本发明涉及中药材应用领域，具体而言，涉及虎刺和/或珍珠菜在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。
背景技术：
珍珠菜为报春花科珍珠菜属植物虎尾珍珠菜lysimachiaclethroidesduby的根或全草。分布于我国东北、华北、华东、中南、西南及河北、陕西等地。《浙江中药资源名录》、《江苏药材志》、《江西草药》、《陕西中草药》、《宁夏中草药手册》、《贵阳民间药草》中均有记载：具有清热利湿，活血散瘀，解毒消痈之功效。主治水肿，热淋，黄疸，痢疾，风湿热痹，带下，经闭，跌打，骨折，外伤出血，乳痈，疔疮，蛇咬伤等。虎刺damnacanthusindicusgaertn.f为茜草科植物，俗名绣花针、黄脚鸡等，中医上主要用于治疗肝炎、风湿痹痛、黄疸水肿等病症。民间用其全草或根，有活血凉血、祛风止痛、利湿消肿的功效，用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、黄疸水肿、月经不调等。瑶药中又叫黄鸡站：用于贫血，神经衰弱，病后体虚，疳积。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供虎刺和/或珍珠菜在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用，本发明首次发现了虎刺和/或珍珠菜对再生障碍性贫血具有一定的疗效，特别是虎刺总黄酮和/或珍珠菜总黄酮对再生障碍性贫血具有良好的疗效。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
虎刺和/或珍珠菜在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。
具体地，本发明提供了虎刺总黄酮和/或珍珠菜总黄酮在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。
本发明将虎刺总黄酮和珍珠菜总黄酮对再生障碍性贫血动物模型进行动物实验发现，其能有效提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的cfu-e和cfu-gm集落的数量；提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的nk细胞的活性；提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的il-i、il-6的活性，以及具有增强免疫力的作用。
具体地，虎刺和/或珍珠菜应用于治疗再生障碍性贫血。
再生障碍性贫血的治疗方法，包括给予受试者有效量的虎刺和/或珍珠菜。
抑或虎刺总黄酮和/或珍珠菜总黄酮应用于治疗再生障碍性贫血。
再生障碍性贫血的治疗方法，包括给予受试者有效量的虎刺总黄酮和/或珍珠菜总黄酮。
其中，给药方式可以为口服、静脉注射或者是透皮渗透方式，施加于需要治疗的患者，具体可根据病人的病情、年龄等，由医师决定。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供了一种药物组合物，其有效药材由虎刺和珍珠菜组成。
本发明提供的药物组合物可用于治疗再生障碍性贫血。
本发明还提供了一种药物组合物，其有效组分由虎刺总黄酮和珍珠菜总黄酮组成。
本发明提供的药物组合物可用于治疗再生障碍性贫血。
具体地，本发明将虎刺总黄酮和珍珠菜总黄酮对再生障碍性贫血动物模型进行动物实验发现，其能有效提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的cfu-e和cfu-gm集落的数量；提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的nk细胞的活性；提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的il-i、il-6的活性，以及具有增强免疫力的作用。
其中，在一些可能的实施方式中，所述虎刺总黄酮以虎刺为原料，采用70％乙醇提取得到；
所述珍珠菜总黄酮以珍珠菜为原料，采用80％乙醇提取得到。
进一步地，所述虎刺总黄酮提取中，料液比为1:25(g/ml)，提取温度为50℃，提取时间40min；
所述珍珠菜总黄酮以粉末状珍珠菜为原料，采用80％乙醇提取3次，以珍珠菜体积计，80％乙醇的添加体积量为：第一次12倍量，第二次10倍量，第三次8倍量，每次提取1小时。
上述方法中，虎刺总黄酮提取中，所用的原料为虎刺粉碎后经60目筛得到的粉碎物，虎刺总黄酮的提取率为14.57mg/g生药；粉末状珍珠菜也是以珍珠菜粉碎后经60目筛得到的粉碎物，珍珠菜总黄酮的平均提取率为4.81mg/g生药。
进一步地，所述虎刺总黄酮和所述珍珠菜总黄酮的重量比为1-2：1-2，优选为1:1。
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
其中，本发明中的药学上可接受的辅料可以包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂等中的任一种或多种，可根据实际需要选择。
进一步地，所述药物组合物的剂型包括片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、注射剂中的任一种。
本发明提供的药物组合物的剂型按照本领域的常规方法制备即可。如为了将本发明的有效成分制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
如：为了将给药单元制成胶囊剂，可以将本发明的有效成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
又如：为将本发明的有效成分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、ph调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；ph调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明首次发现了虎刺和/或珍珠菜对再生障碍性贫血具有一定的疗效，特别是虎刺总黄酮和/或珍珠菜总黄酮对再生障碍性贫血具有良好的疗效。
(2)本发明将虎刺总黄酮和珍珠菜总黄酮对再生障碍性贫血动物模型进行动物实验发现，其能有效提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的cfu-e和cfu-gm集落的数量；提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的nk细胞的活性；提高再生障碍性贫血动物模型小鼠的il-i、il-6的活性，以及具有增强免疫力的作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一、总黄酮提取
虎刺总黄酮提取工艺：70％乙醇提取，料(60目)液比为1:25(g/ml)，提取温度为50℃，提取时间40min。得到的虎刺总黄酮的提取率为14.57mg/g生药。
珍珠菜总黄酮提取工艺：80％乙醇提取3次，以珍珠菜粉状固体(60目)的体积计，添加的80％乙醇的量为：第一次12倍量，第二次10倍量，第三次8倍量，每次提取1小时。提取得到的珍珠菜总黄酮含量平均为4.81mg/g生药。
二、组方有效部位不同比例配比筛选
1、试验方法
根据文献检索及前期研究结果，选取虎刺总黄酮和珍珠菜总黄酮，拟通过配比研究来确定配比比例。本次试验选用3个配比进行研究，具体配比情况见表1。
表1虎刺、珍珠菜配比筛选
将km小鼠(雌雄各半)60只随机分组，每组10只，除对照组外其余各组小鼠每只腹腔注射环磷酰胺200mg/kg进行再生障碍性贫血模型制备，每日1次，连续5日。按组别给予相应药物(具体组别及剂量见表1)，对照组和模型对照组给予纯化水，每日给药一次。连续给药7天，末次给药后1小时，眼眶取血进行血液学检测。得到的结果如表2所示。
表2虎刺、珍珠菜配伍对小鼠外周血象的影响(
注：与模型对照组比较，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
造模后，小鼠外周血象三系较正常组明显降低p<0.01)，表明造模成功。药物组三组配比血细胞三系均有升高，但以配比1即1:1配比组更为明显。
实施例2
根据实施例1确定的配伍关系进行药效学验证。具体如下：
1、对造血祖细胞集落的影响
1.1分组、造模及给药
将km小鼠(雌雄各半)随机分组，每组10只，除对照组外每只腹腔注射环磷酰胺200mg/kg制备再生障碍性贫血模型，每日1次，连续5日。按组别给予相应药物(具体组别及剂量见表3)，空白对照组和模型对照组给予纯化水，每日给药1次，连续给药7天。
1.2骨髓细胞培养
末次给药后1小时，脱颈椎处死小鼠，浸泡于酒精中片刻，取出后置于托盘中，令小鼠仰卧，在腹中部作一长的横切口，完全翻转皮肤，自下半身至后肢用75％酒精浸泡，剔除肌肉，由股关节处断离大腿并去掉双脚，在脱离关节时，注意勿损伤长骨的骨骺。夹住长骨，平齿镊刮去肌肉，用无菌纱布擦拭干净，用剪刀剪去骨骺，再用带有20号针头的20ml注射器吸取dmem培养液，反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞收集在无菌试管中，用5号针头反复吹打，使骨髓细胞充分散开，然后将骨髓细胞悬液以1:1的比例缓慢加入淋巴细胞分离液的上层，1200转/分钟离心15分钟，抽取单个核细胞层，悬浮于装有2mldmem的离心管中，洗涤2次，弃去上清。将沉淀细胞加入适量dmem培养液，充分混匀后计数。调整细胞浓度至3×106个/ml待用。
1.3cfu-e培养体系的建立
18％甲基纤维素，20％胎牛血清，10％小牛血清白蛋白，5mol/l二巯基乙醇，100u/ml青链霉素溶液，2u/ml促红细胞生成素，骨髓单个核细胞悬液3×105个/ml。上述试剂混匀后，接种至96孔培养板中，每份标本接种3个孔，每孔0.1ml含单个核细胞3×104个。置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养3天。
1.4cfu-gm培养体系的建立
18％甲基纤维素，20％胎牛血清，10％小牛血清白蛋白，5mol/l二巯基乙醇，100u/ml青链霉素溶液，0.1μg/mlg-csf，骨髓单个核细胞悬液3×105个/ml。上述试剂混匀后，接种至96孔培养板中，每份标本接种3个孔，每孔0.1ml含单个核细胞3×104个。置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养7天。
1.5试验结果
表3配比1对小鼠骨髓cfu-e/cfu-gm集落的影响
注：与模型对照组比较，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
结果表明，模型对照组小鼠的cfu-e和cfu-gm集落数量明显低于空白对照组，配比1中高中低剂量的集落数均高于模型对照组，其中高、中剂量高于低剂量组。
2、对nk细胞的影响
2.1分组、造模及给药
将km小鼠(雌雄各半)随机分组，每组10只，除对照组外每只腹腔注射环磷酰胺200mg/kg制备再生障碍性贫血模型，每日1次，连续5日。按组别给予相应药物(具体组别及剂量见表4)，空白对照组和模型对照组给予纯化水，每日给药1次，连续给药7天。
2.2小鼠脾细胞悬液的制备
末次给药后1小时，将小鼠脱颈处死，解剖取出脾脏，用滤纸吸干残血后置于75％的酒精中浸泡3～5min，无菌取出脾脏，匀浆过200目筛网得脾细胞悬液，1000r/min离心5min。弃上清，加入红细胞裂解液，轻轻吹打均匀，冰浴作用5min，1000r/min离心5min。弃上清，用pbs液洗涤3次。加入含10％fbs的rpmi1640培养液混悬细胞，放入t25培养瓶中，co2培养箱37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱培养备用。
2.3靶细胞的制备
取生长良好的yac-1细胞以1000rpm，8min离心一次后，用含10％小牛血清的rpmi1640完全培养基将其调成浓度为2×105/ml的细胞悬液待用；
效应细胞(2.2制备的脾细胞)与靶细胞比例为50:1，按下表将各细胞加入96孔培养板中，各实验组均设6个平行孔，每块96孔培养板上均设一组空白对照组。培养2小时后在450nm测定吸光度。
计算公式：nk细胞活性(％)＝[1一(a实验孔一a效应孔)/a靶细胞]x100％
2.4试验结果
表4配比1对小鼠脾nk细胞活性的影响
注：与模型对照组比较，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
结果表明，模型对照组小鼠与空白组比较，nk细胞活性显著降低。药物组中司坦唑醇片和配比1高中剂量组能提高模型动物的nk细胞活性。
3、对环磷酰胺所致再障模型小鼠细胞因子的影响
3.1分组、造模及给药
将km小鼠(雌雄各半)随机分组，每组10只，除对照组外每只腹腔注射环磷酰胺200mg/kg，每日1次，连续5日。按组别给予相应药物(具体组别及剂量见表5)，空白对照组和模型对照组给予纯化水，每日给药1次，连续给药7天。
3.2细胞因子的检测
末次给药后1h，对眼眶取血，取全血不抗凝，静置10min后，3500r/min离心15min，分离血清，采用酶联免疫法测定测定血清il-1、il-6、inf-γ水平，按试剂盒说明操作。
3.3试验结果
表5配比1对小鼠细胞因子的影响(
注：与模型对照组比较，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
配比1的高、中剂量组inf-γ与模型对照组比较有显著差异，说明具有一定的增强免疫作用。与空白对照组相比，模型对照组小鼠il-l、il-6活性明显下降，配比1高剂量组与模型对照组il-1相比有明显升高，其他各组虽然无统计学差异但也有升高的趋势。说明可提高再障模型小鼠il-i、il-6的活性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
1.虎刺和/或珍珠菜在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。
2.虎刺总黄酮和/或珍珠菜总黄酮在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
4.一种药物组合物，其特征在于，其有效药材由虎刺和珍珠菜组成。
5.一种药物组合物，其特征在于，其有效组分由虎刺总黄酮和珍珠菜总黄酮组成。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述虎刺总黄酮以虎刺为原料，采用70％乙醇提取得到；
所述珍珠菜总黄酮以珍珠菜为原料，采用80％乙醇提取得到。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述虎刺总黄酮提取中，料液比为1:25(g/ml)，提取温度为50℃，提取时间40min；
所述珍珠菜总黄酮以粉末状珍珠菜为原料，采用80％乙醇提取3次，以珍珠菜体积计，80％乙醇的添加体积量为：第一次12倍量，第二次10倍量，第三次8倍量，每次提取1小时。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述虎刺总黄酮和所述珍珠菜总黄酮的重量比为1-2：1-2，优选为1:1。
9.根据权利要求5-8任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、注射剂中的任一种。
技术总结