本发明涉及生物碱类化合物的分离纯化，特别涉及一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法。
背景技术：
延胡索（rhizomacorydalis）为罂粟科紫堇属植物延胡索（corydalisyanhusuow.t.wang）的干燥块茎。又名延胡、元胡、玄胡和玄胡索。具有活血散瘀、行气止痛的功效，是中医药学中应用历史十分悠久的止痛药。其主产地为浙江东阳，是著名的“浙八味”之一。味辛、苦、温，归肝、脾经，临床上主要用于胸肋、脘腹、产后瘀阻、痛经等各种疼痛和心血管疾病。在传统中医药中，延胡索多配伍应用，《中国药典》2005版中，接近30%的复方制剂中使用了延胡索。现代研究表明延胡索具有显著的镇痛、镇静和催眠作用，对冠心病、心律失常和胃溃疡等多种疾病有较好的临床效果（贺凯,高建莉,赵光树.延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展,中草药,2007,38(12):1909-1911）。鉴于延胡索疗效显著，临床应用广泛，近年来对延胡索的化学成分及药理作用的研究报道逐年增加。
现代药物化学和药理学研究表明，延胡索中的主要活性成分为叔胺和季铵型两类生物碱，其中叔胺碱含量约为0.65%，季铵碱含量约为0.3%。至今已从正品及其他种延胡索中共分离到40余种生物碱。这些生物碱，均为异喹啉类的生物碱，根据骨架类型分属于小檗碱类、原小檗碱类、阿朴菲类和原阿片碱类等。
在延胡索生物碱的发现中，传统的常压柱层析，包括硅胶和氧化铝等方法发挥了重要的作用，目前也仍有较为广泛的应用（张晓丽,曲扬,侯家鸣,等.延胡索的化学成分.沈阳药科大学学报,2008,25(7):534-540；t.t.hu,x.zhang,s.z.ma,etal.anewprotoberberinealkaloidfromcorydalisyanhusuow.t.wang.chinesechemicalletters,2009,20(8):955-957.）。这些方法虽然简单低廉，但也有步骤繁琐、分离效率低、重复性差等缺点。特别是延胡索中生物碱的离子性普遍较强，在硅胶柱上容易死吸附，多次分离过程中，样品的损失较大。虽然目前已知的延胡索生物碱数量已经超过40种，但都是“零敲碎打式”的获得，每个研究者独立得到的数目往往有限，使得对延胡索活性作用的物质基础研究不够系统、全面。因此，在延胡索生物碱分离中引入或发展更为高效的分离纯化方法仍是一个较为活跃的课题。
于是，高速逆流色谱法（hsccc）被应用于延胡索中生物碱的分离纯化（俞雁,金艳,徐超,等.应用高速逆流色谱技术从延胡索中分离制备延胡索乙素.世界科学技术:中医药现代化,2006,8(2):17-19；z.l.liu,y.yu,p.n.shen,etal.separationandpurificationofdl-tetrahydropalmatinefromcorydalisyanhusuobyhigh-speedcounter-currentchromatography[j].separationandpurificationtechnology,2008,58(3):343-346；q.yu,s.q.tong,j.z.yan,etal.preparativeseparationofquaternaryammoniumalkaloidsfromcorydalisyanhusuow.t.wangbyph-zone-refiningcounter-currentchromatography[j].journalofseparationscience,2011,34(3):278-285；吴三桥,冯自立,李新生,等.高速逆流色谱法分离纯化延胡索乙素和原阿片碱[j].中国生化药物杂志,2009,30(2):89-92）。从报道中的结果看，hsccc经过条件优化能够实现对延胡索中目标生物碱的高效分离，相比传统方法能大大提高样品回收率，有利于相关产品的工业化生产。但该方法也存在着分离效率低，分离度差，分离时间长和条件优化复杂等问题，通常一次只能得到几个常量化合物的，对微量和结构相近化合物的分离能力还有待于提高。
高效液相色谱法（hplc）已广泛用于延胡索及相关方剂和中药制剂中延胡索乙素和巴马汀等指标成分的成分分析和含量检测（韩建伟,张莉,高小春.hplc法测定复方元胡止痛膏贴中延胡索乙素含量.中国药师,2009,5:621-623；魏惠珍,谢菲,饶毅,等.hplc法测定元胡止痛胶囊中延胡索乙素及其不确定度评定.中草药,2012,43(002):299-302），并成为这些药物质量控制的标准方法。相比于前述分离方法，小颗粒均匀分离材料基础上发展起来的高效液相色谱方法具有更高的分离能力，因而能得到更多的化合物信息（b.ding,t.t.zhou,g.r.fan,etal.qualitativeandquantitativedeterminationoftenalkaloidsintraditionalchinesemedicinecorydalisyanhusuowtwangbylc-ms/msandlc-dad[j].journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis,2007,45(2):219-226；j.zhang,y.jin,j.dong,etal.systematicscreeningandcharacterizationoftertiaryandquaternaryalkaloidsfromcorydalisyanhusuow.t.wangusingultra-performanceliquidchromatography–quadrupole-time-of-flightmassspectrometry[j].talanta,2009,78(2):513-522）。这些方法均表明了高效液相色谱方法在分离能力和在线表征方面的优势，但由于碱性化合物在常规c18上的拖尾问题，延胡索生物碱在反相色谱柱上的上样量比较有限，因此采用液相制备的报道较少（石俊敏,韩伟立,叶文才,等.延胡索的化学成分研究.天然产物研究与开发,2011,23(4):647-651；守安正恭.以hplc简便分离纯化延胡索生物碱.国外医学中医中药分册,1999,21(6):24；j.zhang,y.jin,y.liu,etal.purificationofalkaloidsfromcorydalisyanhusuowtwangusingpreparative2-dhplc.journalofseparationscience,2009,32(9):1401-1406）。因此，延胡索生物碱的高效液相色谱制备十分需要发展新型的分离材料来解决色谱峰形问题、增加载样量和提高分离选择性，才能使该方法在实际应用中有足够的价值。
有鉴于此，提出本发明。
技术实现要素：
本发明为获得延胡索药理研究所需的生物碱单体，而提供了一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法。
本发明一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，具体步骤为：
（1）延胡索甲醇提取物经一根c18wcx反相/弱阳离子交换混合模式色谱柱分段后获得3个组分，分别为延胡索微量生物碱组分、常量叔胺碱组分和季铵碱组分。
（2）采用制备液相色谱从这3个生物碱组分中高效分离纯化生物碱单体：将延胡索微量生物碱组分通过二维反相/反相色谱模式进行分离纯化；将延胡索常量叔胺碱组分通过反相色谱模式进行分离纯化；将延胡索季铵碱组分通过离子交换色谱模式进行分离纯化。
进一步地，所述二维反相/反相色谱分离模式中，第一维反相色谱柱为极性修饰碳十八柱（xchargec18），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与含甲酸或乙酸的水混合，洗脱方式为线性梯度；第二维反相色谱柱为普通碳十八柱（xunionc18、unitaryc18、xterramsc18或sunfirec18），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与酸水（含乙酸或磷酸中的一种，用三乙胺调节ph至5.5-6.0）混合，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。
进一步地，所述反相色谱分离模式中，反相色谱柱为普通碳十八柱（xunionc18、unitaryc18、xterramsc18或sunfirec18），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与酸水（含乙酸或磷酸中的一种，用三乙胺调节ph至5.5-6.0）混合，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。
进一步地，所述离子交换分离模式中，离子交换柱为硅胶基质的强阳离子交换柱（xchargescx），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与缓冲盐（含磷酸盐、离液盐，用磷酸调节ph至3.0）混合，采用等度洗脱方式。
进一步地，所述色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-1000mm；样品浓度为1mg/ml-1g/ml；进样量为10μl-400ml；流速为0.5-480ml/min；柱温为25℃-45℃。
本发明的方法可以实现生物碱的目标制备，可获取批量的已知活性生物碱，同时富集分离微量生物碱，从而不断丰富生物碱库，为生物碱类化合物的活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。
附图说明
图1微量生物碱组分21-45在unitaryc18柱(150mm×4.6mm,5μm)上的再分析谱图;流动相：（a）0.1%磷酸（用三乙胺调ph至6.0），（b）乙腈；洗脱梯度：0-5min,10%b;5-10min,10-15%b;10-35min,15-25%b;35-40min,25-55%b;40-50min,55%b；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；
图2微量生物碱组分34,36和40的色谱图；（a）组分34；（b）组分36；（c）组分40。色谱柱：unitaryc18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流动相：（a）0.1%磷酸（用三乙胺调ph至6.0），（b）乙腈；洗脱梯度：0-5min,10%b;5-10min,10-15%b;10-35min,15-25%b;35-40min,25-55%b;40-50min,55%b；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：203nm
图3叔胺碱类组分（组分iii）的制备谱图；
图4不同上样体积下季铵碱类组分（组分iv）的色谱图；（a）10μl；（b）50μl；（c）100μl。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。实施例中所用的色谱分离柱均购自浙江华谱新创科技有限公司。
实施例1：
延胡索甲醇提取物经制备型高效液相色谱（hplc）分离，色谱条件：色谱柱为反相/弱阳离子交换混合模式（c18wcx）柱；水（a）和乙醇（b）流动相体系；洗脱梯度为0-12min,体积浓度0%b;12-18min,样品液；18-30min,体积浓度0%b;30-36min,体积浓度30%b;36-44min,50%b；44-52min,100%b；52-64min,50%b-1%醋酸；流速为375ml/min；样品溶液浓度为10mg/ml，其采用体积浓度2.5%甲醇-97.5%水溶解；进样体积为2.25l；30-36min收集为一份（延胡索微量生物碱组分，组分i）；36-44min收集为一份（组分ii）；44-52min收集为一份（延胡索常量叔胺碱组分，组分iii）；52-64min收集为一份（延胡索季铵碱组分，组分iv）共计4个组分，每个组分浓缩至干后备用。
实施例2：
选取组分i采用二维反相/反相色谱分离模式进行二维制备型高效液相色谱（hplc）分离。第一维制备色谱条件：色谱柱为极性修饰碳十八柱（xchargec18）；0.1%甲酸水（a）和乙腈（b）流动相体系；洗脱梯度为0-40min，2-20%b；40-55min，20%b；流速为300ml/min；检测波长为280nm；进样量为35ml。4-55分钟，每分钟收集一份，共计51个组分，每个组分浓缩至干后备用。为了更直观的反映此2-drplc/rplc体系的高正交性，将以xchargec18柱为第一维制备柱所得的高含量的组分21至45，在unitaryc18柱上进行再分析，结果如图3所示。图1中更多色谱峰的出现充分说明了该2-drplc/rplc体系的高正交性。第二维制备色谱条件：色谱柱为普通碳十八柱（unitaryc18）；0.1%磷酸（用三乙胺调ph为6.0）（a）和乙腈（b）流动相体系；洗脱梯度为0-20min，15-25%b；20-25min，25-55%b；25-30min，55%b；流速为20ml/min；进样量为2ml；检测波长为203nm。对组分34，36和40三个组分进行制备分离，收集10个色谱峰，分别回收溶剂，如图2所示。其中6个化合物经鉴定为n-甲基四氢非洲防己胺（n-methyltetrahydrocolumbamine,f34-1，四氢非洲防己胺（tetrahydrocolumbamine,f34-2），原阿片碱（protopine,f36-2），n-甲基四氢巴马汀（n-methyltetrahydropalmatine,f40-2），海罂粟碱（glaucine,f40-3）和四氢巴马汀（tetrahydropalmatine,f40-4）,其他4个峰量不够核磁鉴定。
化合物的具体结构数据如下：
f34-1：淡黄色粉末，正离子esi-ms给出分子离子峰m/z：356[m] ；1hnmr(600mhz,dmso-d6):δ7.16(d,j=8.4hz,1h,h-12),7.14(d,j=8.4hz,1h,h-11),6.91(s,1h,h-1),6.83(s,1h,h-4),3.85(s,3h,och3-9),3.81(s,3h,och3-3),3.78(s,3h,och3-10),2.82(s,3h,ch3-n);13cnmr(125mhz,dmso-d6)δ151.1(c-10),148.4(c-3),147.3(c-9),145.3(c-2),125.0(c-12),123.4(c-14a),122.3(c-12a),121.1(c-4a),120.4(c-8a),113.8(c-11),113.2(c-1),112.4(c-4),65.2(c-14),61.1(c-8),60.9(c-6),60.6(och3-9),56.4(och3-3),56.0(och3-10),38.9(ch3-n),28.2(c-13),23.2(c-5)。以上数据与文献报道的n-甲基四氢非洲防己胺（n-methyltetrahydrocolumbamine）一致。
f34-2：淡黄色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：342[m h] ；1hnmr(600mhz,dmso-d6):δ8.17(1h,s,-oh),6.89(1h,s,h-12),6.72(1h,s,h-11),6.89(1h,s,h-4)6.66(1h,s,h-1),4.11(1h,d,j=16.2hz,ha-8),3.78(3h,s,-och3),3.75(3h,s,-och3),3.74(3h,s,-och3).13cnmr(150mhz,dmso-d6):δ150.3(c-9),146.6(c-10),145.1(c-2),144.8(c-3),130.0(c-14a),128.4(c-12a),127.8(c-8a),125.0(c-4a),124.2(c-12),112.8(c-4),112.3(c-11),111.7(c-1),60.0,59.0(c-14,9-och3),56.2,56.0(2×och3),53.7(c-8),51.5(c-6),36.0(c-13),28.7(c-5)。以上数据与文献报道的四氢非洲防己胺（tetrahydrocolumbamine）一致。
f36-2：白色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：354[m h] ；1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ6.97(1h,s),6.82(1h,s),6.74(1h,d,j=7.8hz),6.70(1h,d,j=7.8hz),6.01(2h,s),5.98(2h,s),1.87(3h,s);13cnmr(125mhz,dmso-d6)δ147.7(c-3),146.1(c-2),145.7(c-9),145.7(c-10),136.1(c-4a),132.8(c-14a),129.8(c-12a),125.3(c-12),118.3(c-8a),110.7(c-4),107.7(c-1),106.7(c-11),101.5(o-ch2-o),101.1(o-ch2-o),57.6(c-6),51.2(c-8),46.1(c-13),41.5(n-ch3),30.6(c-5)。以上数据与文献报道的原阿片碱（protopine）一致。
f40-2：淡黄色粉末，正离子esi-ms给出分子离子峰m/z：370[m] ；1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ7.19(d,j=8.4hz,1h,h-12),7.16(d,j=8.4hz,1h,h-11),7.02(s,1h,h-1),6.92(s,1h,h-4),3.86(s,3h,och3),3.83(s,3h,och3),3.82(s,3h,och3),3.80(s,3h,och3),2.84(s,3h,ch3-n).13cnmr(125mhz,dmso-d6)δ151.2(c-10),149.3(c-3),148.7(c-2),145.3(c-9),124.8(c-12),123.4(c-14a),123.1(c-12a),122.2(c-4a),121.1(c-8a),113.8(c-11),112.2(c-1),109.8(c-4),65.3(c-14),61.0(c-8),60.9(c-6),60.6(och3-9),56.4(och3-2),56.4(och3-3),56.0(och3-10),39.0(ch3-n),28.0(c-13),23.2(c-5)。以上数据与文献报道的n-甲基四氢巴马汀（n-methyltetrahydropalmatine）一致。
f40-3：棕绿色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：356[m h] ；1hnmr(600mhz,dmso-d6):δ7.89(1h,s,11-h),6.95(1h,s,8-h),6.72(1h,s,3-h),3.81(6h,s,2×och3),3.78(3h,s,och3),3.60(3h,s,och3)。13cnmr(150mhz,dmso-d6):δ152.0(c-2),148.4(c-9),147.5(c-10),144.2(c-1),129.9(c-7a),129.3(c-13a),127.4(c-3b),126.4(c-11b),124.2(c-11a),112.2(c-11),112.1(c-8),111.4(c-3),62.6(c-6a),60.0(och3),56.1(och3),56.0(och3),55.8(och3),53.1(c-5),44.1(nch3),34.3(c-7),29.2(c-4)。以上数据与文献报道的海罂粟碱（glaucine）一致。
f40-4：淡黄色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：356[m h] ；1hnmr(600mhz,cdcl3):δ[6.88(1h,d,j=8.4hz,h-12),6.80(1h,d,j=8.4hz,h-11),6.73(1h,s,h-4),6.62(1h,s,h-1),4.32(1h,d,j=15.6hz,ha-8),[3.89(3h,s,och3),3.87(3h,s,och3),3.86(3h,s,och3),3.85(3h,s,och3),3.62(1h,d,j=15.6hz,hb-8),2.90(1h,m,h-5b),2.72(2h,m,h-13).13cnmr(150mhz,cdcl3):δ150.4(c-10),147.7(c-3),147.5(c-2),145.5(c-9),128.9(c-12a,c-14a),127.2(c-8a),126.4(c-4a),123.8(c-12),111.3(c-4),111.1(c-11),108.5(c-1),101.3(2,3-och2o-),60.2(c-14),59.1(9-oh3),56.1,55.8,55.8(2,3,10-ch3),53.5(c-8),51.1(c-6),35.7(c-13),28.6(c-5)。以上数据与文献报道的延胡索乙素（tetrahydropalmatine）一致。
实施例3：
选取组分iii采用反相模式进行制备型高效液相色谱（hplc）分离，色谱条件：色谱柱为普通碳十八柱（xunionc18）；0.1%磷酸（用三乙胺调ph为6.0）（a）和乙腈（b）流动相体系；洗脱梯度为0-30min，30-60%b；流速为20ml/min；进样量为2ml；检测波长为203nm。制备谱图如图3所示。收集6个色谱峰，分别回收溶剂，其中p2和p4量不够核磁鉴定，其他4个化合物结构数据如下：
p1：棕绿色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：356[m h] ；1hnmr(600mhz,cdcl3):δ8.06(1h,s,11-h),6.77(1h,s,8-h),6.61(1h,s,3-h),3.91(3h,s,och3),3.88(6h,s,2×och3),3.64(3h,s,och3).13cnmr(150mhz,cdcl3):δ153.2(c-2),148.5(c-9),148.0(c-10),145.1(c-1),127.3(c-7a),126.7(c-13a),126.3(c-3b),123.7(c-11b),121.7(c-11a),111.6(c-11),110.8(c-8),110.2(c-3),61.4(c-6a),60.3(och3),55.9(och3),55.9(och3),55.8(och3),51.8(c-5),40.2(nch3),32.0(c-7),25.7(c-4)。以上数据与文献报道的海罂粟碱（glaucine）一致。
p3：淡黄色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：356[m h] ；1hnmr(600mhz,cdcl3):δ[6.88(1h,d,j=8.4hz,h-12),6.80(1h,d,j=8.4hz,h-11),6.73(1h,s,h-4),6.62(1h,s,h-1),4.32(1h,d,j=15.6hz,ha-8),[3.89(3h,s,och3),3.87(3h,s,och3),3.86(3h,s,och3),3.85(3h,s,och3),3.62(1h,d,j=15.6hz,hb-8),2.90(1h,m,h-5b),2.72(2h,m,h-13).13cnmr(150mhz,cdcl3):δ150.4(c-10),147.7(c-3),147.5(c-2),145.5(c-9),128.9(c-12a,c-14a),127.2(c-8a),126.4(c-4a),123.8(c-12),111.3(c-4),111.1(c-11),108.5(c-1),101.3(2,3-och2o-),60.2(c-14),59.1(9-oh3),56.1,55.8,55.8(2,3,10-ch3),53.5(c-8),51.1(c-6),35.7(c-13),28.6(c-5)。以上数据与文献报道的延胡索乙素（tetrahydropalmatine）一致。
p5：白色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：340[m h] ；1hnmr(600mhz,cdcl3):δ[6.89(1h,d,j=8.4hz,h-12),6.86(1h,d,j=8.4hz,h-11),6.68(1h,s,h-4),6.62(1h,s,h-1),5.95(2h,s,-o-ch2-o-),4.53(1h,d,j=15.6hz,ha-8),3.88(3h,s,och3),3.85(3h,s,och3),4.01(1h,d,j=15.6hz,hb-8),3.13(3h,m,h-5a,hb-8,h-14).13cnmr(150mhz,cdcl3):δ150.8(c-10),147.3(c-2),147.0(c-3),145.2(c-9),123.9(c-12),112.4(c-11),108.7(c-4),105.3(c-1),60.4(c-14),55.9(-och3),29.7(c-5)。以上数据与文献报道的四氢小檗碱（canadine）一致。
p6：淡黄色粉末，正离子esi-ms给出准分子离子峰m/z：370[m h] ；1hnmr(600mhz,cdcl3):δ6.90(1h,d,j=8.4hz,h-12),6.82(1h,d,j=8.4hz,h-11),6.68(1h,s,h-1),6.61(1h,s,h-4),4.20(1h,d,j=15.6hz,8-hb),3.88(6h,s,2×och3),3.86(3h,s,och3),3.85(3h,s,och3),3.71(1h,brs,h-14),3.50(1h,d,j=15.6hz,8-ha),3.23(1h,m,h-13),3.10(2h,m,h-6),2.60(2h,m,h-5),0.95(3h,d,j=7.2hz,och3).13cnmr(150mhz,cdcl3):δ150.0(c-10),147.6(c-3),147.2(c-2),144.8(c-9),134.8(c-12a),128.3(c-8a,c-14a,c-4a),124.0(c-12),111.1(c-4),110.9(c-11),108.6(c-1),63.0(c-14),60.1(9-oh3),56.1,55.8,55.8(2,3,10-ch3),54.4(c-8),51.4(c-6),38.2(c-13),29.2(c-5)。以上数据与文献报道的延胡索甲素（corydaline）一致。
实施例4：
选取组分iv采用离子交换色谱分离模式制备型高效液相色谱（hplc）分离，色谱条件：色谱柱为硅胶基质的强阳离子交换柱（xchargescx）；体积分数45%乙腈 体积分数100mm磷酸二氢钠（用磷酸调ph至2.8） 体积分数300mm三氟乙酸钠 体积分数15%水等度洗脱；流速为3ml/min；检测波长为320nm；进样量为100μl。谱图如图4所示。收集各个色谱峰，分别回收溶剂，其中p7量不够核磁鉴定，其他4个化合物结构数据如下：
具体结构数据如下：
p8：黄色粉末，正离子esi-ms给出分子离子峰m/z：352[m] ；1hnmr(400mhz,meod)δ9.64(s,1h,h-8),8.06(d,j=9.2hz,1h,h-12),7.85(d,j=9.2hz,1h,h-11),7.40(s,1h,h-1),7.14(s,1h,h-4),4.79(t,2h,h-6),4.18(s,3h,och3-9),3.98(s,3h,och3-3),3.94(s,3h,och3-2),3.18(t,2h,h-5),3.03(s,3h,ch3-13);13cnmr(100mhz,meod)δ151.3(c-3),150.3(c-10),147.9(c-2),142.3(c-9),142.1(c-8),135.8(c-14),133.2(c-12a),131.6(c-4a),130.9(c-11),130.2(c-13),121.9(c-8a),120.7(c-12),119.5(c-14a),114.3(c-1),110.3(c-4),60.7(och3-9),57.2(c-6),55.6(och3-2),55.2(och3-3),27.3(c-5),16.7(ch3-13)。以上数据与文献报道的13-甲基去氢紫堇达明碱（13-methyldehydrocorydalmine）一致。
p9：黄色粉末，正离子esi-ms给出分子离子峰m/z：352[m] ；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.86(s,1h,h-8),8.20(d,j=9.4hz,1h,h-12),8.17(d,j=9.4hz,1h,h-11),7.37(s,1h,h-1),6.92(s,1h,h-4),4.93-4.71(m,2h,h-6),4.11(s,3h,och3-9),4.09(s,3h,och3-10),3.87(s,3h,och3-2),3.11-3.03(m,2h,h-5),2.98(s,3h,ch3-13);13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ150.4(c-10),149.7(c-14a),146.8(c-2),144.4(c-9),144.2(c-8),136.9(c-14),133.6(c-12a),132.4(c-4a),129.7(c-13),126.3(c-12),121.6(c-11),121.0(c-8a),118.1(c-3),115.6(c-1),115.1(c-4),62.4(och3-9),57.3(c-6),57.3(och3-10),56.7(och3-2),27.1(c-5),18.1(ch3-13)。以上数据与文献报道的去氢紫堇球碱（dehydrocorybulbine）一致。
p10：黄色粉末，正离子esi-ms给出分子离子峰m/z：366[m] ；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.36(1h,s,h-8),7.93(1h,d,j=9.20,h-12),7.87(1h,d,j=9.20,h-11),7.27(1h,s,h-1),6.93(1h,s,h-4),5.16(2h,br.s,h-6),3.24(2h,br.s,h-5),3.95(3h,s,och3-2),4.30(3h,s,och3-3),4.08(3h,s,och3-9),4.00(3h,s,och3-10),2.98(3h,s,ch3-13)。以上数据与文献报道的去氢紫堇碱（dehydrocorydaline）一致。
p11：黄色粉末，正离子esi-ms给出分子离子峰m/z：352[m] ；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.16(1h,s,h-8),8.86(1h,s,h-13),7.98(1h,d,j=9.20,h-12),7.71(1h,d,j=8.40,h-11),7.45(1h,s,h-1),6.74(1h,s,h-4),5.17(2h,br.s,h-6),3.29(2h,br.s,h-5),3.97(3h,s,och3-2),4.24(3h,s,och3-3),4.08(3h,s,och3-9),4.03(3h,s,och3-10)。以上数据与文献报道的巴马汀（palmatine）一致。
采用本发明的方法可实现生物碱的目标制备，可获取批量的已知活性生物碱，同时富集分离微量生物碱，从而不断丰富生物碱库，为生物碱类化合物的活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：步骤如下：
（1）延胡索甲醇提取物经一根c18wcx反相/弱阳离子交换混合模式色谱柱分段后获得3个组分，分别为延胡索微量生物碱组分、常量叔胺碱组分和季铵碱组分。
2.（2）采用制备液相色谱从这3个生物碱组分中高效分离纯化生物碱单体：将延胡索微量生物碱组分通过二维反相/反相色谱模式进行分离纯化；将延胡索常量叔胺碱组分通过反相色谱模式进行分离纯化；将延胡索季铵碱组分通过离子交换色谱模式进行分离纯化。
3.根据权利要求1所述一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：所述二维反相/反相色谱分离模式中，第一维反相色谱柱为极性修饰碳十八柱（xchargec18），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与含甲酸或乙酸的水混合，洗脱方式为线性梯度；第二维反相色谱柱为普通碳十八柱（xunionc18、unitaryc18、xterramsc18或sunfirec18），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与酸水混合，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。
4.根据权利要求1所述一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：所述反相色谱分离模式中，反相色谱柱为普通碳十八柱（xunionc18、unitaryc18、xterramsc18或sunfirec18），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与酸水混合，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。
5.根据权利要求3或4所述一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：所述酸水含乙酸或磷酸中的一种，用三乙胺调节ph至5.0-6.5。
6.根据权利要求1所述一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：所述离子交换分离模式中，离子交换柱为硅胶基质的强阳离子交换柱（xchargescx），流动相组成为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或两种与缓冲盐混合，采用等度洗脱方式。
7.根据权利要求6所述一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：所述缓冲盐含磷酸盐、离液盐，用磷酸调节ph至1.5-5.0。
8.根据权利要求1所述一种延胡索生物碱的系统分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下：色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-1000mm；样品浓度为1mg/ml-1g/ml；进样量为10μl-400ml；流速为0.5-480ml/min；柱温为25℃-45℃。
技术总结