本发明涉及荔枝核甾体皂苷技术领域，尤其涉及一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物及制备方法。
背景技术：
中国是世界上糖尿病人口最多的国家，由胰岛素抵抗(ir)引起的2型糖尿病(t2dm)占糖尿病患者的90％，迄今对ir引起的t2dm尚无有效根治手段，因此，改善ir、增加胰岛素敏感性对防治t2dm意义重要。我国对糖尿病的防治正在流行病学调查登记、糖尿病宣传教育、糖尿病及其并发症的预防工作，提出三级预防措施，特别是对部分高危人群如葡萄糖耐受受损(igt)的进行积极的药物干预可大大减缓其发病尤其是并发症的发生。
据公开的市场调查报告显示，现有临床治疗糖尿病口服用药主要以磺脲类、双胍类等化学药物为主导，两者市场规模达到21亿元人民币，中成药主要是消渴丸，市场销售约为5.79亿。治疗胰岛素抵抗药物多用噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，包括罗格列酮、吡格列酮等，销售约4.86亿。随着噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂临床应用的扩大，该类药物存在造成缺血性心血管疾病的风险，使用已受到各国限制。由于2型糖尿病患者需要终身用药，必须重视药物不良反应。
中医中药在防治慢性疾病方面拥有独特优势，中药化学成分的多元化为多环节、多途径、多靶点综合协调逆转ir、防治2型糖尿病提供了物质基础。近年研究发现有降糖作用的中药达70余种，其中临床上常用的就有20余种，单味的如人参、黄芪、生地黄、黄连、大黄、金银花、薏苡仁、蕃石榴、葛根等，许多中药复方通过大量医学实验尤其是分子生物学研究证实疗效肯定其有效成分如多糖、皂苷、生物碱、黄酮等均有改善ir的作用。
荔枝核具有较高的经济和药用(降糖)价值。荔枝资源存量稳定、可持续供应，荔枝核来源丰富，价廉易得，产销基地与渠道成熟。荔枝核入肝肾，成分复杂，具有理气散结的功效，切中2型糖尿病的病机，常用于降糖。我们前期完成的系列研究结果证实荔枝核及其皂苷可增强胰岛素敏感性，改善ir，降糖调脂，防治t2dm，使用安全，没有不良反应。因此，研究荔枝核甾体皂苷对胰岛素信号传导通路及相关调控因子的作用，阐明其分子机制，可丰富目前关于传统中药在改善ir、防治t2dm的作用和机制研究的空白，为进一步研发改善ir、防治t2dm药物提供理论与实验依据，项目具有良好的市场应用前景。
因此，我们提出了一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物及制备方法用于解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物及制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，包括以下步骤：
s1：根据荔枝核的产地、品种进行药材收集、鉴定，选用无明显杂质的原材料；
s2：将s1中选取的药材进行粉碎；
s3：利用乙醇提取浓缩，得到荔枝核浸膏；
s4：加水加热超声溶解；
s5：通过正丁醇萃取，正向硅胶柱色谱分离提纯富集，而后合并洗脱液，得到荔枝核甾体皂苷。
优选的，采用紫外分光光度法测定提取物中荔枝核甾体皂苷含量，确定各成分专属指纹图谱共有模式，结合其指纹图谱特征拟订质量标准。
优选的，所述s2中，通过粉碎桨进行粉碎，且粉碎桨的转速为1000-1500r/min。
优选的，所述s3中，利用95％的乙醇提取浓缩。
优选的，所述s4中，超声溶解的温度为40-50℃，持续30-50min。
优选的，所述s5中，洗脱液为交换树脂后所得到的溶液，具体为乙醇溶液。
与现有技术相比，本发明结合现代生物技术，通过内激网应激(ers)与胰岛素抵抗核心靶点活化转录因子(atf6)的关联分析，确认荔枝核甾体皂苷发挥改善ir关键调控作用的蛋白靶标；并从分子、细胞、整体动物水平，结合ptp1b介导的胰岛素信号传导通路研究，验证荔枝核甾体皂苷通过阻止ers诱导的atf6活化、抑制ptp1b蛋白表达改善ir。
附图说明
图1为本发明提出的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备流程图；
图2为本发明提出的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物改善t2dm伴ir体内、外药效学验证方法图。
具体实施方式
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。“质量、浓度、温度、时间、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，1-50的范围应理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50的任何数字、数字的组合、或子范围、以及所有介于上述整数之间的小数值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、和1.9。关于子范围，具体考虑从范围内的任意端点开始延伸的“嵌套的子范围”。例如，示例性范围1-50的嵌套子范围可以包括一个方向上的1-10、1-20、1-30和1-40，或在另一方向上的50-40、50-30、50-20和50-10。”。
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明提出的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，包括以下步骤：
s1：根据荔枝核的产地、品种进行药材收集、鉴定，选用无明显杂质的原材料；
s2：将s1中选取的药材进行粉碎；
s3：利用乙醇提取浓缩，得到荔枝核浸膏；
s4：加水加热超声溶解；
s5：通过正丁醇萃取，正向硅胶柱色谱分离提纯富集，而后合并洗脱液，得到荔枝核甾体皂苷。
其中，采用紫外分光光度法测定提取物中荔枝核甾体皂苷含量，确定各成分专属指纹图谱共有模式，结合其指纹图谱特征拟订质量标准。
具体地，s2中，通过粉碎桨进行粉碎，且粉碎桨的转速为1000-1500r/min，s3中，利用95％的乙醇提取浓缩，s4中，超声溶解的温度为40-50℃，持续30-50min，s5中，洗脱液为交换树脂后所得到的溶液，具体为乙醇溶液。
实施例一中，研究荔枝核甾体皂苷对高糖诱导的hl-7702细胞中ptp1b的表达及作用机制；
(1)hl-7702细胞培养
hl-7702细胞使用含10％胎牛血清的1640培养液培养，置于37°c,5％co2恒温培养箱内常规培养。
(2)细胞接种前进行细胞计数：
①制备细胞悬液
终止培养，将培养液吸出，用pbs洗培养物一次。向培养瓶内加入lml0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化3-5min。该期间内不断在显微镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。加入一定量的培养液(如果这些培养细胞不再有用，可加pbs)，用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。
②计数与计算过程
在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹭处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。实验均重复三次。按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝(4个大格细胞总数/4)x104。
实施例二中，研究荔枝核甾体皂苷对hepg2细胞增殖分化影响及机制；
(1)细胞分组：
按照荔枝核甾体皂苷浓度的不同分为以下几个组：0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、80、100μmol/l组。
(2)荔枝核甾体皂苷对hepg2细胞增殖的影响：mtt法。
mtt法实验步骤如下：
①hl-7702细胞按照1x104/ml的密度接种在96孔板中，用含10％胎牛血清的1640培养基培养24h；
②用pbs冲洗2次后，更换无血清培养基继续培养12-24h；
③用pbs冲洗2次后，更换含不同浓度荔枝核甾体皂苷的培养基继续培养24h。每个浓度做6个复孔；
④用pbs冲洗2次后，每孔加入含5mg/mlmtt的培养基200μl,继续培养4-6h；
⑤弃含mtt的培养液，加入20伽1/孔的dmso，在摇床上振荡10-15min；
⑥在酶标仪上读取570nm处的吸光度。
实施例三中，研究荔枝核甾体皂苷对高糖诱导的hl-7702细胞中atf6在细胞内定位的影响：
实验分组：
①正常对照组(controi组)：正常培养液处理48h；
②高糖组(highglucose组，hg组)：含25mmo1/ld-葡萄糖的培养液处理24小时后更换正常培养液处理24h；
③荔枝核甾体皂苷处理高糖诱导的细胞组(荔枝核甾体皂苷 highglucose组，荔枝核甾体皂苷 hg组):25mmo1/ld-葡萄糖处理24h后更换含0.4mg/ml荔枝核甾体皂苷的培养液处理24h；
④荔枝核甾体皂苷处理正常细胞对照组(荔枝核甾体皂苷组)：正常的培养液处理24h后更换含0.4mg/ml荔枝核甾体皂苷的培养液处理24h。
其中，atf6的细胞内定位检测采用免疫荧光法。
免疫荧光法实验步骤如下：
①取出含细胞的盖玻片，用pbs冲洗，4％多聚甲醛固定10min；
②pbs洗5min,3次；
③1％tritonx-100室温孵育20min,pbs洗5min,3次；
④正常山羊血清室温封闭i0min,去除多余血清，pbs洗5min，3次；
⑤atf6抗体(1：100稀释)置于湿盒中常温孵育2h,pbs洗smin，3次；
⑥pbs适当稀释的罗丹明标记的山羊抗兔二抗(1：100稀释)，置于湿盒中37℃1h，pbs洗5minx3次；用pbs充分漂洗，除去非特异性结合的抗体；
⑦80％缓冲甘油封片，于leica激光共聚焦显微镜下观察被荧光标记的细胞，拍照。
进一步地，实验数据处理采用spss17.0统计软件进行数据处理：各组实验数据以(x±s)表示，多组数据间比较采用单因素方差分析(q检验)，两组均数比较采用t检验，组间比较用计量资料的成组t检验，组间相关性用相关回归分析，p<0.05表示差异有显著性。
综上，本发明结合现代生物技术，通过内激网应激(ers)与胰岛素抵抗核心靶点活化转录因子(atf6)的关联分析，确认荔枝核甾体皂苷发挥改善胰岛素抵抗(ir)关键调控作用的蛋白靶标；并从分子、细胞、整体动物水平，结合ptp1b介导的胰岛素信号传导通路研究，验证荔枝核甾体皂苷通过阻止ers诱导的atf6活化、抑制ptp1b蛋白表达改善胰岛素抵抗(ir)。
评价胰岛素抵抗指数变化，对脂肪细胞因子、胰岛素靶器官细胞的内质网应激和胰岛素信号传导通路中atf6、ptp1b蛋白表达水平考察，是阐明荔枝核甾体皂苷改善胰岛素抵抗、防治2型糖尿病的作用靶点及机制技术关键。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
1.一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1：根据荔枝核的产地、品种进行药材收集、鉴定，选用无明显杂质的原材料；
s2：将s1中选取的药材进行粉碎；
s3：利用乙醇提取浓缩，得到荔枝核浸膏；
s4：加水加热超声溶解；
s5：通过正丁醇萃取，正向硅胶柱色谱分离提纯富集，而后合并洗脱液，得到荔枝核甾体皂苷。
2.根据权利要求1所述的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，其特征在于，采用紫外分光光度法测定提取物中荔枝核甾体皂苷含量，确定各成分专属指纹图谱共有模式，结合其指纹图谱特征拟订质量标准。
3.根据权利要求1所述的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，其特征在于，所述s2中，通过粉碎桨进行粉碎，且粉碎桨的转速为1000-1500r/min。
4.根据权利要求1所述的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，其特征在于，所述s3中，利用95％的乙醇提取浓缩。
5.根据权利要求1所述的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，其特征在于，所述s4中，超声溶解的温度为40-50℃，持续30-50min。
6.根据权利要求1所述的一种糖尿病治疗用荔枝核甾体皂苷提取物的制备方法，其特征在于，所述s5中，洗脱液为交换树脂后所得到的溶液，具体为乙醇溶液。
技术总结