本发明属于生物医药领域，特别涉及一种小分子短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用。
背景技术：
痤疮是青春期最常见的毛囊皮脂腺单位的慢性炎症疾病。由于其发病原因比较复杂，所以发病机制尚未完全清楚。目前，患者皮肤皮脂分泌过多、毛囊内角质化异常、在毛囊皮脂腺管中定植的痤疮丙酸杆菌和炎症因子介质被认为在痤疮病变的发展中的关键因素。由于空气污染、现代生活节奏加快造成的压力以及性激素水平不均衡等原因，被痤疮困扰的人群数量有不断上升的趋势。另外某些药物也可通过刺激皮脂腺引起痤疮，特别是皮质类固醇和合成代谢的类固醇，如面部“玫瑰痤疮”的形成就是因为使用含有不良添加剂的护肤品造成的。尽管痤疮不影响正常的行动，但因其多发于面部，对患者的心理和社交影响很大。
处于青春期的男性和女性荷尔蒙分泌都比较旺盛，体内过多的雄激素会刺激皮肤毛囊附近的皮脂腺，使皮脂腺细胞过度增值，增大的皮脂腺分泌出大量的油脂把毛囊堵住。与此同时，皮肤分泌的油酸和棕榈油酸等不饱和脂肪酸能诱导角质化异常和表皮增生，增加角质形成细胞中的钙流入，使毛囊漏斗的近端部内聚力增加，促进角质细胞产生。而在毛囊远端部分的漏斗部，角质细胞和皮脂逐渐蓄积形成粉刺。粉刺是痤疮的早期症状，由于膨胀的粉刺使毛囊壁受损，皮脂和微生物就容易穿透毛囊壁引起中性粒细胞、t细胞的炎症反应。
为了抑制皮脂腺油脂的过度分泌及引起痤疮和毛囊皮脂腺炎症的病原菌，迄今为止有许多已经被广泛利用的方法。在使用抗生素方面常用的是利用克林霉素和红霉素局部治疗痤疮丙酸杆菌的定植，减轻其粉刺形成的促炎作用。除了对痤疮丙酸杆菌的抑制作用外，红霉素可通过其对p-450酶活性的抑制在痤疮的治疗中发挥作用，从而延迟类视黄醇分解代谢并减弱类视黄醇介导的fgfr2b信号转导(ahmadn,mukhtarh.cytochromep450:atargetfordrugdevelopmentforskindiseases[j].journalofinvestigativedermatology,2004,123(3):417-25.)。然而一些临床试验表明长期局部使用红霉素会导致痤疮治疗的疗效逐渐下降(drenob,foulcp,reynauda,etal.effectofzincgluconateonpropionibacteriumacnesresistancetoerythromycininpatientswithinflammatoryacne:invitroandinvivostudy[j].europeanjournalofdermatology:ejd,2005,15(3):152-5.)，这可能与抗生素耐药的丙酸杆菌的发展有关，因此不推荐使用局部抗生素单药治疗。
另外，由于雄激素通过激活皮脂腺细胞的雄激素受体来增加皮脂产生，从而加重痤疮的症状(trifuv,tiplicags,naumescue,etal.cortexolone17alpha-propionate1％cream,anewpotentantiandrogenfortopicaltreatmentofacnevulgaris.apilotrandomized,double-blindcomparativestudyvs.placeboandtretinoin0.05％cream[j].thebritishjournalofdermatology,2011,165(1):177-83.)。同时，资料显示雄激素不敏感或经阉割的雄性由于皮脂分泌减少而不会产生痤疮，更加突出了雄激素和雄激素受体的相互作用在痤疮发生上的重要地位(imperato-mcginleyj,gautiert,cailq,etal.theandrogencontrolofsebumproduction.studiesofsubjectswithdihydrotestosteronedeficiencyandcompleteandrogeninsensitivity[j].thejournalofclinicalendocrinologyandmetabolism,1993,76(2):524-8.)。临床上常用的药物有抗雄性激素类、抗生素类、糖皮质激素类以及维a酸类等药物。其中外用的全反式维a酸、阿达帕林与他扎罗汀是治疗轻度痤疮的首选药物；口服维a酸类药物则主要用于重度痤疮，其能促进表皮细胞更新，改变异常滤泡角质化和促进粉刺溶解，通过调节表皮细胞的增殖和分化，刺激新胶原蛋白形成和成纤维细胞增值并减少炎症(baldwinhe,nighlandm,kendallc,etal.40yearsoftopicaltretinoinuseinreview[j].journalofdrugsindermatology,2013,12(6):638-42.)，逆转上皮异常角化，导致角化细胞黏聚力降低来治疗痤疮，但有致畸作用(marquelingal,zanelt.depressionandsuicidalbehaviorinacnepatientstreatedwithisotretinoin:asystematicreview[j].seminarsincutaneousmedicineandsurgery,2007,26(4):210-20.)；口服抗雄激素类药物能选择性促进雄激素受体的降解(yangz,changyj,yuic,etal.asc-j9amelioratesspinalandbulbarmuscularatrophyphenotypeviadegradationofandrogenreceptor[j].naturemedicine,2007,13(3):348-53.)，主要用于女性患者；糖皮质激素类药物则常用于暴发性痤疮或聚合性痤疮的治疗，但这些药物均有较大的副作用。光疗法比如5-氨基乙酰丙酸光动力疗法治疗痤疮也在部分医院开展，其原理是共生菌能产生大量的光敏物质在一定波长的光照射下，放出单态氧和其他自由基使皮脂腺细胞损伤凋亡(mal,xianglh,yub,etal.low-dosetopical5-aminolevulinicacidphotodynamictherapyinthetreatmentofdifferentseverityofacnevulgaris[j].photodiagnosisandphotodynamictherapy,2013,10(4):583-90.)，故可以用于痤疮的治疗。另外还可通过中医汤药和针灸等方法来治疗痤疮的，但疗程均较长。因此目前迫切需要可以针对痤疮多种病理过程且副作用较少的新药。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种小分子短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用，特别是制备治疗青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种小分子短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用；其中，小分子短肽的氨基酸序列如下所示：lqlqaeer。
所述的痤疮优选为由青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮。
所述的小分子短肽的有效浓度为100±10μg/ml。
所述的产品为医用产品、护肤品或化妆品；优选为医用产品，包括药物等。
所述的产品的制剂类型包括但不限于溶液或干粉；优选为通过将小分子短肽溶于海藻多糖水凝胶获得。
所述的海藻多糖水凝胶优选为通过如下方法获得：将海藻多糖粉末加入到水中，混合均匀，得到海藻多糖水凝胶。
所述的海藻多糖水凝胶中海藻多糖的含量优选为10％(w/w)。
一种小分子短肽在制备抑制皮脂腺过度增殖，减少皮肤油脂分泌，和/或减少皮脂腺细胞中甘油三酯的含量的药物中的应用；其中，小分子短肽的氨基酸序列如下所示：lqlqaeer。
一种小分子短肽在制备抑制人角质形成细胞，人皮肤成纤维细胞，和/或人皮脂腺细胞生长的药物中的应用；其中，小分子短肽的氨基酸序列如下所示：lqlqaeer。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明中的短肽为含有8个氨基酸残基组成的bfgf衍生降解短肽，相对于目前常用的痤疮治疗药物如维a酸，同样能抑制皮脂腺的过度增殖，减少皮肤的油脂分泌，且毒性和副作用更小，适用人群更广，其能够有效地抑制皮脂腺过度增值和减少皮肤油脂分泌，具有良好的透皮性，可用于抗痘方面，特别是用于治疗青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮。
2、目前为止尚无文献报道该序列多肽能用于痤疮的治疗，且由于该短肽仅有8个氨基酸，短肽的稳定性高，能持续作用于治疗部位，使用效果显著，因此具有技术上的先进性。
附图说明
图1是克隆形成实验测定短肽对人角质形成细胞(hacat)、人皮肤成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)的增值抑制作用的结果图。
图2是cck-8法检测短肽对人角质形成细胞(hacat)、人皮肤成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)抑制作用的结果图。
图3是油红o染色法测定人皮脂腺细胞(sz95)的油脂分泌情况的结果图；其中，a为dht对照；b为dht与短肽共培养。
图4是甘油三酯试剂盒检测人皮脂腺细胞中甘油三酯的结果图。
图5是建立兔耳痤疮模型的示意图；其中，a、b为建模前后兔耳皮肤直观图；c、d为建模前后兔耳皮肤微观图；e、f为建模前后兔耳皮肤组织he染色图。
图6是短肽对兔耳痤疮恢复情况的影响图；其中，a为各组药物涂抹兔耳后皮肤恢复情况直观图；b为各组药物涂抹兔耳后皮肤恢复情况微观图；c为各组药物涂抹兔耳后皮肤组织he染色图。
图7是短肽的透皮效果测试结果图；其中，a为白光下观察兔耳毛囊；b为荧光显微镜下观察fitc-p5肽在毛囊的聚集情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所使用的实验材料、试剂等如无特殊说明，均为商业途径获取。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
本发明中涉及的小分子短肽为含有8个氨基酸残基组成的小分子短肽(简称短肽)，该肽来源于碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblalstgrowthfactor,bfgf,又称fgf2)在体内自然降解的肽段，其氨基酸序列为：lqlqaeer；分子量为986.09da；可以采用化学合成的方法获得或通过中国专利(专利号：201410654935.1，名称：一种抗肿瘤小分子多肽及应用)获得。
本发明中培养hacat、hsf和sz95细胞所用培养基为美国hyclone公司的dmem培养基。
实施例1
1、克隆形成实验测定短肽对人角质形成细胞(hacat)、人皮肤成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)的生长抑制作用，其中，人皮脂腺细胞sz95购自苏州北纳创联生物科技有限公司，人角质形成细胞hacat购自上海名劲生物科技有限公司，人成纤维细胞hsf购自上海奥陆生物科技有限公司。
将对数生长期的各组细胞分别用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，稀释到一定倍数后分别接种在6孔板中(1.2×106个/孔)，并轻轻转动，使细胞分散均匀。分别在孔中加入0μm，20μm，100μm和200μm的短肽培养2到3周，弃去培养基后固定细胞，用结晶紫进行染色，拍照观察并对细胞克隆团数量进行计数。
结果如图1所示：实验结果表明短肽能抑制人皮肤的角质上皮细胞(hacat)、成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)的生长。
2、cck-8法检测短肽对人角质形成细胞(hacat)、人皮肤成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)的生长抑制作用
分别取人角质形成细胞(hacat)、人皮肤成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)，按每孔3000个细胞铺96孔板，贴壁后饥饿24小时后，取短肽，按5×倍增浓度(0、0.00256、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40、200μm)处理48小时，之后采用cck-8试剂处理，酶标仪检测各个孔od值。
结果如图2所示，短肽能抑制人角质形成细胞(hacat)、人皮肤成纤维细胞(hsf)和人皮脂腺细胞(sz95)的生长，而且其毒性较弱，高浓度情况下其抑制增殖的能力也仅下调20％左右。说明短肽的对皮肤来源的细胞毒性小。
3、油红o染色法测定人皮脂腺细胞sz95的油脂分泌情况
在6孔板铺下一定量的人皮脂腺细胞sz95后(1.2×106个/孔)，再加入100nm的dht(是二氢睾酮，购买自北京索莱宝科技有限公司)共培养。在实验组加入100μm的短肽处理48小时，弃去培养基后固定对照组和实验组的细胞，加入油红o染色10分钟。之后用60％(v/v)异丙醇水溶液进行漂洗，除去多余染料。最后用苏木素染色20秒，磷酸缓冲液(0.2m，ph7.2)漂洗后在显微镜下进行拍照。
结果如图3所示，从实验结果可以看到短肽处理后的人皮脂腺细胞sz95被染上红色的油滴比较少，说明短肽能抑制人皮脂腺细胞sz95的油脂分泌。
4、人皮脂腺细胞中甘油三酯检测方法
将一定量的皮脂腺细胞sz95接种于6孔板中(1.2×106个/孔)，次日分别向孔里添加不同浓度(20μm，100μm和200μm)的短肽，以不添加短肽为空白对照(control)，孵育48小时后pbs清洗，收集每个孔里的细胞到ep管中，离心弃上清，留细胞沉淀；然后在ep管中加入细胞裂解液冰上裂解30分钟，裂解好的液体不离心，直接抽取部分与工作液混合后测定od值；之后离心裂解液，用bca试剂盒测定细胞的蛋白含量；最后把细胞测出od值和蛋白含量代入甘油三酯试剂盒说明书的公式中，计算出不同药物处理后皮脂腺细胞sz95中甘油三脂的相对浓度。其中：
结果如图4所示，实验结果表明短肽能有较减少皮脂腺细胞sz95中甘油三酯的含量。
5、兔耳痤疮模型的建立
该模型用于检测药物对兔耳皮肤上痤疮恢复的影响。
本实验选取新西兰兔(12周龄普通级雄性新西兰兔，体重2.0～2.5kg，购自广州市花都区花东信华实验动物养殖场)，采用kligman法(americanacademyofdermatologyinvitationalsymposiumoncomedogenicity[j].journaloftheamericanacademyofdermatology,1989,20(2pt1):272-7.)构建痤疮兔耳模型，具体为：
遵照兔耳模型规范kligman法，每日1次用棉签蘸取煤焦油后涂抹在兔耳内侧面无毛范围内，连续15天，并在此期间观察兔耳厚度、硬度、有无红肿，毛囊口是否扩大并有角栓等情况。造模完成后进行拍照和he染色，根据中国痤疮治疗指南(2014修订版)制定的痤疮皮损性质分级和组织病理学检查判定造模成功。
结果如图5所示，结果显示造模后兔耳局部组织明显增厚、变硬且变粗糙。毛囊漏斗部扩张，毛囊口明显见到角栓，呈粉刺状，而且毛囊口隆起，有明显的脱屑，证明兔耳痤疮模型造模成功。
6、短肽对兔耳痤疮恢复情况的影响
待兔耳痤疮模型造模成功后，用10％(w/w)海藻多糖水凝胶(用超纯水溶解海藻多糖粉末混匀成凝胶状)做溶剂制成浓度为100μg/ml的短肽，每天在兔耳涂抹，对照组只是涂抹10％(w/w)海藻多糖水凝胶，空白组不涂抹任何东西，20天后观察各组兔耳痤疮恢复情况，进行拍照和he染色。
结果如图6所示，结果显示短肽能明显改善兔耳痤疮的症状，兔耳的肿胀，表皮角化物、痤疮全部消失，皮脂腺增生程度减轻，毛孔逐渐恢复，可见短肽对兔耳痤疮有显著的修复作用。
7、短肽的透皮效果测试
用带荧光的短肽(短肽委托北京国家纳米科学中心合成；带荧光的短肽(荧光物质是肽上连着的fitc标记)为短肽用荧光染料标记，即将荧光染料通过化学键连接到短肽上；其中，短肽与荧光物质的重量比为50:1；本实验所用由北京国家纳米科学中心合成)涂抹兔(兔耳痤疮模型；构建方法同上)耳皮肤6小时后，采样并进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察皮肤的荧光情况。
结果如图7所示，结果显示短肽能透过毛囊口及漏斗部中的角化物质，并向皮脂腺延伸，说明短肽能直达皮肤的皮脂腺组织起作用，透皮效果良好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>暨南大学
<120>小分子短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>8
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
leuglnleuglnalaglugluarg
15
1.一种小分子短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用，其特征在于，所述的小分子短肽的氨基酸序列如下所示：lqlqaeer。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的小分子短肽的有效浓度为100±10μg/ml。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的产品为医用产品、护肤品或化妆品。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的产品的制剂类型为溶液或干粉。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的产品为通过将小分子短肽溶于海藻多糖水凝胶获得。
6.一种小分子短肽在制备抑制皮脂腺过度增殖，减少皮肤油脂分泌，和/或减少皮脂腺细胞中甘油三酯的含量的药物中的应用，其特征在于，所述的小分子短肽的氨基酸序列如下所示：lqlqaeer。
7.一种小分子短肽在制备抑制人角质形成细胞，人皮肤成纤维细胞，和/或人皮脂腺细胞生长的药物中的应用，其特征在于，所述的小分子短肽的氨基酸序列如下所示：lqlqaeer。
技术总结