本发明涉及e1a激活基因阻遏子基因(cellularrepressorofe1a-stimulatedgenes,creg)的医药用途，具体涉及creg蛋白用于制备预防或治疗糖尿病心肌病及相关疾病的药物的用途。
背景技术：
糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病，主要分为1型和2型，其中2型糖尿病尤为常见。2型糖尿病主要表现为胰岛素抵抗伴或不伴有β细胞功能障碍。糖尿病在全球呈广泛流行趋势，世界卫生组织报道，到2025年，全球糖尿病人数将达到5.5亿，2型糖尿病全球发病率为5.4％。中华医学会糖尿病学分会的糖尿病流行病学调查结果显示，2017年我国2型糖尿病患者超过1亿，位居世界首位。其中，30岁以上人群中，2型糖尿病患病率达11.6％。每年有490万人死于糖尿病，其中约50％死于心血管并发症。
糖尿病患者中，不依赖于动脉粥样硬化、高血压及其他潜在病理因素发生的左心室功能障碍性疾病称为糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy，dcm)。糖尿病患者出现心血管并发症风险远远高于非糖尿病患者，死亡率是非糖尿病患者的两倍。研究报道，2型糖尿病患者中，dcm的发病机制主要是心肌细胞自噬功能障碍。发生2型糖尿病时，心肌细胞在高脂和高糖环境下，发生胰岛素抵抗，心肌细胞的能量代谢平衡被打破，细胞内蛋白质和脂质氧化增强，引起细胞自噬功能障碍，主要表现为自噬的最终环节溶酶体及自噬溶酶体数量减少和功能障碍，自噬流不能顺利进行，自噬体堆积，使受损细胞器及有害的代谢产物无法清除，因而导致心肌细胞死亡，发生dcm。
e1a激活基因阻遏子基因(cellularrepressorofe1astimulatedgenes，creg)是1998年发现的一个转录调控基因，其编码的蛋白为高度保守的小分子糖蛋白，主要定位于核周内质网和溶酶体，对胚胎癌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡和分化等发挥重要作用。已有证据表明，creg是一种重要的心肌保护因子。本实验室近年研究发现：(1)creg蛋白在心肌组织中高表达；(2)心肌梗死、血管紧张素ⅱ或缺血再灌注等病理性损伤可使心肌细胞中的creg表达显著下调，补充外源性creg蛋白则可挽救上述病理因素引起的心肌损伤；(3)creg是定位于溶酶体的糖蛋白，可通过调控溶酶体的发生和功能从而影响心肌成纤维细胞自噬功能。但是，creg蛋白在糖尿病心肌病中的作用及机制尚不清楚。
技术实现要素：
本发明的发明人通过大量实验发现，dcm小鼠心肌组织中creg蛋白表达显著下降，左心室舒张功能和收缩功能显著下降，并且出现明显的心肌纤维化。而creg转基因小鼠(creg-tg)建立dcm模型后，左心室舒张功能和收缩功能明显改善，心肌纤维化减轻。creg心肌特异性敲除creg小鼠(creg-cko)建立dcm模型后，左心室舒张功能和收缩功能障碍明显加重，心肌纤维化程度加重。进一步研究发现，在dcm小鼠心肌中自噬底物堆积，溶酶体膜蛋白表达显著下降，自噬功能障碍，而creg-tg小鼠自噬功能得到显著改善，creg-cko小鼠自噬功能障碍加重。以上结果表明，creg蛋白可以用于预防或治疗糖尿病心肌病及相关疾病。本发明基于以上发现而完成。
本发明第一方面涉及creg蛋白或其活性片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗糖尿病心肌病及相关疾病。
本发明还涉及编码creg蛋白或其活性片段的核酸分子、表达creg蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗糖尿病心肌病及相关疾病。
在本发明的实施方案中，所述重组载体含有编码creg蛋白或其活性片段的核酸分子。
本发明还涉及能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调或促进creg蛋白或其活性片段表达上调的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗糖尿病心肌病及相关疾病。
本发明还涉及检测creg蛋白或其活性片段表达水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于糖尿病心肌病及相关疾病的预测和/或治疗效果、预后的评估。
本发明还涉及creg蛋白或其活性片段用于筛选预防和/或治疗糖尿病心肌病及相关疾病的药物的用途。
在本发明的实施方案中，creg蛋白或其活性片段可以作为靶蛋白用于筛选预防和/或治疗糖尿病心肌病及相关疾病的药物；例如能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调和/或促进creg蛋白或其活性片段表达上调的试剂可以作为预防和/或治疗糖尿病心肌病及相关疾病的药物。
本发明还涉及组合物，其含有creg蛋白或其活性片段、编码creg蛋白或其活性片段的核酸分子、表达creg蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞、或者能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调的试剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗糖尿病心肌病。
在本发明的实施方案中，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。
在本发明中，所述载体例如为原核表达载体、真核表达载体、噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为pet载体、pgex载体，所述真核表达载体例如为pcdna3.1、pegfp-c1、ppic9k，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λb，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。
在本发明的实施方案中，其中所述的重组腺病毒载体为人腺病毒5型ad5-creg，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc，武汉,武汉大学)，保藏号为cctcc－v200801。该保藏信息已在中国专利cn101475961a中公开。
在本发明中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。所述细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入重组载体而得到。
在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌dh5α、jm109、top10等，所述真核细胞例如可以为cho细胞、293t细胞、血管平滑肌细胞等，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。
在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的宿主细胞，例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中；或者，可使用脂转染试剂如fugene6、x-tremegene和lipofectamine；或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒病毒载体将核酸引入细胞中。
本发明还涉及试剂盒，其含有检测creg蛋白或其活性片段表达水平的试剂，所述试剂盒用于糖尿病心肌病及相关疾病的预测和/或治疗效果、预后的评估。
在本发明中，所述creg蛋白为重组creg蛋白，来源于哺乳动物，特别是来源于人。在本发明的实施方案中，所述creg蛋白的genbank号为np_003842.1。在本发明的实施方案中，所述creg基因的genbank号为nm_003851.2。
在本发明中，所述creg蛋白的活性片段是指具有creg蛋白功能的片段，其可以为creg蛋白的一部分，也可以为creg蛋白的氨基酸序列经过缺失、添加或替换后得到的片段；制备或得到creg蛋白活性片段的方法为本领域所公知，例如该活性片段为包含creg蛋白与配体或受体结合的部分的片段，或者经过氨基酸的缺失、添加或替换后仍保留creg蛋白功能的片段。本领域技术人员公知，creg蛋白上有一些关键的氨基酸和活性密切相关，突变后会影响蛋白的活性，例如，creg蛋白第136及137位赖氨酸突变为丙氨酸，或者creg蛋白第141-144位氨基酸缺失突变后，都会影响蛋白的活性和功能(sacherm,pnas,2005；102(51):18326-18331)。本领域技术人员可以根据需要避开上述这些可能影响活性的位点，对其它位点进行缺失、添加或替换等改造，使得改造后的creg蛋白仍具有creg蛋白的活性或功能。
在本发明中，所述糖尿病心肌病具有本领域公知的含义，是不依赖于动脉粥样硬化、高血压及其他潜在病理因素发生的左心室功能障碍性疾病称为糖尿病性心肌病。
在本发明中，所述预防和/或治疗糖尿病心肌病是指抑制或减缓糖尿病心肌病及相关疾病的发生。
在本发明中，所述通过检测creg蛋白或其活性片段表达水平用于预测和/或评估是指当血液、组织或细胞中的creg蛋白或其活性片段表达水平低于参考值时，即可以预测糖尿病心肌病及相关疾病发生，或者评估其治疗效果或预后。
在本发明中，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。
在本发明中，可以通过本领域公知的方法检测creg蛋白或其活性片段的表达水平，例如通过聚合酶链式反应扩增creg的mrna并进行定量反应，或者用westernblot检测creg蛋白表达水平。
在本发明中，所述蛋白的表达水平是指mrna的水平或者蛋白的水平。
在本发明中，所述上调/下调组织/细胞中蛋白的表达是指提高或降低组织/细胞中蛋白水平或mrna水平的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者提高大于100％。其中所述的上调或下调是与未干预的组织/细胞(例如转染对照载体组的组织/细胞)进行比较。
在本发明中，所述能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调或促进creg蛋白或其活性片段表达上调的试剂为本领域所公知，例如为能够与creg蛋白或其活性片段结合的配体，或者能够提高creg蛋白表达水平的调控分子，如启动子、增强子等。
附图说明
图1为高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(stz)建立c57bl/6j小鼠dcm模型及心肌组织中creg蛋白及自噬溶酶体蛋白表达检测图，其中(a)c57bl/6j小鼠dcm模型后不同时间点小鼠体重(n＝20，**p<0.01，与wt-nd相比),(b)c57bl/6j小鼠dcm模型后不同时间点空腹血糖(n＝20，**p<0.01，与wt-nd相比),(c)c57bl/6j小鼠dcm模型后12周葡萄糖耐量(n＝20),(d)c57bl/6j小鼠dcm模型后12周胰岛素耐量(n＝20),(e)c57bl/6j小鼠dcm模型后不同时间点左心室舒张功能(n＝20，**p<0.01，与wt-nd相比),(f)c57bl/6j小鼠dcm模型后不同时间点左心室收缩功能(n＝20，**p<0.01，与wt-nd相比),(g)c57bl/6j小鼠dcm模型后24周心肌组织he染色和masson染色,(h)westernblot方法检测c57bl/6j小鼠dcm模型后24周心肌组织creg和自噬溶酶体蛋白表达(n＝3，**p<0.01，与wt-nd相比)。
图2为creg过表达的creg转基因小鼠(creg-tg)建立及心肌组织creg表达检测图，其中(a)creg-tg小鼠载体构建图谱，(b)pcr-genotyping方法鉴定creg-tg小鼠基因型，(c)荧光定量pcr方法检测creg-tg小鼠心肌组织creg基因mrna表达(n＝3，**p<0.01，与wt相比)，(d)westernblot方法检测creg-tg小鼠心肌组织creg表达(n＝3，**p<0.01，与wt相比)。
图3为creg-tg小鼠可改善dcm后心肌舒张功能和收缩功能、心肌纤维化以及心肌自噬功能图，其中(a)creg-tg小鼠dcm模型后不同时间点体重(n＝6，*p<0.05，与wt-hfd stz相比)，(b)creg-tg小鼠dcm模型后不同时间点空腹血糖(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，与wt-hfd stz相比)，(c)creg-tg小鼠dcm模型24周左心室舒张功能(n＝6，**p<0.01，与wt-nd和creg-tg-nd相比；#p<0.05，与wt-hfd stz相比)，(d)creg-tg小鼠dcm模型24周左心室收缩功能(n＝6，*p<0.05，与wt-nd和creg-tg-nd相比；#p<0.05，与wt-hfd stz相比)，(e)creg-tg小鼠dcm模型后24周心肌组织he染色和masson染色，(f)westernblot方法检测creg-tg小鼠dcm模型后24周心肌组织creg和自噬溶酶体蛋白表达(n＝3，**p<0.01，与wt-nd相比；#p<0.05，与creg-tg-nd相比；$p<0.05，与wt-hfd stz相比)。
图4为心肌特异性敲除creg小鼠的建立(creg-cko)及心肌组织creg表达检测图，其中(a)creg-cko小鼠载体构建图谱，(b)pcr-genotyping方法鉴定creg-cko小鼠基因型，(c)荧光定量pcr检测creg-cko小鼠心肌组织creg基因mrna表达(n＝3，**p<0.01，与cregfl/fl相比)，(d)westernblot方法检测creg-cko小鼠心肌组织creg表达(n＝3，**p<0.01，与cregfl/fl相比)。
图5为creg-cko小鼠加重dcm后心肌舒张功能和收缩功能、心肌纤维化以及心肌自噬功能图，其中(a)creg-cko小鼠dcm模型后不同时间点体重(n＝6，*p<0.05，与cregfl/fl-nd相比；#p<0.05，与creg-cko-nd相比)，(b)creg-cko小鼠dcm模型后不同时间点空腹血糖(n＝6，*p<0.05，与cregfl/fl-nd相比；#p<0.05，与creg-cko-nd相比)，(c)creg-cko小鼠dcm模型后24周左心室舒张功能(n＝6，**p<0.01，与cregfl/fl-nd和creg-cko-nd相比；#p<0.05，与cregfl/fl-hfd stz相比)，(d)creg-cko小鼠dcm模型后24周左心室收缩功能(n＝6，*p<0.05，与cregfl/fl-nd和creg-cko-nd相比；#p<0.05，与cregfl/fl-hfd stz相比)，(e)creg-cko小鼠dcm模型后24周心肌组织he染色和masson染色，(f)westernblot方法检测creg-cko小鼠dcm模型后24周心肌组织creg和自噬溶酶体蛋白表达(n＝3，*p<0.05，**p<0.01，与cregfl/fl-nd相比；#p<0.05，与creg-cko-nd相比；$p<0.05，与cregfl/fl-hfd stz相比)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用spss17.0软件包处理。p<0.05为有统计学差异。
实施例1高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(stz)建立c57bl/6j小鼠dcm模型及心肌组织中creg蛋白及自噬溶酶体蛋白表达检测
①c57bl/6j小鼠dcm模型的建立
采用随机表法，将40只雄性8周龄c57bl/6小鼠分为以下2组：正常喂养组(nd)与高脂喂养联合stz组(hfd stz)，每组20只。正常喂养组给予正常饮食饲料喂养(3.85kcal/g，脂肪提供10％热量，美国researchdiet公司)，hfd stz组给予高脂饲料喂养(5.24kcal/g，脂肪提供60％热量，美国researchdiet公司)，喂养4周后给予小剂量stz(25mg/kg.d)，连续注射5天，高脂喂养持续至24周。小鼠喂养条件标准，接受12小时光照，不限制饮食和饮水量。每隔2-4周监测一次体重和空腹血糖。称重前禁食禁水12h。每只小鼠称重3次，记录并取平均值。
结果显示：hfd stz组小鼠在高脂饮食喂养5周时，体重开始高于nd组，随着喂养时间的延长，hfd stz组小鼠体重增加更加显著，具有显著的统计学意义，在高脂喂养第17周时差异最明显(见图1a)。
hfd stz组小鼠在高脂饮食喂养5周时，空腹血糖开始高于nd组，随着喂养时间的延长，hfd stz组小鼠空腹血糖增加更加显著，在第13周时两组差异最显著(见图1b)。
②葡萄糖耐量试验
在高脂饮食喂养12周时，以2g/kg剂量向小鼠腹腔注射总体积0.1ml的葡萄糖水溶液，测定注射后15min、30min、60min及120min鼠尾静脉血的血糖水平，判断胰岛细胞功能。
结果显示：与nd组小鼠相比，在相同时间点，hfd stz组小鼠血糖水平显著升高，提示hfd stz后引起葡萄糖耐量受损(见图1c)。
③胰岛素耐量试验
在高脂饮食喂养12周时，以0.75u/kg剂量向小鼠腹腔注射人胰岛素，测定注射后15min、30min、60min及120min鼠尾静脉血的血糖水平，判断胰岛素抵抗情况。
结果显示：与nd组小鼠相比，在相同时间点，hfd stz组小鼠血糖水平显著升高，提示hfd stz后小鼠发生胰岛素抵抗(见图1d)。
④小动物超声评价小鼠心脏舒张和收缩功能
采用异氟烷麻醉小鼠，用vevo2100型小动物心脏超声仪进行心脏舒张功能和收缩功能检测。同步记录小鼠心电、呼吸等生理参数，心率维持在450次/min左右，心率稳定1min后前胸涂抹耦合剂行超声检查并采集图像，经小动物超声仪自带心功能分析软件进行测量和分析，得出二尖瓣e/a值和射血分数ef％值。
结果显示：与nd组小鼠相比，hfd stz组在高脂饮食喂养13周时舒张功能指标e/a显著降低，在24周时差异最明显(见图1e)；与nd组小鼠相比，hfd stz组在高脂饮食喂养13周时收缩功能指标ef％开始降低，但未出现统计学意义，在24周时两组差异最为显著(见图1f)。以上结果提示，hfd stz组小鼠在高脂饮食13周时出现dcm。
⑤he染色和masson染色评价心肌纤维化情况
he染色：
1)取材心肌组织，经4％甲醛固定后，常规石蜡包埋，5μm切片；
2)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(i)5min→二甲苯(ii)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；
3)苏木素染色5min，自来水冲洗；
4)盐酸乙醇分化30s；
5)自来水浸泡15min；
6)置伊红液2min；
7)常规脱水，透明，封片：95％乙醇1min→95％乙醇1min→100％乙醇(i)1min→100％乙醇(ii)1min→二甲苯(i)1min→二甲苯(ii)1min→中性树脂封固；
8)显微镜下观察形态并照相保存用于统计分析。
masson染色：
1)取材心肌组织，经4％甲醛固定后，常规石蜡包埋，5μm切片；
2)依次自来水和蒸馏水洗；
3)将石蜡切片放入bouin’s液中过夜；
4)流水冲洗2-3h，至黄色完全消失；
5)用weigert铁苏木素液染核20min；
6)流水冲洗30s，1％盐酸乙醇分化；
7)流水冲洗30s，0.2％氨水返蓝；
8)biebrich-sdarlet-acid染色15min；
9)流水冲洗30s，磷酸溶液染色2min；
10)甩掉磷酸，不经水洗，直接用苯胺蓝液染色15min；
11)流水冲洗30s，无水乙醇10s，无水乙醇5min；
12)二甲苯透明、中性树胶封固。
结果显示：与nd组相比，hfd stz组小鼠在高脂喂养24周时，心腔明显扩大，心脏壁变薄、心肌出现纤维化，提示在高脂24周时已经出现明显的dcm心肌损伤(见图1g)。
⑥westernblot检测dcm后24周心肌组织creg和自噬溶酶体蛋白表达
为检测creg及自噬溶酶体蛋白在dcm小鼠心肌组织中的表达情况，提取24周nd组和hfd stz组小鼠心肌组织蛋白，采用bca比色法试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度。用westernblot方法检测creg蛋白和自噬溶酶体蛋白表达。具体如下：将50μg蛋白在95℃煮沸5min后，经12％分离胶行sds-page电泳，判断电泳终止时间。以350ma的电流将样品转到纤维素膜上，时间为45min；在tbs-t稀释的5％脱脂奶粉中常温封闭2h后加入一抗4℃孵育过夜。分别以抗creg抗体(1:1000，美国abcam公司)、抗lc3抗体(1:1000，美国abcam公司)、抗p62抗体(1:1000，美国abcam公司)、抗lamp2抗体(1:1000，美国abcam公司)、抗gapdh抗体(1：1000，美国abcam公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(美国cellsignalling公司)作为二抗，行westernblot检测，用ecl试剂盒(美国amersham公司)发光显影。
结果显示：与nd组相比，hfd stz组在高脂喂养24周时心肌组织creg表达显著降低，自噬底物p62表达明显升高，溶酶体膜蛋白lamp2显著下降(见图1h)，提示dcm后自噬功能抑制。
实施例2creg过表达的creg转基因小鼠(creg-tg)建立及心肌组织creg表达检测
①creg-tg小鼠基因型鉴定：通过中国上海南方模式动物中心建立creg-tg小鼠。采用pcr-genotyping方法按如下反应体系和条件进行分型鉴定
pcr反应体系：(25μl)
pcr反应条件：常规降落pcr程序对上述反应体系进行扩增。
结果显示：采用两对引物对小鼠基因型进行鉴定。当两对引物均扩增出条带时小鼠为creg-tg，当两对引物均未扩出条带时小鼠为野生型。其中1号为阴性对照，2号为阳性对照。根据pcr结果可以看出，4号、7号和10号均为creg-tg小鼠(见图2a-b)。
②与wt小鼠相比，creg-tg小鼠心肌组织中creg表达显著升高
采用荧光定量pcr和westernblot方法对creg-tg小鼠与wt小鼠心肌组织creg的表达进行检测。
1)荧光定量pcr方法检测creg-tg小鼠和wt小鼠心肌组织creg基因mrna水平，方法如下：
采用promega试剂盒提取组织rna，并采用takara逆转录试剂盒进行逆转录反应获取cdna，之后采用sybgreen方法进行定量pcr反应。
定量pcr引物序列如下：
结果显示：与wt小鼠相比，creg-tg小鼠心肌组织中creg基因mrna表达水平显著增加(见图2c)
2)westernblot方法检测creg-tg小鼠和wt小鼠心肌组织creg蛋白水平，具体方法同实施例1。
结果显示：与wt小鼠相比，creg-tg小鼠心肌组织中creg蛋白表达水平显著增加(见图2d)。
实施例3creg-tg小鼠可改善dcm后心肌舒张功能和收缩功能、心肌纤维化以及心肌自噬功能
①creg-tg小鼠dcm模型后体重和空腹血糖水平
creg-tg小鼠和wt小鼠dcm模型建立方法具体见实施例1。高脂喂养持续至24周。小鼠喂养条件标准，接受12小时光照，不限制饮食和饮水量。每组6只。每隔2-4周监测一次体重和空腹血糖。称重前禁食禁水12h。每只小鼠称重3次，记录并取平均值。
结果显示：与nd组相比，不管是wt小鼠，还是creg-tg小鼠，hfd stz组高脂饮食喂养4周时，体重开始高于nd组，随着喂养时间的延长，hfd stz组小鼠体重增加更加显著。与wt-hfd stz组相比，creg-tg-hfd stz组小鼠在高脂饮食喂养4周时体重降低，直至高脂喂养24周时，体重均低于wt-hfd stz组，差异具有统计学意义(见图3a)。
与nd组相比，不管是wt小鼠，还是creg-tg小鼠，hfd stz组高脂饮食喂养4周时，空腹血糖开始高于nd组，随着喂养时间的延长，hfd stz组小鼠体重增加更加显著。与wt-hfd stz组相比，creg-tg-hfd stz组小鼠空腹血糖水平无明显差异(见图3b)。
②小动物超声评价creg-tg小鼠dcm后不同时间点心脏舒张功能和收缩功能
超声方法具体见实施例1。
结果显示：与wt-nd组小鼠相比，wt-hfd stz组在高脂饮食喂养24周时舒张功能指标e/a显著降低；与creg-tg-nd组小鼠相比，creg-tg-hfd stz在高脂喂养24周时e/a显著降低；同时在高脂喂养24周时，creg-tg-hfd stz组e/a要优于wt-hfd stz组，差异具有统计学意义(见图3c)。
在高脂喂养24周时，不管是wt小鼠还是creg-tg小鼠，hfd stz组ef％均明显低于nd组。此外，与wt-hfd stz组小鼠相比，creg-tg-hfd stz组ef％显著升高，具有统计学意义(见图3d)。以上结果提示，creg-tg小鼠可改善dcm后心功能。
③he染色和masson染色评价creg-tg小鼠dcm后24周心肌纤维化情况
he染色和masson染色方法具体见实施例1。
结果显示：与wt-nd和creg-tg-nd组相比，wt-hfd stz组和creg-tg-hfd stz组小鼠在高脂喂养24周时出现心腔扩大，室壁变薄。与wt-hfd stz组相比，creg-tg-hfd stz组心腔扩大和室壁变薄程度有所改善，心肌纤维化程度降低(见图3e)。
④westernblot方法检测creg-tg小鼠dcm后24周心肌组织creg和自噬溶酶体蛋白表达
westernblot具体方法见实施例1。
结果显示：与wt-nd和creg-tg-nd组相比，wt-hfd stz和组creg-tg-hfd stz组高脂喂养24周心肌组织creg均降低，自噬底物p62表达明显升高，溶酶体膜蛋白lamp2显著下降，提示dcm后自噬功能抑制。但与wt-hfd stz组相比，creg-tg-hfd stz组心肌组织p62表达降低，lamp2表达增加，提示creg-tg小鼠可改善dcm心肌自噬功能(见图3f)。
实施例4心肌特异性敲除creg小鼠(creg-cko)的建立及心肌组织creg表达检测
①creg-cko小鼠基因型鉴定：通过上海南方模式动物中心建立creg-cko小鼠。采用pcr-genotyping方法按如下反应体系和条件进行分型鉴定：
pcr反应体系：(25μl)
pcr反应条件：常规降落pcr程序对上述反应体系进行扩增。
结果显示：根据pcr结果可以看出，2号和7号均为creg-cko小鼠(见图4a-b)。
②与cregfl/fl小鼠相比，creg-cko小鼠心肌组织中creg表达显著升高
采用荧光定量pcr和westernblot方法对creg-cko小鼠与cregfl/fl小鼠心肌组织creg的表达进行检测。
1)荧光定量pcr方法检测creg-cko小鼠和cregfl/fl小鼠心肌组织creg基因mrna水平，方法同实施例2。
结果显示：与cregfl/fl小鼠相比，creg-cko小鼠心肌组织中creg基因mrna表达水平显著降低(见图4c)
2)westernblot方法检测creg-cko小鼠和cregfl/fl小鼠心肌组织creg蛋白水平，具体方法同实施例1。
结果显示：与cregfl/fl小鼠相比，creg-cko小鼠心肌组织中creg蛋白表达水平显著降低(见图4d)。
实施例5creg-cko小鼠加重dcm后心肌舒张功能和收缩功能、心肌纤维化以及心肌自噬功能
①creg-cko小鼠dcm模型后体重和空腹血糖水平
creg-cko小鼠和cregfl/fl小鼠dcm模型建立方法具体见实施例1。高脂喂养持续至24周。小鼠喂养条件标准，接受12小时光照，不限制饮食和饮水量。每组6只。每隔2-4周监测一次体重和空腹血糖。称重前禁食禁水12h。每只小鼠称重3次，记录并取平均值。
结果显示：与nd组相比，不管是wt小鼠，还是creg-cko小鼠，hfd stz组高脂饮食喂养4周时，体重开始高于nd组，随着喂养时间的延长，hfd stz组小鼠体重增加更加显著(见图5a)。与cregfl/fl-hfd stz组相比，creg-cko-hfd stz组小鼠体重无明显变化(见图5a)。
与nd组相比，不管是wt小鼠，还是creg-cko小鼠，hfd stz组高脂饮食喂养8周时，空腹血糖开始高于nd组，随着喂养时间的延长，hfd stz组小鼠体重增加更加显著(见图5b)。与cregfl/fl-hfd stz组相比，creg-cko-hfd stz组小鼠空腹血糖水平无明显差异(见图5b)。
②小动物超声评价creg-cko小鼠dcm后不同时间点心脏舒张功能和收缩功能
超声方法具体见实施例1。
结果显示：与cregfl/fl-nd组小鼠相比，cregfl/fl-hfd stz组在高脂饮食喂养24周时舒张功能指标e/a显著降低；与creg-cko-nd组小鼠相比，creg-cko-hfd stz在高脂喂养24周时e/a显著降低；同时在高脂喂养24周时，creg-cko-hfd stz组e/a要明显低于cregfl/fl-hfd stz组，差异具有统计学意义(见图5c)。
在高脂喂养24周时，不管是cregfl/fl小鼠还是creg-cko小鼠，hfd stz组ef％均明显低于nd组。此外，与cregfl/fl-hfd stz组小鼠相比，creg-cko-hfd stz组ef％显著降低，具有统计学意义(见图5d)。以上结果提示，creg-cko小鼠可加重dcm后心功能损伤。
③he染色和masson染色评价creg-tg小鼠dcm后24周心肌纤维化情况
he染色和masson染色方法具体见实施例1。
结果显示：与cregfl/fl-nd和creg-cko-nd组相比，cregfl/fl-hfd stz组和creg-cko-hfd stz组小鼠在高脂喂养24周时出现心腔扩大，室壁变薄。与cregfl/fl-hfd stz组相比，creg-cko-hfd stz组心腔扩大和室壁变薄程度更明显，心肌纤维化程度更重(见图5e)。
④westernblot方法检测creg-cko小鼠dcm后24周心肌组织creg和自噬溶酶体蛋白表达
westernblot具体方法见实施例1。
结果显示：与cregfl/fl-nd和creg-cko-nd组相比，cregfl/fl-hfd stz和组creg-cko-hfd stz组高脂喂养24周心肌组织creg均降低，自噬底物p62表达明显升高，溶酶体膜蛋白lamp2显著下降，提示dcm后自噬功能抑制。但与cregfl/fl-hfd stz组相比，creg-cko-hfd stz组心肌组织p62表达增加，lamp2表达降低，提示creg-cko小鼠可加重dcm心肌自噬功能障碍(见图5f)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
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<110>中国人民解放军北部战区总医院
<120>creg蛋白在预防或治疗糖尿病心肌病的医药用途
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1.creg蛋白或其活性片段在制备用于预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。
2.编码creg蛋白或其活性片段的核酸分子、表达creg蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。
3.能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调或促进creg蛋白或其活性片段表达上调的试剂在制备用于预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。
4.检测creg蛋白或其活性片段表达水平的试剂在制备用于糖尿病心肌病的预测和/或治疗效果、预后的评估试剂盒中的用途。
5.一种用于预防和/或治疗糖尿病心肌病组合物，含有creg蛋白或其活性片段、编码creg蛋白或其活性片段的核酸分子、表达creg蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞、或者能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调的试剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
6.一种用于糖尿病心肌病的预测和/或治疗效果、预后的评估试剂盒，含有检测creg蛋白或其活性片段表达水平的试剂。
技术总结