本发明属于医药领域，具体涉及一种糖脂类抗原注射液及其制备方法。
背景技术：
nkt(naturalkillert)细胞是一群细胞表面既有t细胞受体tcr，又有nk细胞受体的特殊t细胞亚群。nkt细胞具有免疫调节和细胞毒作用，nkt细胞受到刺激后，可以分泌大量的il-4，ifn-γ，gm-csf，il-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用。同时，nkt细胞也是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。因此，nkt细胞对于肿瘤等重大疾病的治疗表现出很大的前景。
nkt细胞疗法实现方式之一：通过抽取患者自身血液进行体外培养，培养采得的白血球中含有单球细胞，采用特殊物质使nkt细胞活化，然后再回输到病人体内。这种方法耗时且成本高昂，难以在临床上普及。nkt细胞疗法的另一种方式是在体激活，即直接对病人给以nkt激活剂来实现。这种方法操作简便，成本低廉，具有较强的临床应用潜力。
研究证实，nkt的激活主要通过识别糖脂类抗原(如α-半乳糖基神经酰胺)来实现。然而，这些糖脂类抗原水溶性极差，为临床引用带来不便。另外，即使将这些糖脂类抗原通过加入潜溶剂等方式进行溶解后，体内实验发现，多次静脉注射这些水溶抗原分子可造成nkt细胞的失效。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种糖脂类抗原注射剂，其组成包括糖脂类抗原、增溶剂和注射溶剂，所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：10～1000mg：0.1～20ml；
所述糖脂类抗原为α-半乳糖基神经酰胺和/或β-半乳糖基神经酰胺。
进一步地，所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：50～500mg：1～10ml。
更进一步地，所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：50～250mg：1～2ml。
更进一步地，所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：200mg：2ml。
进一步地，所述增溶剂选自磷脂、胆盐、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的一种或多种。
更进一步地，所述增溶剂选自磷脂、胆盐、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的多种。
更进一步地，所述增溶剂为胆盐、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的任意一种与磷脂的组合；所述组合中磷脂质量浓度为20～50％，优选50％。
更进一步地，所述增溶剂为磷脂与胆盐的组合。
进一步地，所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化磷脂中的一种或多种；所述胆盐为脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钾、甘氨胆酸钠、甘氨胆酸钾的一种或多种。
进一步地，所述注射溶剂为注射用水、氯化钠注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液中的任一种，优选注射用水。
本发明还提供了一种前述注射剂的制备方法，它包括以下步骤：
(1)按照前述配比称取原料；
(2)取糖脂类抗原和增溶剂，加有机溶剂溶解，减压除去有机溶剂，加注射溶剂复溶，活性炭吸附，过滤，灌装，灭菌，即得糖脂类抗原注射液。
进一步地，步骤2)所述有机溶剂为氯仿或体积比1：3的氯仿和无水乙醇混合溶液；所述灭菌温度110℃，时间30min。
进一步地，步骤2)所述注射液冷冻干燥制得冻干粉针；所述冷冻干燥程序为：-40℃预冻4h，再-40℃真空干燥24h，最后20℃真空干燥8h。
本发明最后提供了一种前述注射剂在制备预防和/或治疗恶性肿瘤、病毒感染、调节免疫功能的药物中的用途。
本发明糖脂类抗原注射剂，将糖脂类抗原(如α-半乳糖基神经酰胺)通过高分子辅料制备成纳米胶束，不仅可以实现这些抗原的增溶，而且还避免了其多次给药造成的nkt失效的问题。本发明糖脂类抗原注射剂制备方法简单，易于推广应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明α-半乳糖基神经酰胺注射液(a1)的制备
称取α-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，大豆卵磷脂200mg，甘氨胆酸钠200mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿/无水乙醇(1:3,v/v)混合液溶解，通过旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，加入注射用水4ml，使其完全溶解，加活性炭吸附，过滤，灌装，高压湿热灭菌(110℃，30min)，即得α-半乳糖基神经酰胺注射液。经激光粒度仪测定，注射液的粒径为16±3nm。
实施例2、本发明α-半乳糖基神经酰胺注射液(a2)的制备
称取α-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂500mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml，使其完全溶解，活性炭吸附，过滤，灌装，高压湿热灭菌(110℃，30min)，即得α-半乳糖基神经酰胺注射液。经激光粒度仪测定，注射液的粒径为22±5nm。
实施例3、本发明α-半乳糖基神经酰胺注射液(a3)的制备
称取α-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂100mg，聚氧乙烯蓖麻油100mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪减压除去有机溶剂，加入注射用水2ml，使其完全溶解，加活性炭吸附，过滤，灌装，高压湿热灭菌(110℃，30min)，即得α-半乳糖基神经酰胺注射液。经激光粒度仪测定，注射液的粒径为40±7nm。
实施例4、本发明α-半乳糖基神经酰胺注射液(a4)的制备
称取α-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂20mg，大豆卵磷脂80mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml，使其脱膜，通过探头超声，直至成具有乳光的液体，加活性炭吸附，过滤，灌装，高压湿热灭菌(110℃，30min)，即得α-半乳糖基神经酰胺注射液。经激光粒度仪测定，注射液的粒径为146±10nm。
实施例5、本发明β-半乳糖基神经酰胺注射液(a5)的制备
称取β-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂50mg，大豆卵磷脂200mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml，使其脱膜，通过探头超声，直至成具有乳光的液体，加活性炭吸附，过滤，灌装，高压湿热灭菌(110℃，30min)，即得β-半乳糖基神经酰胺注射液。经激光粒度仪测定，注射液的粒径为126±8nm。
实施例6、本发明β-半乳糖基神经酰胺冻干粉针剂(a6)的制备
取实施例1制备的α-半乳糖基神经酰胺注射液，冷冻干燥(-40℃预冻4h，然后-40℃条件下抽真空干燥24h，温度调节至20℃，保持真空干燥8h)得冻干粉针。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1、本发明α-半乳糖基神经酰胺注射液多次给药刺激nkt细胞产生ifn-γ
取c57bl/6小鼠40只，分为三组，每组8只，通过尾静脉注射的方式，分别给予每组动物a1-a5、α-半乳糖基神经酰胺溶液(溶于含有1％dmso的pbs中)及生理盐水。(计量为2微克每只)每隔2周注射一次，注射三次。分别于每次注射后的24h测定动物血清中ifn-γ，具体结果见表1。
表1.α-半乳糖基神经酰胺多次激活nkt产生ifn-γ(pg/ml)
从表1可见：本发明制备的α-半乳糖基神经酰胺注射液即使多次给药后也不会造成nkt的失效，而α-半乳糖基神经酰胺溶液除了第一次给药可以激活nkt产生大量的ifn-γ，多次给药后可造成nkt失效，从而不能有效产生ifn-γ。这一结果进一步证明将α-半乳糖基神经酰胺制备成纳米注射液(而非简单的溶液)的必要性。
对比例1、α-半乳糖基神经酰胺注射液的制备
称取α-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，大豆卵磷脂5mg，甘氨胆酸钠5mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿/无水乙醇(1:3,v/v)混合液溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml。药物无法完全溶解。
对比例2、α-半乳糖基神经酰胺注射液的制备
称取α-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂10mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml。药物无法完全溶解。
对比例3、β-半乳糖基神经酰胺注射液的制备
称取β-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，大豆卵磷脂5mg，甘氨胆酸钠5mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿/无水乙醇(1:3,v/v)混合液溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml。药物无法完全溶解。
对比例4、β-半乳糖基神经酰胺注射液的制备
称取β-半乳糖基神经酰胺注射液2mg，聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂10mg，置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入注射用水4ml。药物无法完全溶解。
从对比例1～4可见：糖脂类抗原与增溶剂的质量比高于1：10，其组成的混合物不易溶于注射用水中，药物制剂的质量不佳。
综上，本发明所制备的糖脂类抗原注射液不仅解决其水不溶问题，而且可以避免其造成多次给药造成的nkt失效的问题，使糖脂类抗原在免疫治疗中的应用得到提升。
1.一种糖脂类抗原注射剂，其特征在于：其组成包括糖脂类抗原、增溶剂和注射溶剂，所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：10～1000mg：0.1～20ml；
所述糖脂类抗原为α-半乳糖基神经酰胺和/或β-半乳糖基神经酰胺。
2.根据权利要求1所述的注射剂，其特征在于：所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：50～500mg：1～10ml。
3.根据权利要求2所述的注射剂，其特征在于：所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：50～250mg：1～2ml。
4.根据权利要求3所述的注射剂，其特征在于：所述糖脂类抗原、增溶剂与注射溶剂的重量体积比为1mg：200mg：2ml。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的注射剂，其特征在于：所述增溶剂选自磷脂、胆盐、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的注射剂，其特征在于：所述增溶剂选自磷脂、胆盐、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中多种。
7.根据权利要求6所述的注射剂，其特征在于：所述增溶剂为胆盐、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的任意一种与磷脂的组合；所述组合中磷脂质量浓度为20～50％，优选50％。
8.根据权利要求7所述的注射剂，其特征在于：所述增溶剂为磷脂与胆盐的组合。
9.根据权利要求8所述的注射剂，其特征在于：所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化磷脂中的一种或多种；所述胆盐为脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钾、甘氨胆酸钠、甘氨胆酸钾的一种或多种。
10.根据权利要求1～4任意一项所述的注射液，其特征在于：所述注射溶剂为注射用水、氯化钠注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液中的任意一种，优选注射用水。
11.权利要求1～10任意一项所述注射剂的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)按照权利要求1所述配比称取原料；
(2)取糖脂类抗原和增溶剂，加有机溶剂溶解，减压除去有机溶剂，加注射溶剂复溶，活性炭吸附，过滤，灌装，灭菌，即得糖脂类抗原注射液。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所述有机溶剂为氯仿或体积比1：3的氯仿和无水乙醇混合溶液；所述灭菌温度110℃，时间30min。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所述注射液冷冻干燥制得冻干粉针；所述冷冻干燥程序为：-40℃预冻4h，再-40℃真空干燥24h，最后20℃真空干燥8h。
14.权利要求1～10任意一项所述的注射剂在制备预防和/或治疗恶性肿瘤、病毒感染、调节免疫功能的药物中的用途。
技术总结