本发明涉及蛋白提取技术领域，更具体的说是涉及鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用。
背景技术：
帕金森病(parkinson'sdisease，pd)是继阿尔茨海默症之后的第二大神经退行性疾病，流行病学研究表明，在全世界范围内，pd患者在65岁以上人群中占1～2％，在85岁以上人群中占4～5％。pd不仅严重影响患者的身体和心理健康，也增加了家庭和社会的经济负担。现代研究认为，pd发病部位在大脑黑质区多巴胺神经元丢失引起体内多巴胺分泌量降低，继而出现震颤、运动迟缓、肌肉僵直等一系列运动功能障碍。目前临床上指南推荐药物多为左旋多巴为代表的复方多巴制剂及抗胆碱类药物。左旋多巴吸收入血后迅速转化为多巴胺，仅能解决病人体内多巴胺分泌量不足这一问题，但并不能从根源上恢复多巴胺神经元的缺失。并且随着用药时间的增长，用药量也随之不断加大，继而引发一系列中枢神经系统方面的副作用，如异动症(舞蹈样动作、肌张力障碍)、运动波动、神经精神症状。目前，尚未有某种药物能够彻底治疗pd，从根源上逆转恢复多巴胺神经元或提早预防多巴胺神经元的缺失与功能退化。
中医认为，鹿茸性温，入肝、肾经。鹿茸是迄今为止唯一发现的哺乳动物可再生附属器官，现代药理学研究表明鹿茸有很强修复再生能力。鹿茸不仅能够促进血管再生，还能促进表皮和成纤维细胞增殖及皮肤创伤愈合。且大量研究表明，鹿茸对神经系统具有保护作用。这为鹿茸用于治疗神经系统损伤性疾病提供了一定的理论依据。但现有的研究在肯定了鹿茸修复神经损伤作用的同时，并未对其毒性进行过系统研究。因此，提供鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用，确定鹿茸蛋白提取物的毒性及其药理学作用，以及最佳药效剂量范围是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用，确定了鹿茸蛋白提取物的毒性及其药理学作用，以及最佳药效剂量范围。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用。
进一步，鹿茸蛋白提取物在制备治疗秀丽隐杆线虫帕金森药物中的应用，所述鹿茸蛋白提取物的浓度为1-4mg/ml。
进一步，所述鹿茸蛋白提取物的制备方法如下：
(1)将新鲜鹿茸直接用液氮速冻，置入超微粉碎机中，加水粉碎至肉糜状，获得鹿茸糜状物；
(2)按照1:10(w/v)的比例向鹿茸糜状物中加入双蒸水，取冰醋酸调节ph为4，搅拌过夜后离心取上清并浓缩；
(3)将浓缩好的上清液放入透析袋透析脱盐，将除盐的鹿茸蛋白粗提物溶液旋蒸并冻干；
(4)将冻干的鹿茸蛋白粗提物用缓冲液溶解，浓度为30mg/ml；涡旋混匀，用0.22μm的滤膜过滤，进行洗脱；洗脱条件为流速：1.0ml/min，温度20℃，柱子型号：hitrapq；
(5)洗脱后得到的鹿茸蛋白液再次除盐并冻干，得到鹿茸蛋白提取物。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用，本发明以帕金森模型线虫为研究对象，探究了不同浓度鹿茸蛋白提取物对线虫的毒性作用与药理作用，确定了鹿茸蛋白提取物最佳给药浓度，为后续鹿茸蛋白提取物治疗帕金森病提供研究依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明鹿茸蛋白提取物sds-page蛋白电泳图；
图2附图为本发明不同浓度鹿茸蛋白提取物对a30p线虫生存率的影响；与对照组相比，*p＜0.05；
图3附图为本发明不同浓度鹿茸蛋白提取物对a30p线虫体长的影响；
图4附图为本发明不同浓度鹿茸蛋白提取物对a30p线虫产卵数量的影响；与对照组相比，*p＜0.05；
图5附图为本发明12倍镜显微镜下的a30p线虫；a为对照组，b为给药2mg/ml组；
图6附图为本发明各浓度a30p线虫身体弯曲频率；与对照组相比，**p＜0.01，***p＜0.001；
图7附图为本发明25倍双光子显微镜下拍摄a30p线虫荧光图片；a-g给药浓度依次为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml；
图8附图为本发明各浓度下树突恢复百分率；与对照组相比，**p＜0.01，***p＜0.001；
图9附图为本发明各浓度下树突计分；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
秀丽隐杆线虫a30p(pdat-1::α-sny::gfp)，大肠杆菌菌株(e.coliop50)，均由日本tomokikuwahara博士惠赠。
梅花鹿鹿茸(购自吉林云鹿集团)，经中国中医科学院医学实验中心形态学实验室王毅研究员鉴定为梅花鹿cervusnippon的鹿茸。琼脂(国药试剂)、细菌蛋白胨(oxoid)、叠氮钠(sigma)、5-氟尿嘧啶(sigma)，bca蛋白试剂盒(碧云天)，其他所需化学试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司。
实验均独立重复3次，采用graphpad6.02软件进行单因素方差分析，p＜0.05或p＜0.01表示有统计学差异，组间比较采用单因素方差分析，结果均用mean±sd表示。
实施例1
工作液的准备：
①缓冲溶液的配置：
buffera(tris-hcl，20mmol/l)：取tris(三羟甲基氨基甲烷)2.422g于ddh2o中，用1mol/lhcl调节ph＝8.5定容于1l的容量瓶中。
bufferb(tris-hcl-nacl，1mol/l)：取已配置好的tris-hcl缓冲液500ml加入29.22gnacl。
②ddh2o：用于置换管路中的缓冲液，防止缓冲液中有盐析出，堵柱子。
③20％乙醇：当用水洗脱2-3个柱体积，可用其充满柱子，防止长菌。
④将上述工作液经过0.22μm的滤膜超滤，并超声10min左右，除去气泡。
1)鹿茸蛋白提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将新鲜鹿茸直接用液氮速冻，置入超微粉碎机中，加水粉碎至肉糜状，获得鹿茸糜状物；
(2)按照1:10(w/v)的比例向鹿茸糜状物中加入双蒸水，取冰醋酸调节ph为4，搅拌过夜后离心取上清并浓缩；
(3)将浓缩好的上清液放入1kd透析袋透析脱盐，将除盐的鹿茸蛋白粗提物溶液55℃旋蒸并冻干；
(4)将冻干的鹿茸蛋白粗提物用缓冲液溶解，浓度为30mg/ml；涡旋混匀，用0.22μm的滤膜过滤，将其装到1ml的ep管中，用buffera将蛋白液冲进柱子，用bufferb进行洗脱；洗脱条件为流速：1.0ml/min，温度20℃，柱子型号：hitrapq；
(5)洗脱后得到的鹿茸蛋白液再次除盐并冻干。
2)蛋白含量测定
采用bca试剂盒法检测所得鹿茸蛋白提取物中蛋白含量。
按照bca蛋白试剂盒说明书配置梯度蛋白标准品，并以50:1的比例混合a液与b液。取各个稀释要求浓度的标准品和待测蛋白质样品25μl加入到96孔板中，并且每个样品孔加入200μl工作液振荡混匀。37℃孵育30min，在595nm下测量od值。
bca试剂盒法测得蛋白线性回归方程y＝2.8419x-0.2857，r2＝0.9962，计算得出鹿茸蛋白提取物中蛋白含量为76％。
3)蛋白分子量分析
分别配置10％分离胶和5％浓缩胶进行sds-page蛋白电泳。首先将鹿茸蛋白提取物干粉溶解配置成为1mg/ml浓度蛋白溶液。按比例加入5x上样缓冲液后50℃煮沸3min。上样体积分别为20μl与10μl。起始电压为80v，待溴酚蓝指示剂进入分离胶时调整电压升高至120v，溴酚蓝指示剂消失即停止电泳。然后用考马斯亮蓝染液摇床振荡染色45min后脱色过夜。完全脱色后观察鹿茸蛋白及标准蛋白条带分布并进行对比，结果见图1。
从sds-page蛋白电泳图(图1)可以得出，鹿茸蛋白广泛分布于55-250kd之间，多为大分子蛋白；着重分布于130kd附近，以及55-70kd之间。
4)样品制备
取适量冻干的鹿茸蛋白提取物干粉，加入m9缓冲液完全溶解后，用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。待使用时按浓度要求稀释。
实施例2
1)线虫培养
将op50大肠杆菌均匀涂抹在ngm琼脂板上，37℃培养过夜。每隔2天转移秀丽隐杆线虫a30p到新的含菌ngm琼脂板上，20℃培养箱恒温培养。
2)线虫同步化
用m9轻轻从ngm板上洗下产卵期a30p线虫，收集在1.5ml离心管中；静置后4000g离心1min，弃上清液；加入适量m9，反复清洗3次；加入1ml线虫裂解液，振荡混匀1min，离心去上清；加入m9反复清洗3-5次后加入空白ngm板中孵育过夜，得到同步化l1期a30p线虫。
3)生存率实验
将同步化的l4期a30p线虫加入不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml)的鹿茸蛋白提取物中，置于96孔板，每孔约20条线虫。置于20℃培养箱培养24小时，计数各组线虫存活个数，a30p线虫存活率见图2。线虫死亡标准：身体僵直，铂丝轻触头部无反应。
图2结果表明，与对照组相比，4mg/ml鹿茸蛋白提取物对线虫存活率有下降趋势但无统计学差异，2mg/ml及以下浓度对a30p线虫的生存没有影响。但是当鹿茸蛋白提取物浓度为8mg/ml时，a30p线虫的生存率为89.54％±9.06％(p＜0.05)。
4)生长发育实验
将同步化后l1期的a30p线虫加入到混有不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml)鹿茸蛋白提取液与op50大肠杆菌的ngm板上。培养线虫48h后，用motic体视显微镜拍照并计算线虫体长，每组统计10条线虫。
a30p线虫体长见图3。图3结果表明，与对照组相比，各浓度给药组线虫体长并无差异。
5)生殖实验
将同步化的l1期a30p线虫加入到混有不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml)鹿茸蛋白提取液与op50大肠杆菌的ngm板上。培养线虫48h到达怀孕期后，转移线虫至新的不含药的ngm板中。每板1条线虫，每组10板。待24h后，移出孕虫。计数每板子代卵的数量。
a30p线虫24h内排卵量见图4，与对照组相比，当给药浓度达到8mg/ml时，a30p线虫产卵量为21.17±8.19(p＜0.05)，4mg/ml药物浓度时有明显的下降趋势但无统计学差异，2mg/ml以下浓度组线虫排卵量并无明显差异。
6)线虫运动和身体弯曲频率实验
将同步化后培养至l4期的a30p线虫加入到混有不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml)鹿茸蛋白提取液与op50大肠杆菌的含有5-氟尿嘧啶的ngm板上。培养线虫3天后，转移线虫至新的不含药的ngm板中恢复1min。观察记录线虫30s内身体弯曲次数，身体呈ω型记为一次弯曲次数。每组统计10只线虫。
a30p线虫运动见图5。图5a为对照组a30p线虫连续6s内运动，线虫身体呈现半圆形转动。图5b为给药2mg/ml组a30p线虫连续6s内运动，线虫身体ω型爬行。
a30p线虫身体弯曲频率见图6，与对照比相比，1mg/ml、2mg/ml以及4mg/ml浓度对线虫身体弯曲频率明显增加，且有统计学差异(p＜0.01)；4mg/ml与其他两组比较有明显差异(p＜0.01)。
7)神经恢复实验
将同步化后培养至l4期的a30p线虫加入到混有不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml)鹿茸蛋白提取液与op50大肠杆菌的含有五氟尿嘧啶的ngm板上。培养线虫3天后，将线虫用2mm叠氮麻醉后转移至含有2％琼脂垫的载玻片上，盖上载玻片。双光子显微镜下观察拍照。每一条点状树突记为1分，每一条线状树突记为2分。统计各组线虫树突评分，每组统计10条线虫。
a30p线虫树突恢复情况如图7-9所示。其中，图7为25倍双光子显微镜下拍摄a30p线虫荧光图片，a为对照组，a30p线虫树突退化；其余给药组树突有不同程度恢复：b、c几乎没有树突恢复，d分别恢复一条线状树突与点状树突，e清晰可见恢复一条线状树突与一条点状树突，f、g分别恢复两条与三条线状树突，h恢复一条点状树突。
图8为各浓度下树突恢复百分率，与对照组相比，0.25mg/ml以上浓度能显著恢复a30p线虫树突比率，0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml恢复比率依次为62.33％±10.79％、56.67％±11.55％、73.67％±5.51％、81.67％±8.51％、86.67％±5.58％、90％±10％，且有统计学差异(p＜0.01)。2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml相比于0.25mg/ml浓度有统计学差异(p＜0.01)。
图9为各浓度下树突计分，1mg/ml及以上浓度对a30p线虫树突恢复评分有明显增长趋势，且有显著统计学差异(p＜0.05)。
本发明所采用的秀丽隐杆线虫由英国brenner提出，被广泛作为模式生物应用。线虫体型小、生命周期短，身体透明容易观察，易于在实验室培养；且基因组序列完全已知，转基因模型线虫种类丰富。
帕金森模型线虫a30p转入了人的α-突触核蛋白，在8个多巴胺神经元中可以检测到pdat-1::egfp荧光(头部6个，即cep和ade神经元，后部区域有2个，即分别是pde神经元)以及多巴胺神经元的前后神经突。并且线虫cep树突的eyfp标记随着生长发育持续减少，3日龄a30p线虫表达eyfp减少90％。符合人类帕金森发病机理，神经元不断退化缺失，并且线虫行为表现为运动障碍，不能正常爬行前进。因此，本发明以a30p线虫作为帕金森病模型研究鹿茸蛋白提取物的毒性作用与药理作用。
对于鹿茸蛋白提取物毒性实验采用三个指标，生存率、体长以及产卵率。生存率是研究药物毒性最直观的评价指标；体长及体宽反映线虫生长发育情况；后代数反映出药物对线虫生殖能力的影响；不同浓度鹿茸蛋白提取物暴露a30p线虫后，8mg/ml鹿茸蛋白提取物降低了a30p线虫的存活率(p＜0.05)，且抑制a30p线虫产卵(p＜0.05)。4mg/ml鹿茸蛋白提取物有降低a30p线虫的存活率及抑制a30p线虫产卵的趋势，但无统计学差异。培养线虫48h后，对线虫体长差异无统计学意义。根据毒性实验结果推测这一现象与药物渗透压有关。鹿茸蛋白提取物多部分为55kd以上大分子蛋白质，蛋白含量为76％。并且随着浓度的增加，渗透压也随之升高。线虫结构简单，皮下组织及肠道共同调节线虫体内渗透压平衡。并且由排泄细胞、导管细胞和孔细胞代替人体“肾”的功能。一旦渗透压平衡被打破，线虫的生理结构功能则会出现异常，甚至吸水胀破而导致死亡。
对于药理实验采用两个指标：评价树突恢复以及评价运动能力。线虫的运动行为能反映其神经系统基本功能，常用线虫的身体弯曲频率作为其运动行为的评价指标。结果表示1mg/ml、2mg/ml以及4mg/ml浓度对线虫身体弯曲频率明显增加，且有统计学显著差异(p＜0.01)，4mg/ml与其他两组比较有明显差异(p＜0.01)。0.25mg/ml及以上浓度能够提高线虫树突恢复比例，1mg/ml及以上浓度对a30p线虫树突恢复评分有明显增长趋势。2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml对a30p线虫树突有明显恢复作用。说明鹿茸蛋白提取物能够保护a30p线虫神经元的退化缺失，恢复a30p线虫运动能力，从而达到治疗a30p线虫帕金森病的目的。综合毒性实验结果及药理实验结果，1mg/ml、2mg/ml以及4mg/ml鹿茸蛋白提取物为安全有效剂量。
本发明以帕金森模型线虫为研究对象，探究了不同浓度鹿茸蛋白提取物对线虫的毒性作用与药理作用，确定了鹿茸蛋白提取物最佳给药浓度，为后续鹿茸蛋白提取物治疗帕金森病提供研究依据。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
1.鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用。
2.鹿茸蛋白提取物在制备治疗秀丽隐杆线虫帕金森药物中的应用，其特征在于，所述鹿茸蛋白提取物的浓度为1-4mg/ml。
3.根据权利要求1所述的鹿茸蛋白提取物在制备治疗帕金森药物中的应用，其特征在于，所述鹿茸蛋白提取物的制备方法如下：
(1)将新鲜鹿茸用液氮速冻，置入超微粉碎机中，加水粉碎至肉糜状，获得鹿茸糜状物；
(2)按照1:10的比例向鹿茸糜状物中加入双蒸水，取冰醋酸调节ph为4，搅拌过夜后离心取上清并浓缩；
(3)将浓缩好的上清液放入透析袋透析脱盐，将除盐的鹿茸蛋白粗提物溶液旋蒸并冻干；
(4)将冻干的鹿茸蛋白粗提物用缓冲液溶解，浓度为30mg/ml；涡旋混匀，用0.22μm的滤膜过滤，进行洗脱，得到鹿茸蛋白提取物；洗脱条件为流速：1.0ml/min，温度20℃；
(5)洗脱后得到的鹿茸蛋白液再次除盐并冻干，得到鹿茸蛋白提取物。
技术总结