本发明属于医药领域，具体涉及一种α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳及其制备方法。
背景技术：
nkt(naturalkillert)细胞是一群细胞表面既有t细胞受体tcr，又有nk细胞受体的特殊t细胞亚群。nkt细胞具有免疫调节和细胞毒作用，nkt细胞受到刺激后，可以分泌大量的il-4，ifn-γ，gm-csf，il-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用。同时，nkt细胞也是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。因此，nkt细胞对于肿瘤等重大疾病的治疗表现出很大的前景。
nkt细胞疗法实现方式之一：通过抽取患者自身血液进行体外培养，培养采得的白血球中含有单球细胞，采用特殊物质使nkt细胞活化，然后再回输到病人体内。这种方法耗时且成本高昂，难以在临床上普及。nkt细胞疗法的另一种方式是在体激活，即直接对病人给以nkt激活剂来实现。这种方法操作简便，成本低廉，具有较强的临床应用潜力。
研究证实，nkt的激活主要通过识别糖脂类抗原(如α-半乳糖基神经酰胺)来实现。然而，这些糖脂类抗原水溶性极差，为临床引用带来不便。另外，即使将这些糖脂类抗原通过加入潜溶剂等方式进行溶解后，体内实验发现，多次静脉注射这些水溶抗原分子可造成nkt细胞的失效。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺0.01～20g，注射用油50～500g，乳化剂1～100g，等渗调节剂5～100g，余量为注射用水。
进一步地，每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺0.1～10g，注射用油100～300g，乳化剂5～50g，等渗调节剂10～80g，余量为注射用水。
更进一步地，每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺1～8g，注射用油100～300g，乳化剂10～15g，等渗调节剂20～30g，余量为注射用水。
更进一步地，每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺3g，注射用油300g，乳化剂12g，等渗调节剂22.5g，余量为注射用水。
进一步地，所述注射用油为大豆油、中链甘油三酯、花生油、橄榄油、鱼油中的一种或多种；
更进一步地，所述注射用油为大豆油、中链甘油三酯、橄榄油、鱼油中的一种或多种；
更进一步地，所述注射用油为大豆油、大豆油/中链甘油三酯组合物、大豆油/中链甘油三酯/橄榄油/鱼油组合物。
更进一步地，所述大豆油/中链甘油三酯组合物中大豆油与中链甘油三酯质量比为1：1～3，优选1：1；所述大豆油/中链甘油三酯/橄榄油/鱼油组合物中大豆油、中链甘油三酯、橄榄油和鱼油质量比为3:3:2.5:1.5。
进一步地，所述乳化剂为卵磷脂、氢化磷脂、油酸钠、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的一种或多种；
更进一步地，所述乳化剂为卵磷脂、泊罗沙姆188、油酸钠、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的一种或多种；
更进一步地，所述乳化剂为卵磷脂。
进一步地，所述卵磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂中的一种或多种。
进一步地，所述等渗调节剂为葡萄糖、氯化钠、甘油、木糖醇中的一种或多种；
更进一步地，所述等渗调节剂为葡萄糖、甘油中的一种或多种；
更进一步地，所述等渗调节剂为甘油。
进一步地，所述脂肪乳的ph值为4～9；优选地，ph为5～7；更优选地，ph为6.5。
更进一步地，所述脂肪乳的ph值调节剂为氢氧化钠溶液。
本发明还提供了一种前述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)按配比称取原料；
(2)取注射用油，混匀，加热至60-80℃，再加入α-半乳糖基神经酰胺和乳化剂，5000-6000r/min搅拌，得油相；取注射用水，加等渗调节剂，加热至60-80℃溶解，得水相；
(3)将步骤(2)油相加入水相中，10000-12000r/min搅拌5～10min，再800～1000bar均质8～10次，最后调ph值，灌封，灭菌，即得。
本发明还提供了一种α-半乳糖基神经酰胺冻干粉针剂，它是由前述α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳冷冻干燥制备而成。
本发明最后提供了一种前述α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳或前述α-半乳糖基神经酰胺冻干粉针剂在制备预防和/或治疗恶性肿瘤、病毒感染、调节免疫功能的药物中的用途。
本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，将α-半乳糖基神经酰胺通过乳化剂乳化制备成乳剂，不仅稳定性高，还可以实现这些抗原的增溶，而且还避免了其多次给药造成的nkt失效的问题。本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳制备方法简单，易于推广应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油1g置于烧杯中，加热至60℃，将0.12g卵磷脂和0.01gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例2、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油2g置于烧杯中，加热至60℃，将0.12g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例3、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油3g置于烧杯中，加热至60℃，将0.12g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例4、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油3g置于烧杯中，加热至60℃，将0.1g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例5、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油2g置于烧杯中，加热至60℃，将0.3g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例6、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油3g置于烧杯中，加热至60℃，将0.2g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例7、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油2g置于烧杯中，加热至60℃，将0.12g卵磷脂、0.02g泊罗沙姆188和0.05gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例8、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油0.5g和中链甘油三酯0.5g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.12g卵磷脂和0.05gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例9、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油1g和中链甘油三酯1g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.12g卵磷脂和0.08gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例10、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油1.5g和中链甘油三酯1.5g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.12g卵磷脂和0.08gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例11、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油0.6g、中链甘油三酯0.6g、鱼油0.3g、橄榄油0.5g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.12g卵磷脂和0.05gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌至完全溶解，得油相。取0.003g油酸钠、0.25g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例12、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油0.3g、中链甘油三酯0.3g、鱼油0.15g、橄榄油0.25g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.12g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌至完全溶解，得油相。取0.003g油酸钠、0.25g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例13、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油0.9g、中链甘油三酯0.9g、鱼油0.45g、橄榄油0.75g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.12g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌至完全溶解，得油相。取0.25g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
实施例14、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳冻干粉针剂的制备
取实施例1制备的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，冷冻干燥(乳糖(5％)作为冻干保护剂。-40℃预冻4h，然后-40℃添加下抽真空干燥24h，温度调节至20℃，保持真空干燥8h)得冻干粉针。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1、本发明α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳多次给药刺激nkt细胞产生ifn-γ
取c57bl/6小鼠15只，分为三组，每组5只，通过尾静脉注射的方式，分别给予每组动物注射实施例3的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳、α-半乳糖基神经酰胺溶液(溶于含有0.05％吐温-20的pbs中)及生理盐水。(计量为2微克每只)每隔2周注射一次，注射三次。分别于每次注射后的24h测定动物血清中ifn-γ。
结果中可以看出，本法所制备的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳即使多次给药后也不会造成nkt的失效。而α-半乳糖基神经酰胺溶液除了第一次给药可以激活nkt产生大量的ifn-γ，多次给药后可造成nkt失效，从而不能有效产生ifn-γ。这些结果也进一步证明将α-半乳糖基神经酰胺制备成脂肪乳的必要性。
试验例2、α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳稳定性的研究
对比组1、α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油7g置于烧杯中，加热至60℃，将0.12g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
对比组2、α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油3g和中链甘油三酯3g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.05g卵磷脂和0.03gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
对比组3、α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油1.8g、中链甘油三酯1.8g、鱼油0.9g、橄榄油1.5g于烧杯中，用搅拌混合均匀，加热至60℃，加入0.06g卵磷脂和0.05gα-半乳糖基神经酰胺，5000r/min高速搅拌至完全溶解，得油相。取0.003g油酸钠、0.25g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
对比组4、α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备
制备10mlα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳：称取大豆油2g置于烧杯中，加热至60℃，将0.005g卵磷脂和0.8gα-半乳糖基神经酰胺加入大豆油中，5000r/min高速搅拌，得油相。0.225g甘油加入注射用水中，加热至60℃溶解，得水相。将水相和油相同时加入搅拌器中，10000r/min搅拌5min，搅拌成初乳，将初乳高压乳匀(800bar，8次)，再用氢氧化钠溶液调节ph值至6.5，分装，115℃热压灭菌30min，即可。
将实施例1～13与对比组1～4制备的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳室温保存，1个月后取出，观察各脂肪乳是否分层或者有沉淀析出。试验结果如表1所示。
表1α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳稳定性的试验结果
试验结果表明：在本发明保护范围以外的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳制备过程中，药物未完全溶解，或放置一段时间后有药物析出，或脂肪乳产生分层，稳定性较差。
综上，本发明所制备的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳不仅解决其水不溶问题，而且稳定性高，可以避免其造成多次给药造成的nkt失效的问题，使糖脂类抗原在免疫治疗中的应用得到提升。
1.一种α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺0.01～20g，注射用油50～500g，乳化剂1～100g，等渗调节剂5～100g，余量为注射用水。
2.根据权利要求1所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺0.1～10g，注射用油100～300g，乳化剂5～50g，等渗调节剂10～80g，余量为注射用水。
3.根据权利要求2所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺1～8g，注射用油100～300g，乳化剂10～15g，等渗调节剂20～30g，余量为注射用水。
4.根据权利要求3所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：每1lα-半乳糖基神经酰胺脂肪乳由以下重量的原料制成：
α-半乳糖基神经酰胺3g，注射用油300g，乳化剂12g，等渗调节剂22.5g，余量为注射用水。
5.根据权利要求1～4任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：所述注射用油为大豆油、中链甘油三酯、花生油、橄榄油、鱼油中的一种或多种；
优选地，所述注射用油为大豆油、中链甘油三酯、橄榄油、鱼油中的一种或多种；
更优选地，所述注射用油为大豆油、大豆油/中链甘油三酯组合物、大豆油/中链甘油三酯/橄榄油/鱼油组合物。
6.根据权利要求5所述的脂肪乳，其特征在于：所述大豆油/中链甘油三酯组合物中大豆油与中链甘油三酯质量比为1：1～3，优选1：1；所述大豆油/中链甘油三酯/橄榄油/鱼油组合物中大豆油、中链甘油三酯、橄榄油和鱼油质量比为3:3:2.5:1.5。
7.根据权利要求1～4任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：所述乳化剂为卵磷脂、氢化磷脂、油酸钠、聚乙二醇十二羟基硬脂酸锂、泊罗沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的一种或多种；
优选地，所述乳化剂为卵磷脂、泊罗沙姆188、油酸钠、α-生育酚琥珀酸聚乙二醇酯中的一种或多种；
更优选地，所述乳化剂为卵磷脂。
8.根据权利要求7所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：所述卵磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂中的一种或多种。
9.根据权利要求1～4任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：所述等渗调节剂为葡萄糖、氯化钠、甘油、木糖醇中的一种或多种；
优选地，所述等渗调节剂为葡萄糖、甘油中的一种或多种；
更优选地，所述等渗调节剂为甘油。
10.根据权利要求1～4任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：所述脂肪乳的ph值为4～9；优选地，ph为5～7；更优选地，ph为6.5。
11.根据权利要求10所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳，其特征在于：所述脂肪乳的ph值调节剂为氢氧化钠溶液。
12.一种权利要求1～11任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)按权利要求1所述配比称取原料；
(2)取注射用油，混匀，加热至60-80℃，再加入α-半乳糖基神经酰胺和乳化剂，5000-6000r/min搅拌，得油相；取注射用水，加等渗调节剂，加热至60-80℃溶解，得水相；
(3)将步骤(2)油相加入水相中，10000-12000r/min搅拌5～10min，再800～1000bar均质8～10次，最后调ph值，灌封，灭菌，即得。
13.一种α-半乳糖基神经酰胺冻干粉针剂，其特征在于：它是由权利要求1～11任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳冷冻干燥制备而成。
14.权利要求1～11任一项所述的α-半乳糖基神经酰胺脂肪乳或权利要求13所述的α-半乳糖基神经酰胺冻干粉针剂在制备预防和/或治疗恶性肿瘤、病毒感染、调节免疫功能的药物中的用途。
技术总结