本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及疫苗技术领域；具体涉及一种利用不饱和脂肪酸建立的包含抗原肽、免疫佐剂和小分子药物的多组分无载体一体化纳米疫苗。
背景技术：
随着人口老龄化等因素的加剧，我国癌症的发病率和死亡率持续上升，癌症已成为我国人群死亡主要原因，严重危害国人健康。近年来，抗肿瘤免疫疗法发展迅猛，尤其是免疫检查点抑制剂疗法(例如：pd-1抑制剂和ctla-4抑制剂)在临床上取得了显著的疗效。免疫检查点抑制剂疗法的主要原理是通过抗体或小分子化合物阻断肿瘤细胞和效应t细胞(ctl)之间形成的免疫抑制性复合物(例如pd-1/pd-l1，ctla-4/b7复合物)，进而解除ctl内的免疫抑制信号，重新启动ctl对肿瘤细胞的攻击。
然而，免疫检查点抑制剂疗法也具有一定的局限性。首先，药物响应性在不同肿瘤种类间差异大。造成此差异的主要原因之一是由于突变负荷低的肿瘤会产生较少的肿瘤特异性抗原(tsa)，进而弱化了肿瘤细胞自发被免疫细胞识别的效率，阻碍了免疫检查点抑制剂疗法的广泛应用，同时也提示我们需要配合更好的肿瘤特异性抗原呈递方法以辅助免疫检查点抑制剂疗法。其次，在一些患者体内，免疫检查点抑制剂疗法的副作用(免疫相关性毒副反应)较为明显，包括皮肤瘙痒、皮疹、白癫风、腹泻、甚至肝损伤和心脏衰竭，这主要是免疫细胞对非肿瘤细胞的非特异性地攻击造成的。所以，在抗肿瘤免疫治疗过程中，高活性的、具有肿瘤靶向性的ctl的数量是提高抗肿瘤疗效、降低副作用的关键。
ctl的活化主要依赖于抗原呈递细胞(antigenpresentingcell,apc)，特别是具有交叉呈递作用的树突状细胞(dendriticcell，dc)，它可将内吞得到的tsa通过mhci呈递于细胞表面(交叉呈递)，特异性地激活ctl进行肿瘤杀伤。而且，dc在提呈抗原肽-mhc分子复合物的同时，能高表达协同刺激分子(costimulatingfactor)，直接提供双信号激活初始cd8 t细胞，使之表达分泌il-2，促进自身增殖并分化为ctl。
然而，dc细胞对于游离肽段的摄取率不高，且游离肽段的体内循环周期短，极大限制了抗肿瘤疫苗的效果。为解决此问题，抗肿瘤疫苗常伴随免疫佐剂(例如cpg-odn、montanide、r848)使用，以进一步刺激dc和ctl细胞，但免疫佐剂也会导致一些的副作用，例如注射部位的肌肉萎缩、流感样反应、头痛。因此，免疫佐剂给药方式的优化和创新也是抗肿瘤免疫领域的一个研究热点和难点。目前的免疫佐剂纳米药物主要是纳米载体包裹佐剂单药的形式，没有和肿瘤特异性抗原肽形成连接，不能保证同一个dc可以同时接受免疫佐剂和肿瘤特异性抗原肽，这会降低佐剂/肿瘤特异性抗原肽联用疗法的疗效，同时增加了免疫相关性毒副反应。为解决上述问题，本发明由此而来。
技术实现要素：
本发明的目的在于改善现有技术中抗肿瘤疫苗免疫佐剂降低佐剂/肿瘤特异性抗原肽疗效及存在的副作用，提供一种利用不饱和脂肪酸对抗原肽和免疫佐剂进行化学修饰，利用无载体自组装技术将抗原肽、免疫佐剂和疏水的小分子药物装载于同一纳米颗粒的肿瘤疫苗，提高肿瘤抗原多肽疫苗的免疫效果。
为了达到上述目的，本发明通过如下技术方案实现：一种纳米疫苗，其包括：抗原，免疫佐剂和不饱和脂肪酸，其特征在于，所述抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过共价键偶联同种类或不同种类不饱和脂肪酸。
优选地，抗原选自不含半胱氨酸cys的肽、蛋白、糖蛋白、糖肽、蛋白聚糖或其组合的形式。
优选地，不含半胱氨酸cys的抗原n端添加有cys-(b)序列或cys-(a)-(b)序列，其中，(a)为亲水性基团，(b)为组织蛋白酶的酶切位点基团。这个(a)序列是用来平衡整个抗原肽的亲水性的，如果后面的抗原肽亲水性差，就需要增加(a)亲水性基团，如果抗原肽本身亲水性好，就可以只有一个氨基酸甚至没有。
优选地，所述(a)为不含半胱氨酸cys的肽段，包括但不限于单个氨基酸，二肽或多肽；更优选地，所述(a)选自-ser-基团、-gly-基团、二肽–ser-ser-或-ser-gly-。
所述b为选自组织蛋白酶a--z中任一种的酶切位点的氨基酸序列，所述组织蛋白酶a–z为现有技术已知的从a、b、c、d、e、f……x、y、z的组织蛋白酶。更优选地，(b)为选自组织蛋白酶b、f、h、k、l、s、v、b、c、h、x中任一种酶切位点氨基酸序列。本发明的一具体技术方案中，(b)为组织蛋白酶s的酶切位点，即–val-val-arg-三肽，vvr有利于纳米颗粒被dc细胞内吞后，在溶酶体内的组织蛋白酶s的作用下断裂释放出模式抗原。
优选地，所述免疫佐剂选自含有-oh的佐剂，更优选地，选自可激活dc细胞抗原呈递能力的化合物，包括但不限于：tlr信号通路激动剂，sting信号通路激动剂，且分子结构内部包含-oh基团的化合物；更优选地，免疫佐剂包括但不限于r848、cpg、咪喹莫特(imiquimod)中的一种或多种。
本发明的一具体技术方案中，所述抗原在n端修饰cys-(b)序列或cys-(a)-(b)序列后通过半胱氨酸cys残基的-sh共价偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过s-s键偶联不饱和脂肪酸同种类或不同种类不饱和脂肪酸。更优选地，所述免疫佐剂的-oh通过s-s键偶联不饱和脂肪酸。
优选地，所述不饱和脂肪酸选自：单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪，所述单不饱和脂肪酸选自油酸、芥酸、棕榈油酸、反式油酸中的一种或多种；多不饱和脂肪，选自亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸dha中的一种或多种。
优选地，所述纳米肿瘤疫苗还含有疏水性强的小分子药物。所述疏水性强的小分子药物选自调节dc细胞内信号通路的小分子药物中的一种或多种；包括但不限于：stat3抑制剂stattic、artesunate青蒿琥酯、c188-9。
在一些具体实施方式中，抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸i，免疫佐剂通过共价键偶联同种类不饱和脂肪酸i。在一些具体实施方式中，抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸i，免疫佐剂通过共价键偶联同种类不饱和脂肪酸ii。
在一些具体实施方式中，抗原是当所述抗原为含有半胱氨酸cys的抗原肽序列，应选择更换抗原肽序列，使其不含有cys。
本发明还提供上述纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备抗原，
(2)将n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与不饱和脂肪酸通过缩合反应得到中间产物i，再将中间产物i和所述抗原通过迈克尔加成反应得到抗原共价偶联不饱和脂肪酸：
(3)将2,2’-二硫二乙醇与不饱和脂肪酸通过酯化反应得到中间产物ii，-不饱和脂肪酸-s-s-oh，将-不饱和脂肪酸-s-s-oh与对硝基氯甲酸苯酯反应得到中间产物iii，中间产物iii与免疫佐剂的通过酯交换反应得到终产物：免疫佐剂共价键偶联不饱和脂肪酸；
(4)将步骤(2)得到的偶联不饱和脂肪酸的抗原、步骤(3)得到的偶联不饱和脂肪酸的免疫佐剂共同溶于一有机溶剂，充分混匀；
(5)将步骤(4)得到的混合物进行超声处理，再将其逐滴加入注射用超纯水，获得自组装纳米疫苗。
优选地，抗原为不含半胱氨酸cys的肽、蛋白、糖蛋白、糖肽、蛋白聚糖或其组合的形式。
优选地，不含半胱氨酸cys的抗原n端添加有cys-(b)序列或cys-(a)-(b)序列，其中，(a)为亲水性基团，(b)为组织蛋白酶的酶切位点基团。
优选地，步骤(2)不饱和脂肪酸和步骤(3)中的不饱和脂肪酸，为相同种类或不同种类。
优选地，步骤(4)中，在所述有机溶剂中，还加入疏水性强的小分子药物。步骤(4)中，有机溶剂中选自dmso、乙醇、丙酮。
在一些具体实施方式中，步骤(5)中注射用超纯水的体积是混合物的至少9倍以上。
在一些具体实施方式中，疏水性强的小分子药物，是指难溶于水，溶解度小于0.01g/100g溶剂，可溶于有机溶剂(大于1g/100g溶剂)的小分子。
在一些具体实施方式中，抗原是b细胞抗原或t细胞抗原。在一些具体实施方式中，b细胞抗原是弱免疫原性的抗原。在一些具体实施方式中，b细胞抗原是小分子。在一些具体实施方式中，b细胞抗原是碳水化合物。在一些具体实施方式中，b细胞抗原是令人上瘾的物质。在一些具体实施方式中，b细胞抗原是毒素。在一些具体实施方式中，t细胞抗原是退行性疾病抗原、传染性疾病抗原、癌症抗原、变态反应性疾病抗原、自身免疫疾病抗原、同种抗原、异种抗原、变应原、令人上瘾的物质或代谢性疾病酶或酶产物。在一些具体实施方式中，t细胞抗原是普遍的t细胞抗原。
在一些具体实施方式中，纳米疫苗通过自组装形成。自组装是指使用那些能够自身适应以可以预见的方式可以预见地且可以重复地形成纳米疫苗和/或疫苗载体的成分形成纳米疫苗和/或载体的过程。在一些具体实施方式中，通过使用极性或两性生物材料(其自身彼此设定为形成尺寸、成分和成分位置可预见的纳米材料)形成纳米疫苗。根据本发明，极性生物材料上可以结合免疫调节试剂、免疫刺激试剂和/或靶试剂，从而当纳米疫苗自组装时，在纳米疫苗上/在纳米疫苗内存在可以重复的试剂的定位和密度式样。
在一些具体实施方式中，抗原共价偶联不饱和脂肪酸、免疫佐剂共价偶联不饱和脂肪酸和疏水小分子药物在有机溶剂中溶解，然后在纯水中超声混匀，最后自组装成纳米疫苗；三者的摩尔比约为1～1.2：1～1.2：0.7～1.5。在一些具体实施方式中，抗原共价偶联不饱和脂肪酸、免疫佐剂共价偶联不饱和脂肪酸和疏水小分子药物三者的摩尔比约为1：1：1。
在一些具体实施方式中，纳米疫苗是微米颗粒、纳米颗粒或皮可米颗粒。在一些具体实施方式中，微米颗粒、纳米颗粒或皮可米颗粒是自组装的。
在一些具体实施方式中，本文提供的组合物的纳米疫苗具有500nm以下的平均几何直径。在一些具体实施方式中，纳米疫苗具有50nm以上但500nm以下的平均几何直径。在一些具体实施方式中，纳米疫苗群体的平均几何直径为约75nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、225nm、250nm、275nm、300nm、325nm、350nm、375nm、400nm、425nm、450nm或475nm。在一些具体实施方式中，平均几何直径为100-400nm、100-300nm、100-250nm或100-200nm。在一些具体实施方式中，平均几何直径为60-400nm、60-350nm、60-300nm、60-250nm或60-200nm。在一些具体实施方式中，平均几何直径为75-250nm。在一些具体实施方式中，纳米疫苗的群体中30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的纳米疫苗具有500nm以下的直径。在一些具体实施方式中，纳米疫苗的群体中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的纳米疫苗具有100nm以上但250nm以下的直径。
研究表明，dc细胞对20-200nm尺度的纳米颗粒有较高的吞噬能力，纳米技术有助于提高抗肿瘤疫苗的效果。本发明通过对抗原肽和免疫激活佐剂(以r848为例)进行化学修饰，共价偶联对人体安全的不饱和脂肪酸(以dha为例)，利用不饱和脂肪酸在水溶液中自发形成疏水核心的特性，形成纳米颗粒的中心结构，同时包裹疏水性极强的小分子抑制剂(以stat3抑制剂stattic为例)，就可以制备同时包含抗原肽-免疫激活佐剂-小分子抑制剂的无载体自组装纳米颗粒。该纳米疫苗也含有组织蛋白酶s(可以不限于s型)剪切模块和谷胱甘肽(glutathion，gsh)反应模块，以保证纳米颗粒在进入dc的溶酶体后，可以在组织蛋白酶、酯酶和gsh的三重作用下，释放出游离的抗原肽、免疫佐剂和小分子药物，最终达到增强抗肿瘤免疫效果的目的。
本发明纳米疫苗可以显著提高抗原肽在淋巴结内的驻留时间，提高dc细胞对抗原肽的内吞，纳米粒被内吞后，在细胞内组织蛋白酶s和细胞内高浓度的gsh的作用下，释放出抗原肽、免疫佐剂和小分子药物，提高免疫反应。
附图说明
图1为本发明纳米疫苗的一实施例模型。
图2为动态光散射法测定纳米疫苗颗粒的粒径。
图3为zeta电位仪测得纳米疫苗粒的表面电位图。
图4为透射电镜检测纳米疫苗颗粒表面形貌图。
图5为荧光修饰后的纳米疫苗注射小鼠后的淋巴结荧光成像检测对比图。
图6为流式细胞仪分析fitc阳性的细胞占cd11c阳性的dc细胞的比例。
图7a为小鼠黑色素瘤原位肿瘤模生理检测对照图(cd8 t细胞免疫组化结果图)，7b为小鼠黑色素瘤原位肿瘤模型各组肿瘤体积统计图；7c为小鼠外周血内cd69 的细胞占cd8 t细胞的比例，该指标可反映cd8 t细胞的激活程度。
图8a为小鼠黑色素瘤肺转移模型对照和试验组的观测测量对比图；8b为小鼠黑色素瘤肺转移模型对照和试验组的观测测量统计分析图。
图9a为纳米疫苗与pd-1抗体的联用抗黑色素瘤实验肿瘤体积统计图；9b为为纳米疫苗与pd-1抗体的联用抗黑色素瘤实验小鼠存活率统计图。
具体实施方式
为进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明优选方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
一种纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
一.多肽-马来酰亚胺-二十二碳六烯酸/peptide-mal-dha的合成
1.1准备抗原肽备用，抗原的n端连接-cys-(a)-(b)序列，(a)为亲水性基团，(b)为组织蛋白酶的酶切位点基团；
1.2n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与二十二碳六烯酸通过缩合反应得到中间产物i；
2,2’-二硫二乙醇和二十二碳六烯酸溶于二氯甲烷，在缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，碱为n,n-二异丙基乙胺的条件下43℃反应24小时，旋干溶剂，分液萃取后过硅胶柱，得到中间产物i(dha-mal)；
1.3中间产物i与多肽通过迈克尔加成反应得到终产物peptide-mal-dha：
中间产物i和多肽(含有巯基)溶于二甲基亚砜，在室温下搅拌，通过高效液相检测反应进程，反应结束后冻干至固体粉末，得到终产物peptide-mal-dha。
二.雷西莫特-二硫键-二十二碳六烯酸/r848-ss-dha的合成
2.12,2’-二硫二乙醇与二十二碳六烯酸通过酯化反应得到中间产物ii：
2,2’-二硫二乙醇和二十二碳六烯酸溶于二氯甲烷，在缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，碱为4-二甲氨基吡啶的条件下43℃反应24小时，旋干溶剂，分液萃取后过硅胶柱，得到中间产物ii(dha-ss-oh)；
2.2中间产物ii与对硝基氯甲酸苯酯反应得到中间产物iii：
中间产物ii和对硝基氯甲酸苯酯溶于二氯甲烷，n,n-二异丙基乙胺作碱，在室温下反应8小时，旋干溶剂，分液萃取后过硅胶柱，得到中间产物iii；
2.3中间产物iii与雷西莫特r848反应通过酯交换反应得到终产物r848-ss-dha：
中间产物iii和雷西莫特r848溶于二氯甲烷，n,n-二异丙基乙胺作碱，在43℃下反应24小时，旋干溶剂，分液萃取后过硅胶柱，得到终产物r848-ss-dha。
三.纳米粒组装：
在有机溶剂dmso(也可以用乙醇、丙酮等)中溶解peptide-mal-dha、r848-dha和疏水小分子药物stattic，三者摩尔比约为1：1：1。将900ul注射用超纯水置于超声清洗仪中，在进行超声的同时缓慢滴加上述混合溶液至纯水中。充分混合后，即得到无载体自组装纳米疫苗，如图1所示的模式图。
实施例2纳米疫苗的制备方法
(a)在模式抗原卵清蛋白(ovalbumin，ova，氨基酸序列为siinfekl)257-264序列前端添加linker序列cssvvr，由浙江昂拓莱司生物技术有限公司合成；
将n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与亚麻酸通过缩合反应得到中间产物i，再将中间产物i和所述抗原通过迈克尔加成反应得到ova共价偶联亚麻酸：其中c上的半胱氨酸用于连接疏水性强的dha，使修饰后的肽段呈现一端疏水一端亲水的形式，利于自组装纳米粒的形成；vvr序列为组织蛋白酶s的剪切位点，当纳米疫苗颗粒被dc细胞内吞后，在溶酶体内的组织蛋白酶s的作用下断裂释放出模式抗原ova。
(b)在免疫佐剂r848的活性羟基上通过s-s键偶联亚麻酸，这有利于r848-dha和ova-cssvvr-亚麻酸形成以亚麻酸为疏水核心的自组装纳米颗粒，s-s键在进入细胞后，在细胞内高浓度gsh的作用下会发生断裂，释放出活性药物。
将2,2’-二硫二乙醇与不饱和脂肪酸通过酯化反应得到中间产物ii，-亚麻酸-s-s-oh，将-亚麻酸-s-s-oh与对硝基氯甲酸苯酯反应得到中间产物iii，中间产物iii与免疫佐剂的通过酯交换反应得到终产物：r848共价键偶联亚麻酸；
(c)纳米粒组装：在100μldmso(也可以用乙醇、丙酮等有机溶剂)中溶解200nm的ova-cssvvr-dha、200nm的r848-dha和200nm的疏水小分子药物stattic。将900ul注射用超纯水置于超声清洗仪中，在进行超声的同时缓慢滴加上述混合溶液至纯水中。充分混合后，即得到1ml无载体自组装ova纳米疫苗。
纳米粒表征：
用动态光散射法测得纳米疫苗颗粒的粒径为105.5±1.758nm，如图2所示。
zeta电位仪测得纳米疫苗粒的表面电位为40.83±1.528mv，如图3所示。
透射电镜观察纳米疫苗颗粒表面形貌，如图4所示。
动物实验：
(1)纳米疫苗可以延长抗原肽在淋巴结内的驻留时间：在cssvvr-ova序列中的k氨基酸残基侧链修饰荧光素fitc，并按照前述步骤进行dha修饰和纳米疫苗组装。在小鼠尾基部皮下注射按前述方法制备的纳米疫苗(100μl/只)，每组12只。在注射后4h、24h、48h每组处死4只小鼠，取出腹股沟回流淋巴结，用小动物成像仪进行荧光成像，如图5所示；实验结果表明：相较与等剂量的游离药物组分，通过dha修饰和纳米组装的纳米疫苗可以更大量、更长时间地驻留在回流淋巴结，这有利于启动更强的抗肿瘤免疫反应。
(2)纳米疫苗可以提高dc细胞对抗原肽的内吞效率：在cssvvr-ova序列种的k氨基酸残基侧链修饰荧光素fitc，并按照前述步骤进行dha修饰和纳米疫苗组装。在小鼠尾基部皮下注射按前述方法制备的纳米疫苗(100μl/只)，每组3只。在注射后小鼠，取出腹股沟回流淋巴结，用pe荧光标记的cd11c抗体标记dc细胞，采用流式细胞仪分析fitc阳性的细胞占cd11c阳性的dc细胞的比例，如图6所示。
(3)黑色素瘤原位肿瘤模型：在6周龄雄性spf级的c57b/6小鼠右上肢腋下接种10^5个表达ova抗原的b16/f10-ova黑色素瘤细胞(第0天)，每组5只。在第4、11、18天分别在小鼠尾部基部皮下注射按前述方法制备的纳米疫苗(100μl/只)。每隔两天用游标卡尺记录肿瘤大小，结果如图7a，7b，7c所示。实验结果表明纳米疫苗的抑制原位肿瘤生长的效果优于未进行纳米组装的游离组分，纳米疫苗能显著提高肿瘤内部的cd8 t细胞的数量，并提高外周血内t细胞的活化程度(以cd69阳性为标准)。
(4)黑色素瘤肺转移模型：在6周龄雄性spf级c57b/6小鼠，在第1、8、15天在小鼠尾部基部皮下注射按前述方法制备的纳米疫苗(100μl/只)，每组8只。在第20天通过小鼠尾静脉注射10^5个表达ova抗原的b16/f10-ova黑色素瘤细胞。在第40天处死小鼠，取出肺，观察计数小鼠肺部表面的黑色病灶数量。结果如图8a，8b所示，实验结果表明纳米疫苗可以有效减少黑色素瘤细胞通过血液循环转移至肺部。
(5)纳米疫苗与pd-1抗体的联用抗肿瘤实验：在6周龄雄性spf级的c57b/6小鼠右上肢腋下接种2*10^5个表达ova抗原的b16/f10-ova黑色素瘤细胞(第0天)，在第4、11、18天分别在小鼠尾部基部皮下注射按前述方法制备的纳米疫苗(100μl/只)。在第6、9、13、16、20、23天通过小鼠尾静脉注射100μg/只抗小鼠pd-1抗体。每隔两天用游标卡尺记录肿瘤大小。结果如图9a，9b所示，实验结果表明纳米疫苗和抗pd-1抗体均表现出显著的抗肿瘤效果，两者的联用可产生更强的抗肿瘤效果，抑制肿瘤生长并延长小鼠的荷瘤生存时间。
本发明利用不饱和脂肪酸修饰肿瘤靶向的抗原肽和免疫佐剂，在水溶液中以不饱和脂肪酸为疏水核心发生自组装，疏水核心内亦可装载疏水性强的小分子药物。该纳米疫苗可以提高抗原肽在淋巴结内的驻留时间，增加dc细胞对抗原肽的内吞，提高抗肿瘤免疫效果。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
1.一种纳米疫苗，其包括：抗原，免疫佐剂和不饱和脂肪酸，其特征在于，所述抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过共价键偶联同种类或不同种类不饱和脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，抗原为不含半胱氨酸cys的肽、蛋白、糖蛋白、糖肽、蛋白聚糖或其组合的形式。
3.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，不含半胱氨酸cys的抗原n端添加有cys-(b)序列或cys-(a)-(b)序列，其中，(a)为亲水性基团，(b)为组织蛋白酶的酶切位点基团。
4.根据权利要求3所述的纳米疫苗，其特征在于，所述(a)为不含半胱氨酸cys的肽段，所述(a)选自-ser-基团、-gly-基团、二肽–ser-ser-或-ser-gly-。
5.根据权利要求3所述的纳米疫苗，其特征在于，所述(b)为选自组织蛋白酶a--z中任一种的酶切位点氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述抗原在n端修饰cys-(b)序列或cys-(a)-(b)序列后通过半胱氨酸cys残基的-sh共价偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过s-s键偶联不饱和脂肪酸同种类或不同种类不饱和脂肪酸。
7.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂选自含有-oh的可激活dc细胞抗原呈递能力的化合物，优选地，所述免疫佐剂选自tlr信号通路激动剂，sting信号通路激动剂，且分子结构内部包含-oh基团的化合物中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，免疫佐剂选自r848、cpg、咪喹莫特中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述不饱和脂肪酸选自：单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪，所述单不饱和脂肪酸选自油酸、芥酸、棕榈油酸、反式油酸中的一种或多种；多不饱和脂肪，选自亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸dha中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述纳米疫苗还含有疏水性强的小分子药物；优选地，所述疏水性强的小分子药物选自stat3抑制剂stattic、artesunate青蒿琥酯、c188-9。
技术总结