脂直至检测不到多糖，将洗脱液浓缩，醇沉，冷冻干燥得到上相多糖，而多酚吸附于大孔树脂中；⑥利用酸性乙醇水溶液洗脱步骤⑤中ab-8大孔树脂柱吸附的多酚，洗脱液经浓缩、冷冻干燥得到上相多酚；⑦将步骤④所得下相粗提物溶解于去离子水，醇沉后，离心收集底部沉淀物，冷冻干燥得到下相多糖。
2.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤①中乙醇-硫酸铵双水相体系组成为：乙醇28.98％～32.13％，硫酸铵13.57％～22.04％。
3.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤①中硫酸铵-乙醇双水相体系与黑穗醋栗冻干粉的液料比为50:1～60:1。
4.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤①中最佳微波提取条件为：微波温度60～65℃、微波功率500～600w，提取时间8～10min。
5.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤②中离心分离转速为4000～6000r/min，离心时间为3～8min。
6.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤③中减压浓缩的温度为40～60℃，真空冷冻干燥的温度为-75～-85℃，压力为0.1～0.3mpa。
7.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤④中透析袋截留分子量为3000～4000da，透析时间为36～72h。
8.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤⑤中样品在ab-8大孔树脂柱中上样量为15～25ml，上样液浓度为18～20mg/ml，ph1.0～3.0。
9.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤中⑤中从ab-8大孔树脂柱中洗脱多糖的洗脱剂为含0.05％～0.15％hcl的酸性水溶液，洗脱流速为0.5～1.5ml/min。
10.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤中⑤中醇沉多糖的无水乙醇的用量为多糖浓缩液体积的3～5倍，醇沉时间12～36h。
11.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤⑥中从ab-8大孔树脂柱中洗脱多酚的洗脱剂为质量分数70％～80％的乙醇水溶液，ph1.0～3.0，洗脱流速为0.5～1.0ml/min。
12.根据权利要求1所述的一种同时制备黑穗醋栗多酚及多糖的方法，其特征在于所述步骤中⑦离心分离转速为3000～5000r/min，离心时间为10～30min。
技术总结