本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种促进犬发情的药物组合物及其药学应用，所述的药物组合物能促进犬发情与排卵的调控。所述的药物组合物是以一种沙门氏菌为载体制备的抑制素基因疫苗与马绒毛膜促性腺激素(pmsg)的药学组合，联合诱导犬发情与排卵的辅助生殖，从而提高母犬的繁殖能力。
技术背景
本发明的前期工作是制备了一种名为c501(pvax-s/inh-tpa)减毒沙门氏菌，该菌是一种缺失asd基因和crp基因的减毒沙门氏菌，其包含非抗性筛选乙肝表面抗原s基因与抑制素基因(inh)的融合片段，其主要作用是促进动物发情与排卵，可提高动物繁殖力(hanetal.,2014；于垚垚等.,2017)。
姜勋平等(2002)报道了将编码抑制素α(1-32)的基因与pcdna3.1真核表达质粒进行重组，构建得到抑制素基因疫苗pinh，利用该基因疫苗免疫小鼠，结果表明，抗体阳性小鼠比例达30％，与阴性鼠的产仔数、初生重和窝重等并无显著差异(p>0.05)。首次免疫后，抗体阳性小鼠的血浆中fsh浓度略有升高，加强免疫后显著升高(p<0.05)。这些结果表明抑制素pinh基因疫苗可在活体肌细胞中表达，表达产物具有抑制素抗原性，可刺激免疫系统产生抗抑制素抗体，促进fsh的分泌。茆达干等(2006)同样证明了抑制素重组表达质粒免疫动物可以产生抗抑制素抗体，他们用不同剂量质粒pcinh免疫大鼠，发现抗体阳性大鼠占50％。首次免疫10天后阳性鼠血浆fsh浓度显著提高。加强免疫10d后，抗体p/n值没有增加，fsh水平也没有提高，免疫剂量增加并没有提高阳性大鼠的比例。在此研究的基础上，将抑制素α(1-32)基因与乙肝表面抗原s基因串联构建了pcis重组质粒对大鼠进行免疫，结果显示有56％的抗体阳性大鼠，并且大鼠产生的抑制素抗体水平受免疫剂量、免疫次数影响。这为优化抑制素基因免疫方法提供了实验依据。邢朝芳(2005)用双拷贝抑制素与乙肝表面抗原基因的融合质粒pcisi和pegisi对大鼠进行两次免疫，分别得到23.3％和20％抗体阳性率。对抑制素抗体水平及阳性鼠的抗体水平分析发现，50μg剂量的pcisi对大鼠进行免疫，产生的抗体水平最高，抗体阳性率最高达到70％；利用100μg剂量的pegisi对大鼠进行免疫，产生的抗体水平最高，抗体阳性率最高达40％。由此可见，免疫剂量的增加与抗体阳性鼠比例的提高不一定呈正相关。抑制素基因免疫大鼠后还可提高血浆中fsh、e2、p水平。韩丽(2014)等在抑制素基因疫苗基础上引入非抗性筛选平衡致死系统，构建了抑制素平衡致死载体系统asd-crp-c500(pvax-asd-is)。经过对重组菌株的生长特性和毒力测定等鉴定，表明asd-crp-c500(pvax-asd-is)平衡致死载体系统构建成功；进一步将asd-crp-c500(pvax-asd-is)免疫小鼠后，发现能有效诱导小鼠的发情，并提高了小鼠产仔数。王亚平等(2017)在上述抑制素基因疫苗研究基础上，引入tpa信号肽和平衡致死系统，构建了新型c500(pvax-s/inh-tpa)质粒载体，免疫小鼠后，发现试验组(μg)能够诱导小鼠并未呈现明显规律。从繁殖结果来看，inh疫苗中剂量组(10产仔数显著高于其他组，免疫效果最好。
然而，上述抑制素疫苗只在实验动物(如小鼠、大鼠)或大家畜(如牛、羊)中进行了应用，尚未推广应用于犬和猫等。
马绒毛膜促性腺激素(ecg)，旧称孕马血清促性腺激素(pmsg)，是从妊娠母马血清中分离纯化的促性腺激素，由早期妊娠母马子宫内膜杯状结构的滋养层所分泌，pmsg具有fsh和lh两种生物活性，但主要以fsh的作用为主，pmsg可刺激雌性动物的卵泡发育，促进排卵和黄体的形成等作用。邢华(2006)的研究表明，单次小剂量注射pmsg(150iu～300iu)不能有效地诱导母犬发情和排卵，大剂量(500iu)虽可有效地诱导母犬发情及排卵，但受胎率较低。张玉西等人(2007)应用pmsg诱导经产母犬，发情率仅有43.8％，受孕率为23.8％，由此可见，单独使用pmsg诱导母犬发情的效果并不理想。
有鉴于此，本发明以抑制素基因疫苗与马绒毛膜促性腺激素的药学组合，旨在促进犬的发情，提高母犬的繁殖能力及其辅助生殖的药学应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以抑制素基因疫苗与马绒毛膜促性腺激素(pmsg)的药学组合，通过联合免疫犬，达到更好地促进发情排卵效果的目的。在本发明中，申请人利用抑制素基因疫苗结合马绒毛膜促性腺激素对犬进行免疫，以免疫后犬的抗体水平、激素分泌、发情率和受胎率作为指标，评估抑制素基因疫苗与pmsg联合免疫联合诱导犬发情受胎的效果，并筛选最佳免疫程序。
本发明的技术方案如下所述：
一种促进犬发情与排卵的药物组合物，是将100mg的抑制素基因疫苗与330iu的马绒毛膜促性腺激素药物配置成药学组合。该药学组合对犬的免疫方法为：利用抑制素基因疫苗(inh)对犬进行首次肌肉免疫，7天后再加强免疫一次，12天后立即注射330iu的马绒毛膜促性腺激素(pmsg)，以促进母犬的发情与排卵能力。。
本发明的效果：
本发明获得了一种新型抑制素基因疫苗联合马绒毛膜促性腺激素(pmsg)诱导犬发情的药物混配的组合物，该药物组合物能同时诱导动物机体产生抗抑制素抗体，降低内源性抑制素的浓度，进而解除其对fsh的抑制作用，并联合pmsg，达到促进犬发情排卵的效果。在“比格犬”的免疫实验中，本发明以330iu的马绒毛膜促性腺激素(pmsg)药物与100mg抑制素基因疫苗配置成药学组合，给发情期的犬给药取得最佳免疫效果。
附图说明
图1：不同剂量抑制素疫苗诱导犬产生的igg抗体滴度。
图2：不同剂量抑制素疫苗诱导犬产生的雌激素水平。
图3：不同剂量抑制素疫苗诱导犬产生的孕激素水平。
具体实施方式
实施例1：抑制素基因疫苗对犬的免疫效果
(1)抑制素基因疫苗来源及其制备方法
以减毒沙门氏菌为载体的抑制素基因疫苗c501(pvax-s/inh-tpa)来自华中农业大学动物科技学院动物繁殖实验室，相关制备方法参见文献:于垚垚等，2017)。制备方法如下：将鉴定正确的疫苗菌c501(pvax-s/inh-tpa)加入至250mllb液体培养基中扩大培养，37℃下200r/min振荡培养14h。使用质粒去内毒素大提试剂盒大量提取质粒，测质粒浓度，酶切及测序验证。根据需要，所得质粒采用生理盐水稀释至不同浓度，分装后-20℃储存备用。
(2)实验动物及分组
选择发情周期正常、健康的成年比格犬36只，胎次在3胎以内，体重均无显著差异，由公安部南昌警犬基地提供，并饲养于福州黄山海峡搜救犬驯养基地。经体检与编号后分别圈养在阳光充足且独立的犬舍中。将36只比格犬，按照初始体重，每组6只分为6组饲养(表1)，其中t1-t5组为试验组，分别免疫pmsg或不同剂量的抑制素基因疫苗，t6组为对照组，注射相同剂量的生理盐水(表2)。
表1试验犬初始体重及年龄
表2抑制素基因疫苗与pmsg联合免疫程序
(3)采血
免疫前对受试犬进行静脉采血，离心得到血清样品，做好标记并储藏在冰箱；疫苗免疫后，每隔2天采血1次，离心得到血清样品，做好标记并储藏。每只犬得到21次血样后统一进行elisa检测抗体与激素水平。
(4)elisa方法检测抗体
因t1组和t6组犬只未进行抑制素基因疫苗免疫，故只对t2～t5组进行elisa检测。检测方法参照刘青报道的方法(刘青,2016)操作过程稍作改动，用elisa方法检测抑制素免疫后比格犬体内抑制素抗体的生成情况，具体步骤如下：
1)以化学合成的抑制素片段(由合肥国肽生物科技有限公司合成)作为标准抗原，96孔elisa板用100ng/100μl的抗原包被，4℃冰箱放置12h。
2)每孔加入200ul，pbst(pbs与土温-20按照体积比为2000:1比例配制)洗涤包被板6次后，37℃放置2h。
3)随后，弃去孔中液体，将本研究采集的血清样本用pbs(磷酸盐缓冲液，配方：0.01mpbs粉末1包加ddh2o定容至2000ml)按体积比进行倍比稀释(1:25、1:50、1:100、1:200、1：400、1:800、1:1600、1:3200)后，各取100μl加入孔中，37℃孵育1h后弃去孔中液体。
4)用pbst洗板6次后，以hrp标记的兔抗犬igg(购于solarbio科技有限公司)为二抗，用pbs以体积比为1:1000或1:2000稀释，每孔添加100μl，37℃孵育1h后弃去孔中液体，洗涤6次。
5)避光条件下每孔添加100μltmb，37℃显色15min。
6)显色后每孔添加50μl2mh2so4立即终止反应，读取od450值。在同一稀释倍数下，若样本血清的od450值>阴性血清od450平均值 2*标准差(sd)，则此稀释倍数即为样本血清的最终抗体滴度，判定为阳性，反之为阴性(参见hanetal.2014报道的方法)。
(5)试验结果
用抑制素基因疫苗免疫犬后，从第4天开始产生抑制素特异性抗体(inh-igg)，随着免疫时间的增加，抗体呈现逐渐上升的趋势，至免疫后第20天，t4和t5的抗体水平趋于平稳，一直持续至42天；而t2组诱导的抗体在免疫后30天呈现逐步降低的趋势；t3组在免疫后28天呈现先降低后升高趋势(见图1)。
实施例2：抑制素基因疫苗联合pmsg对犬类固醇激素的分泌
(1)疫苗的制备、动物的免疫及分组、采血步骤同实施例1。
(2)雌激素与孕酮的测定：
采用双抗体夹心elisa方法检测犬血中雌二醇和孕酮的水平。具体步骤如下：
1)将酶标板取出，设一个空白对照孔、不加任何液体；每个标准点依次各设两孔，每孔加入相应标准品50μl；其余每个检测孔直接加待测标本50μl。
2)每孔加入酶结合物50μl(空白对照孔除外)，再按同样的顺序加入抗体50μl，充分混匀，贴上不干胶封片，置37℃温育1h。
3)手工洗板，弃去孔内液体。洗涤液注满各孔，静置10s甩干，重复三次后拍干。
4)每孔加显色剂a液50μl，显色剂b液50μl，震荡混匀后，37℃避光显色15min，每孔加终止液50μl。
5)用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(od值)，在反应终止后10min内进行检测；
6)将标准品及样品od值减去空白孔od值后处理数据，以标准品浓度为纵坐标，od值为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程；将样品od值代入方程式，计算样品浓度。若样品检测前进行过稀释，最后计算时需要乘以相应的稀释倍数，即为样品实际浓度。
(3)结果分析：
由图2可以看出，试验组在免疫后9-12天雌激素水平达到高峰，之后开始下降。抑制素基因疫苗免疫犬后，t2、t3、t4组雌激素水平较其它组有上升，其中t3组全期雌激素水平最高，而t2组雌激素水平在前期较高。孕酮整体水平在免疫后期有所升高，其中，抑制素免疫组孕酮水平高于其它非免疫组，t4组孕酮水平最高。
实施例3：抑制素基因疫苗联合pmsg对犬发情与受胎的影响
按照组别记录首次免疫日期，每天对每只犬进行密切观察，观察到母犬外阴部红肿、滴血时判断其为发情状态。发情1周后让其自然交配。记录发情日期、配种日期、产仔日期与产仔数。结果见表3。根据表3可看出，t2和t4组的母犬的发情率最高，达到66.7％，而抑制素基因疫苗单独免疫组(t5)母犬的的发情率最低，提示抑制素基因疫苗和pmsg配合能够显著提高母犬的发情率。
表3不同剂量抑制素基因疫苗联合pmsg对犬发情及受胎的影响
从情期受胎率来看，t2、t3、t5组的母犬的受胎率均为100％，pmsg单独免疫组与对照组的母犬的受胎率最低，且t2、t3、t5组的母犬的受胎率极显著高于t1组和c组(p<0.05)。可见，以330iupmsg配合100mg抑制素基因疫苗组合获得了最佳的发情率、情期受胎率以及产仔数，该组别受试的母犬繁殖力最高。
主要参考文献
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1.一种促进犬发情排卵能力的药物组合物，其特征在于，将100mg抑制素基因疫苗与330iu的马绒毛膜促性腺激素(pmsg)配置成药学组合。
2.权利要求1所述的药物组合物在犬辅助生殖中的药学应用，其特征在于，所述的药学应用包括：先用抑制素疫苗免疫犬，7天后加强免疫1次，12天后注射马绒毛膜促性腺激素(pmsg)，以促进母犬的发情与排卵能力。
技术总结