本申请涉及一种用于抑制白色念珠菌的制剂。
背景技术：
白色念珠菌又称为白假丝酵母菌，是最常见的条件致病性真菌。主要存在于人体的呼吸道、口腔以及表皮中，正常条件下不会致病，但是当人体的免疫功能低下时，就会致病，进而对人体的黏膜、组织、皮肤等器官造成威胁，引发不同程度的白色念珠菌疾病，轻者引起例如口腔等器官的感染，重则引发人体系统性念珠菌疾病。
白色念珠菌主要是以单细胞生长，革兰氏染色为阳性，但是着色不是很均匀。白色念珠菌由于其良好的适应环境的能力以及众多的毒力因子对宿主造成不同程度的感染而引发疾病。其适应环境的能力包括从周围环境中摄取营养的能力、灵活的抗应激反应、快速适应环境的变化等，其毒力因子主要包括胞外水解酶、形态转换以及表面粘附素等。白色念珠菌黏附到宿主细胞上以后长出菌丝，分泌产生多种酶类，例如水解酶、蛋白酶以及脂酶等，其分泌的水解酶，能够帮助白色念珠菌从外界环境中汲取营养物质。现阶段研究最多的胞外水解酶是胞外天冬氨酸酶(sap)，sap在侵染的过程中发挥着非常重要的作用，例如破坏宿主的细胞膜进而促进黏附作用、消化分子为自身摄取营养、破坏宿主免疫系统进而逃避宿主的攻击等。
白色念珠菌是以单细胞生长的真菌，生长的形态呈椭圆形和卵圆形，能形成芽管。通常情况下，白色念珠菌以孢子、假菌丝和真菌丝三种形态存在，真菌丝是平行笔直的菌丝，假菌丝是一长串的酵母细胞，各个细胞之间相互没有分离，假菌丝容易形成分支状态，这样容易从外界吸收营养。白色念珠菌的菌丝状态能够引起组织感染，其进行表型的转化，意味着致病性也逐渐增加，其表型的转化速度，与致病能力有着紧密的关系，形成的菌丝能帮助自身逃脱免疫细胞的攻击，因此致病性更强。研究表明，白色念珠菌从白色(white)转变为灰色(opaque)时，能够避免宿主细胞的侵袭，进而引发感染，实验证明，白色念珠菌的菌丝相比正常的孢子相致病性更强。有研究学者也证明了白色念珠菌的形态转化后，能避免宿主细胞的吞噬，进而造成宿主细胞的感染。由此可见，白色念珠菌在多种形态之间灵活变化，不仅能帮助其快速适应周围环境变化，还为侵染宿主细胞以及与宿主相互共存奠定了基础。真核酵母细胞表面具有黏附的特性，主要是由于酵母细胞表面携带了不同种类的粘附素，它们可以黏附不同的基质，根据基质产生不同的粘附素，这为真菌适应环境提供了生存的基础。白色念珠菌对宿主的黏附作用意味着感染的发生，在对宿主细胞进行黏附后，菌体会形成菌丝，从而发挥致病作用，若是白色念珠菌无法形成菌丝，其致病力就会明显减弱。
根据《idf全球糖尿病概览》调查表明，糖尿病位于全球的十大致死病因之一，2型糖尿病发病率逐年增加，预估到2030年，全球糖尿病总患者数量将达到5.78亿，而在所有的糖尿病患者中，2型糖尿病(t2dm)患者占比高达90％。近些年来，白色念珠菌引起的真菌感染人数大幅增加，t2dm患者由于其唾液葡萄糖水平的上升导致口腔白色念珠菌明显上调，这严重威胁了人类的健康。口腔防御系统中口腔黏膜上皮是白色念珠菌侵袭的首要部位，其对于口腔上皮细胞具有黏附和破坏作用，黏附到宿主细胞后，菌体出芽长出菌丝，进而引起致病作用。当前临床上对于t2dm患者口腔白色念珠菌感染的治疗缺乏有效的治疗手段，大多是采用口服降糖药或者抗生素治疗等。
随着分子生物学及细胞生物学的发展，糖链的诸多生物功能不断被认识，如糖蛋白糖链、蛋白多糖、糖脂糖链及糖结合蛋白等参与许多重要的生命活动，且还与许多疾病，如癌症、细菌和病毒感染等疾病有着密切的关系。
技术实现要素：
本申请的主要目的是研究一种制剂，能够有效抑制白色念珠菌。
申请人通过研究，发现并明确了以下结论：具有唾液酸(sa)α2-3gal糖链结构的活性成分，对白色念珠菌具有抑制作用，随着唾液酸糖蛋白浓度的升高，其对白色念珠菌生长的抑制作用显著增强。
具体可得出以下方案：
第一方面，一种用于抑制白色念珠菌的制剂，其活性成分包含有saα2-3gal糖链结构(尤其是富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白)。该制剂可直接作用于皮肤表面、口腔等具有潜在白色念珠菌生长的部位。
优选地，制剂类型为喷雾剂或涂膜剂。
优选地，所述saα2-3gal糖链结构源自牛奶。
进一步优选地，所述saα2-3gal糖链结构所属活性成分为从牛奶中分离纯化的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
进一步优选地，所述富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白是基于凝集素mal-ii-磁性微粒复合物或者五羟色胺-磁性微粒复合物从牛奶中分离纯化得到的。
第二方面，具有saα2-3gal糖链结构的活性成分在制备用于抑制白色念珠菌的制剂方面的用途。
优选地，所述具有saα2-3gal糖链结构的活性成分是从牛奶中分离纯化的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
进一步优选地，所述具有saα2-3gal糖链结构的活性成分是基于凝集素mal-ii-磁性微粒复合物或者五羟色胺-磁性微粒复合物从牛奶中分离纯化得到的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
第三方面，牛奶的提取物在制备用于抑制白色念珠菌的制剂方面的用途，所述牛奶的提取物为通过分离纯化得到的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
附图说明
图1为白色念珠菌培养结果。其中，(a)培养至长出乳白色圆形菌落，(b)转移至琼脂平板上，划线菌液变干后，继续培养至长出乳白色菌落。
图2为cal-27细胞培养结果(40×)。
图3为不同物质对白色念珠菌生长曲线的影响。其中，(a)不同浓度唾液酸糖蛋白a对白色念珠菌生长曲线的影响；(b)不同对照蛋白对白色念珠菌生长曲线的影响：分别是control组以及相同浓度(400μg/ml)的唾液酸单体、bsa、去唾液酸蛋白b1(naio4氧化)、去唾液酸蛋白(唾液酸酶)c1、唾液酸糖蛋白a。
图4为唾液酸化糖蛋白对白色念珠菌黏附作用的影响的实验结果。其中，(a)：control组；(b)：50μg/ml唾液酸蛋白a；(c)：100μg/ml唾液酸蛋白a；(d)：200μg/ml唾液酸蛋白a；(e)：200μg/ml去唾液酸蛋白b1；(f)：200μg/ml去唾液酸蛋白c1。merge代表叠加场，dapi代表荧光场，bright代表明场。蓝色的为dapi通道。
图5为唾液酸化糖蛋白对白色念珠菌黏附作用的影响的统计结果。
具体实施方式
以下详细介绍有关本发明的实验分析。当然，申请人关于本发明的研发工作不限于此。
一、实验部分
(1)提取富含半乳糖和唾液酸糖链结构的物质(常规方法)
提取方法一：基于五羟色胺-磁性微粒复合物，从富含唾液酸糖链结构的物料中分离纯化富含唾液酸化的糖蛋白。此唾液酸化的糖蛋白含有saα2-3gal和saα2-6gal糖链结构。具体可参照中国专利文献(五羟色胺-磁性微粒复合物及富集唾液酸化糖蛋白的方法，申请号：201711206127.9)。
提取方法二：凝集素mal-ii和sna-磁性微粒复合物分别分离纯化出富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白和富含saα2-6gal糖链结构的糖蛋白。具体可参照中国专利文献(预防流感病毒的含片，申请号：201610654636.7)。
采用上述提取方法一，从牛奶得到1种提取物，分成3份，分别记为a、b、c。用1mmol/ml的高碘酸钠溶液氧化提取物b，去处其糖链末端的sa，然后记为b1；用α2-3神经氨酸酶(α2-3neuraminidase)处理提取物c，切除其saα2-3gal糖链结构的末端sa，保留其saα2-6gal糖链结构，然后记为c1。
采用上述提取方法二，从牛奶中分别分离纯化出富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白和富含saα2-6gal糖链结构的糖蛋白2种提取物，分别记为d、e。
(2)供试菌株
白色念珠菌(candidaalbicansatcc10231)，购自中国医学菌种保藏中心。
(3)细胞系
cal-27(人舌鳞癌细胞)细胞系在含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗液中的dmem中培养，放置在5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养，直至细胞生长至对数期。
(4)培养基与实验溶液的制备
1)培养基的配制：yma培养基和液体沙氏培养基分别按标准配方配制并在115℃下高温灭菌20min，4℃储存备用。
2)10×pbs缓冲液：0.1mol/lna2hpo4、1.37mol/lnacl、0.027mol/lkcl、0.0176mol/lkh2po4溶于超纯水中，将ph调至7.4，室温储存，使用时稀释至1×pbs。
3)bsa(0.8mg/ml)：称取0.8mgbsa溶于1ml超纯水中，待完全溶解后，-20℃备用。
4)dapi：取2μldapi溶于10ml无菌1×pbs缓冲液中(1:5000)，4℃避光保存。
(5)菌种的保存、活化与接种
1)菌种的保存
取无菌的50ml的离心管，加入10ml液体沙氏培养基，用接种环划取少量的白色念珠菌标准菌株接种到加入了液体沙氏培养基的离心管中，恒温摇床37℃、160rpm培养24h。取1ml白色念珠菌菌液加入1.5ml的无菌离心管中，低温离心后收集菌细胞，加入无菌液体沙氏培养基重悬，再加入80％的甘油溶液，充分混匀后置于-80℃冰箱中保藏备用。
2)菌种的活化与接种
在超净工作台上倾倒yma培养基平板，打开紫外灯并且吹风促进其凝固，然后将从-80℃的冰箱中将保存的白色念珠菌菌种取出，用移液枪吸取少量菌液并转移至培养基平板，用涂布棒涂抹均匀，待菌液变干后将培养皿盖子盖上，倒置放入37℃恒温培养箱培养至长出乳白色圆形菌落(图1a)。然后用接种环沾取少许之后，迅速转移至琼脂平板上并划线，在这个过程中用力不能过大防止将培养基划破，等培养基上的划线菌液变干之后，同上述条件继续培养直至长出乳白色菌落(图1b)。
取50ml的无菌离心管中加入10ml液体沙氏培养基，用接种环在活化好的培养基平板上挑取菌落并转入液体沙氏培养基中，置于恒温摇床37℃、转速160rpm培养24h。培养完毕后用液体沙氏培养基将白色念珠菌菌悬液浓度调整至1×105cfu/ml待用。
(6)cal-27细胞的培养及消化
1)细胞复苏
cal-27细胞是人口腔鳞癌细胞，显微镜下该细胞呈扁平多角形、排列比较紧密，呈铺路石状(图2)。在含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗液中的高糖dmem培养基中培养，并置于5％co2、37℃的恒温细胞培养箱中培养。
从液氮罐中将冻存的cal-27细胞取出，转移到37℃恒温的水浴锅中，让其迅速解冻。离心机低速离心后弃上清，加入高糖dmem培养基并吹吸均匀，随后将液体转移至培养瓶中于上述培养条件下培养。
2)细胞换液及传代
在显微镜下观察细胞的生长情况和培养基的颜色，及时给细胞换液，每2d给细胞换液传代一次。
换液：首先将培养瓶中的旧培养液轻轻倒掉，用无菌1×pbs冲洗2-3遍，洗掉多余的培养基，随后加入新鲜培养液，轻轻晃动培养瓶，放入培养箱，取对数期细胞进行后续的实验。
传代：当细胞生长到贴壁面积为80％左右时，即到达了对数生长期，随后要将细胞进行传代培养。首先将旧培养液轻轻倒掉，用无菌1×pbs冲洗2-3遍，然后将细胞用0.25％的胰蛋白酶进行消化，加入胰蛋白酶后轻摇培养瓶，放入培养箱中反应5min，随后加入培养基终止反应，用枪头轻轻吹吸，将混匀后的细胞培养液全部转移至15ml离心管中，离心弃上清，加入新鲜培养基吹吸均匀使细胞重悬，然后均匀分配到每个培养瓶中，再加入少许新鲜培养基，继续在5％co2、37℃的恒温培养箱中培养至对数期。
3)细胞饥饿培养
在进行黏附实验之前，首先要对细胞进行饥饿培养，无血清培养可使细胞处于饥饿状态，在加入唾液酸蛋白后能更好的吸收，有助于蛋白作用的发挥。
本实验所用到的细胞需要在3.5cm细胞培养皿中进行培养，待培养瓶中的细胞生长至对数期时，用上述相同的方法对细胞进行消化，重新加入新鲜培养基吹吸均匀，保证细胞处于悬浮的状态，吸取200μl加入到细胞培养皿中，用高糖dmem培养基补足体积至990μl，在上述同等条件下培养24h，待细胞贴壁后，缓慢吸掉旧的培养基，换成无血清的dmem培养基，轻轻摇匀，继续在5％co2的培养箱中37℃恒温培养，取对数期细胞进行后续的实验。
(7)唾液酸化糖蛋白对白色念珠菌的抑制作用
用nano-drop测定唾液酸化糖蛋白浓度为0.8mg/ml，并用0.22μm滤膜过滤后得到无菌糖蛋白溶液，-20℃储存备用。将bsa、去唾液酸蛋白溶液浓度调整至0.8mg/ml，-20℃备用。
将96孔板置于超净工作台内，在1-8号孔中依次加入100μl制备好的菌悬液(105cfu/ml)，在1-4号孔中分别加入100μl、50μl、25μl、12.5μl的唾液酸化糖蛋白溶液，使其蛋白终浓度分别为400、200、100、50μg/ml，。5号孔中加入100μl的bsa溶液，6号孔中加入100μl去唾液酸蛋白(naio4氧化)溶液，7号孔中加入100μl用神经氨酸酶处理后的唾液酸糖蛋白(0.8mg/ml)溶液，5-7号孔中蛋白终浓度都为400μg/ml。8号孔中加入100μl无菌水，其余各孔用无菌水补足溶液总体积200μl，各孔菌液终浓度均为103cfu/ml～104cfu/ml。以加了唾液酸蛋白的各孔为实验组，其余孔为对照组，整个实验重复三次。随后将各孔的溶液混合并吹吸均匀后于37℃摇床恒温培养，转速120rpm，每隔12h用酶标仪在595nm处测定各孔od值并记录。
因为96孔板的密封性较好，在培养过程中白色念珠菌产生的co2是通过板内四周空隙排出来的，在37℃条件下，板内的水汽也会被带出板外，这样就会造成96孔板边缘孔内的体积减少。因此以上实验过程中要注意几点：首先在96孔板靠近边缘处的孔中加入200μl无菌水或pbs，避免96孔板在摇动的过程中，实验孔中的液体挥发较快造成蛋白浓度或培养基浓度较高影响测定结果，这样一来，不仅能减少内部各孔水分的损失，还能分析染菌原因；其次，用封口膜将96孔板与盖子衔接处包裹起来，防止温度较高培养基浓度偏高影响结果；此外，将各组溶液加入96孔板后，置于摇床上培养的过程中摇速不能过快，一般为100-130rpm之间，避免各孔之间液体喷洒影响实验结果；最后，在每次测定od值之前，用移液枪在将各孔溶液吹吸均匀，因为随着培养时间的增加，菌液沉淀增加，将溶液混匀再进行测定，能提高测定结果的准确性。
(8)唾液酸化糖蛋白抑制白色念珠菌与cal-27细胞的黏附
白色念珠菌的生长曲线，一般选择对数生长期末，稳定期开始的阶段进行各种特性的研究，因为此阶段的菌体无论从生物学特性以及代谢活性上都是最典型的。因此本实验将白色念珠菌培养至对数末期，进行后续的黏附实验。
在超净工作台下，取15ml无菌离心管，加入2ml无菌液体沙氏培养基和菌液，恒温摇床37℃、摇速160rpm培养至对数生长末期。低温离心20min，转速4000rpm，弃上清，向沉淀中加入1ml无菌1×pbs缓冲液，涡旋混匀，上述条件下再次离心，重复三次，目的是洗去多余的培养基。离心完毕之后，弃上清，加入1ml无菌1×pbs缓冲液重悬，将白色念珠菌菌悬液浓度调整至1×106cfu/ml，4℃备用。
从培养箱中取出生长至对数期的cal-27细胞，并向培养皿中分别加入10μl上述已知浓度的白色念珠菌菌液(106cfu/ml)。再分别加入唾液酸化糖蛋白500μl、250μl、125μl，用无菌水补足体积至2ml，使得蛋白终浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml。再向其他皿中分别加入500μl的bsa、去唾液酸蛋白(naio4氧化)，用无菌水补足体积至2ml，使得菌液终浓度为103cfu/ml～104cfu/ml。以加了唾液酸蛋白的培养皿为实验组，其余各皿为对照组。将以上培养皿缓慢摇匀后于5％co2、37℃的培养箱中培养4.5h，反应结束后，将细胞培养皿从培养箱中取出，进行固定、染色等过程，详细步骤如下：
1)固定：用移液枪将培养皿中多余的培养液沿壁缓缓吸掉，加入1ml无菌pbs冲洗多余的培养液并倒掉，然后迅速加入1ml的4％多聚甲醛溶液，室温反应30min。这个过程为了避免培养皿干掉，要快速清洗，防止细胞离开培养液变形。
2)清洗：待上述反应结束后，用移液枪将多聚甲醛吸掉，用无菌1×pbs缓冲液冲洗多余的多聚甲醛以及未被固定的细胞，摇洗3min×3次。
3)dapi染色：待清洗结束后，吸掉多余的1×pbs缓冲液，加入200μl的dapi染色液，4℃条件下避光反应20min。
4)清洗：待染色结束后，进行清洗，清洗步骤同(2)。清洗完毕后，向细胞培养皿中加入200μl的无菌1×pbs缓冲液，目的是让培养皿底部保持湿润，避免细胞变形。
完成上述步骤后，在倒置荧光显微镜下进行避光拍照，每个培养皿在不同视角下拍3次，最后求取平均值。
(9)数据分析
实验中测得的od595值求取平均值和sd值，并利用graphpadprism8软件作图。荧光显微镜拍的图用photoshop软件调亮度和灰度，接着用imagej软件进行细胞和菌体计数。采用spss软件进行统计学分析，唾液酸糖蛋白对白色念珠菌生长及黏附的抑制作用采用单因素方差分析(以t＝0.05作为显著性检验水平)，两两比较采用最小显著差数法(lsd)法，所得到的p<0.05即表示差异显著。(p<0.05用“*”表示，p<0.01即用“**”表示，p<0.001即用“***”表示)。
二、研究结果
(1)提取方法一提取的唾液酸化糖蛋白
1)对白色念珠菌生长曲线的影响
本实验利用在96孔板中将白色念珠菌与不同浓度的唾液酸糖蛋白a混合培养，每隔12h用酶标仪测定595nm处的吸收峰，实验重复三次，根据每组od595值用graphpadprism8软件绘制唾液酸蛋白对白色念珠菌生长影响的折线图(图3a)。从图中可以看出，在12h以内，不同浓度唾液酸蛋白处理后的白色念珠菌od595值并无显著变化；生长到16h时，除了空白对照组的od595值增加以外，各实验组od595值均无显著变化；而在18h-24h范围内，空白对照组的od595值继续上升，并逐渐到达菌体生长的对数末期，50μg/ml和100μg/ml实验组的od595值也继续增加，但都小于对照组，而200μg/ml和400μg/ml实验组的od595值几乎不变；当培养时间大于24h时，只有400μg/ml实验组的菌体数量不变，其余各组均生长至稳定期。整个过程中，400μg/ml唾液酸蛋白处理后的白色念珠菌od595值几乎不变，可能是蛋白浓度过高，对菌体产生杀菌作用。
以稳定期后的各组od595值进行方差分析，将实验组与对照组进行比较可得知，50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml唾液酸糖蛋白a对白色念珠菌的生长都有显著抑制作用(p<0.001)。由以上结果得知，在同一时间范围内，随着唾液酸化糖蛋白浓度的增加，od595值显著降低，白色念珠菌的生长数量减少，说明唾液酸化糖蛋白a对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，并且呈浓度剂量依赖。按照上述相同的测定方法，检测各对照组对白色念珠菌生长的影响，根据od595值绘制如下曲线(图3b)。由图可知，加入了400μg/ml的bsa和唾液酸单体后白色念珠菌的生长曲线与白色念珠菌正常生长曲线几乎相同，而加入了400μg/ml的去唾液酸蛋白b1和唾液酸酶处理后的糖蛋白c1后的白色念珠菌生长曲线与白色念珠菌正常生长曲线有显著差异(p<0.001)，但是在各蛋白相同浓度下(400μg/ml)，唾液酸蛋白与其他对照组有显著差异(p<0.001)。
综上所述，唾液酸糖蛋白a在浓度范围(400μg/ml)以内，对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，并且当唾液酸糖蛋白浓度到达400μg/ml时，菌体几乎不生长。而相同浓度的bsa、去唾液酸蛋白b1，去saα2-3gal糖链结构末端sa的糖蛋白c1、唾液酸单体对白色念珠菌的抑制作用跟唾液酸糖蛋白a相比较弱，表明，糖蛋白的saα2-3糖链结构对白色念珠菌的抑制在起主要作用。
2)对白色念珠菌黏附的影响
为了检测唾液酸化糖蛋白对白色念珠菌黏附作用的影响，首先将已生长到对数期的细胞与唾液酸化蛋白以及白色念珠菌共同培养4.5h，经过清洗、固定、染色等一系列步骤，在荧光显微镜下拍照得到如图4的实验结果。以不同浓度的唾液酸蛋白和菌体处理后的细胞为实验组，其余各组为对照组。利用imagej软件进行细胞和菌体计数，计算出黏附率(黏附率＝表面有菌黏附的细胞数/细胞总数)，运用graphpadprism8软件绘制柱形图(图5)。由图4可知，随着唾液酸蛋白浓度的升高，白色念珠菌数量减少，并且菌体间的凝聚现象也逐渐减弱，相对应的，黏附在细胞表面的菌体数量也减少，而其余对照组菌体凝聚现象不明显并且数量没有显著变化。将实验组和对照组的黏附率分别与空白对照组进行统计学分析得知，50μg/ml唾液酸糖蛋白a、200μg/ml的去唾液酸蛋白(b1和c1)对白色念珠菌的黏附作用均无显著影响，而200μg/ml、400μg/ml的唾液酸糖蛋白a对白色念珠菌黏附与对照组相比有显著的抑制作用，且差异具有统计学意义(p<0.001)。相同时间内，唾液酸蛋白a抑制组显著大于空白对照组以及其他蛋白组。
综上所述，当唾液酸蛋白a浓度在100μg/ml～200μg/ml范围内时，对白色念珠菌黏附cal-27细胞有显著的抑制作用，并且随着唾液酸蛋白浓度的增加，其对白色念珠菌黏附能力的抑制作用越明显，呈浓度剂量依赖，与此同时白色念珠菌的凝聚现象也不断减弱。
(2)采用上述提取方法二，从牛奶中分别分离纯化出富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d和富含saα2-6gal糖链结构的糖蛋白e。
1)对白色念珠菌生长曲线的影响
与上述同样方法，利用在96孔板中将白色念珠菌与不同浓度的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d混合培养，每隔12h用酶标仪测定595nm处的吸收峰，实验重复三次。在12h以内，不同浓度唾液酸蛋白处理后的白色念珠菌od595值并无显著变化；生长到16h时，除了空白对照组的od595值增加以外，各实验组od595值均无显著变化；而在18h-24h范围内，空白对照组的od595值继续上升，并逐渐到达菌体生长的对数末期，25μg/ml和50μg/ml实验组的od595值也继续增加，但都小于对照组，而100μg/ml和200μg/ml实验组的od595值几乎不变；当培养时间大于24h时，只有200μg/ml实验组的菌体数量不变，其余各组均生长至稳定期。整个过程中，200μg/ml唾液酸蛋白d处理后的白色念珠菌od595值几乎不变，可能是蛋白浓度过高，对菌体产生杀菌作用。
以稳定期后的各组od595值进行方差分析，将实验组与对照组进行比较可得知，25μg/ml、100μg/ml、200μg/ml唾液酸糖蛋白d对白色念珠菌的生长都有显著抑制作用(p<0.001)。由以上结果得知，在同一时间范围内，随着唾液酸化糖蛋白浓度的增加，od595值显著降低，白色念珠菌的生长数量减少，说明富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，并且呈浓度剂量依赖。按照上述相同的测定方法，检测各对照组对白色念珠菌生长的影响，加入了200μg/ml的bsa和唾液酸单体后白色念珠菌的生长曲线与白色念珠菌正常生长曲线几乎相同，而加入了200μg/ml的富含saα2-6gal糖链结构的糖蛋白e对白色念珠菌正常生长曲线有影响，但无显著性差异。
综上所述，富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d，在浓度范围(200μg/ml)以内对白色念珠菌的生长有显著的抑制作用，并且当其浓度到达200μg/ml时，菌体几乎不生长。而相同浓度的富含saα2-6gal糖链结构的糖蛋白e对白色念珠菌正常生长曲线有影响，但无显著性差异，表明，糖蛋白的saα2-3糖链结构对白色念珠菌的抑制在起主要作用。
2)对白色念珠菌黏附的影响
与上述同样方法，检测富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d对白色念珠菌黏附作用的影响，首先将已生长到对数期的细胞与唾液酸化蛋白以及白色念珠菌共同培养4.5h，经过清洗、固定、染色等一系列步骤，以不同浓度的d和菌体处理后的细胞为实验组，其余各组为对照组。随着d的浓度的升高，白色念珠菌数量减少，并且菌体间的凝聚现象也逐渐减弱，相对应的，黏附在细胞表面的菌体数量也减少，而其余对照组菌体凝聚现象不明显并且数量没有显著变化。将实验组和对照组的黏附率分别与空白对照组进行统计学分析得知，25μg/ml唾液d、200μg/ml的e对白色念珠菌的黏附作用均无显著影响，而100μg/ml、200μg/ml的d对白色念珠菌黏附与对照组相比有显著的抑制作用，且差异具有统计学意义(p<0.001)。
综上所述，当富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d在50μg/ml～100μg/ml范围内时，对白色念珠菌黏附cal-27细胞有显著的抑制作用，并且随着唾液酸蛋白浓度的增加，其对白色念珠菌黏附能力的抑制作用越明显，呈浓度剂量依赖，与此同时白色念珠菌的凝聚现象也不断减弱。
三、结论
白色念珠菌主要是经过黏附、菌丝的生长以及生物膜形成等过程侵染宿主细胞，而当白色念珠菌最外侧形成生物膜以后，不仅能降低其对抗菌药物的敏感性，还能躲避宿主免疫系统对其的攻击，对人类的身体健康产生严重的威胁。白色念珠菌感染宿主的第一步就是黏附，黏附作用主要是通过菌体表面的糖蛋白与宿主细胞表面的糖蛋白受体相结合，黏附的物质主要包括甘露聚糖、黏附素和几丁质等。目前临床上大多使用的是抗菌药物，使得白色念珠菌对抗真菌药物产生了耐药性，还会对人身体健康造成影响。因此开发新型无毒无害的药物抑制白色念珠菌生长、黏附作用成为现阶段研究的热点。
实验结果表明：
富含saα2-3gal糖链结构的唾液酸糖蛋白a对于白色念珠菌的生长、黏附能力都有显著的抑制作用。在唾液酸糖蛋白的一定浓度(400μg/ml)范围内，随着糖蛋白浓度的增加，其对于白色念珠菌生长有着一定的抑制作用，并且在唾液酸糖蛋白浓度达到400μg/ml时，白色念珠菌几乎不生长，也能说明400μg/ml是唾液酸糖蛋白的杀菌浓度。再加上其他对照组中蛋白(bsa、去唾液酸蛋白、唾液酸单体)对白色念珠菌生长没有明显的抑制作用，这就进一步说明唾液酸糖蛋白对白色念珠菌生长的抑制作用主要是saα2-3在起作用。
富含saα2-3gal糖链结构的唾液酸糖蛋白d对于白色念珠菌的生长、黏附能力都有显著的抑制作用。当富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d的浓度在50μg/ml～100μg/ml范围内时，不论对白色念珠菌的生长还是黏附，均具有良好的抑制效果。并且在唾液酸糖蛋白浓度达到200μg/ml时，白色念珠菌几乎不生长，也能说明200μg/ml是富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白d的杀菌浓度。
1.一种用于抑制白色念珠菌的制剂，其特征在于：其活性成分包含有saα2-3gal糖链结构。
2.根据权利要求1所述的用于抑制白色念珠菌的制剂，其特征在于：制剂类型为喷雾剂或涂膜剂。
3.根据权利要求1所述的用于抑制白色念珠菌的制剂，其特征在于：所述saα2-3gal糖链结构源自牛奶。
4.根据权利要求3所述的用于抑制白色念珠菌的制剂，其特征在于：所述saα2-3gal糖链结构所属活性成分为从牛奶中分离纯化的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
5.根据权利要求4所述的用于抑制白色念珠菌的制剂，其特征在于：所述富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白是基于凝集素mal-ii-磁性微粒复合物或者五羟色胺-磁性微粒复合物从牛奶中分离纯化得到的。
6.具有saα2-3gal糖链结构的活性成分在制备用于抑制白色念珠菌的制剂方面的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述具有saα2-3gal糖链结构的活性成分为富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述具有saα2-3gal糖链结构的活性成分是从牛奶中分离纯化的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述具有saα2-3gal糖链结构的活性成分是基于凝集素mal-ii-磁性微粒复合物或者五羟色胺-磁性微粒复合物从牛奶中分离纯化得到的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
10.牛奶的提取物在制备用于抑制白色念珠菌的制剂方面的用途，所述牛奶的提取物为通过分离纯化得到的富含saα2-3gal糖链结构的糖蛋白。
技术总结